胡文龍，梁惠芳，李 明

(暨南大學(xué)附屬順德醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 佛山 528000)

肺癌作為我國(guó)最常見(jiàn)的腫瘤之一，在男性腫瘤中的發(fā)病率和致死率均居首位[1]。肺癌的主要類型是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其所占比例為85%～90%，而肺鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱肺鱗癌)是NSCLC第二常見(jiàn)病理亞型[2]。由于肺鱗癌缺乏早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，且易發(fā)生局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，肺鱗癌患者中多數(shù)人5年生存率低于15%[3]。因此，通過(guò)肺鱗癌預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)肺鱗癌患者的預(yù)后情況進(jìn)行早期評(píng)估，對(duì)于肺鱗癌患者的預(yù)后及治療尤為重要。

鐵死亡是程序性細(xì)胞死亡的形式之一，其主要特點(diǎn)是發(fā)生在線粒體內(nèi)的鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷誘導(dǎo)了細(xì)胞的死亡[4]。鐵死亡與阿爾茲海默病、急性腎損傷、心肌缺血再灌注損傷、腫瘤的增殖和凋亡等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。肺癌組織中普遍存在著更高的活性氧和脂質(zhì)氧化標(biāo)志物水平，這提示肺癌細(xì)胞中可能存在鐵死亡。CHEN等[6]研究表明，毛蘭素可以誘導(dǎo)肺鱗癌細(xì)胞鐵死亡，并伴隨ROS聚集、脂質(zhì)過(guò)氧化和谷胱甘肽耗竭，抑制腫瘤細(xì)胞遷移從而達(dá)到抗癌的目的。此外，JIANG等[7]研究也表明，誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡也是p53抑制肺癌生長(zhǎng)的重要途徑，但鐵死亡的調(diào)控是由多個(gè)氧化應(yīng)激途徑和代謝途徑共同作用，因此鐵死亡相關(guān)基因在肺癌發(fā)生中起到重要作用。為探索可靠的鐵死亡相關(guān)基因?qū)τ诜西[癌預(yù)后評(píng)估的意義，本研究擬通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中肺鱗癌的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，篩查出差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因，并加以分析構(gòu)建臨床預(yù)后模型，為肺鱗癌患者提供個(gè)體化治療和預(yù)后評(píng)估方面的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2020年9月從TCGA官方網(wǎng)站下載(https://gdc-portal.nci.nih.gov/)肺鱗癌患者腫瘤組織和癌旁組織的mRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床資料。使用R軟件中的Limma包對(duì)測(cè)序的基因表達(dá)譜做歸一化。下載的數(shù)據(jù)內(nèi)容有肺鱗癌患者的兩類mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，包括502例腫瘤組織和49例癌旁組織。臨床數(shù)據(jù)包含了502例肺鱗癌患者ID號(hào)、年齡、性別、病理分期、生存時(shí)間、生存狀態(tài)等臨床信息，為了減少統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，剔除生存時(shí)間少于30 d的患者信息，最終納入482例肺鱗癌患者。TCGA數(shù)據(jù)都是公開(kāi)的，因此本研究免除了地方倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1代謝相關(guān)基因提取和處理 下載并閱讀PubMed、EMBASE、Web of Science、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)知網(wǎng)，維普數(shù)據(jù)等數(shù)據(jù)庫(kù)中的鐵死亡相關(guān)文獻(xiàn)[8-12]，選取整理好的60個(gè)鐵死亡相關(guān)基因作為研究對(duì)象。使用R軟件中的“Limma”包篩選肺鱗癌組織和癌旁組織的差異鐵死亡相關(guān)基因，以偽發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05為閾值；采用單因素Cox回歸篩選與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)基因，上述2個(gè)條件篩選的基因取交集，并繪制熱圖。

1.2.2LASSO回歸分析為了避免單因素Cox回歸分析所得的基因有過(guò)度擬合，通過(guò)R軟件“glmet”包進(jìn)行LASSO回歸再次篩選基因。本研究使用10折交叉驗(yàn)證來(lái)確定λ的值，并且選擇偏似然偏差最小的λ作為最優(yōu)λ。一旦確定了預(yù)測(cè)基因，筆者應(yīng)用它們構(gòu)建基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后模型，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分表達(dá)式如下所示。

其中N是基因數(shù)，Expi是基因的表達(dá)水平，Ci是lasso回歸分析得到的回歸相關(guān)系數(shù)。根據(jù)預(yù)后模型可以計(jì)算出每一個(gè)肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分大小，通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)值，模型將納入的肺鱗癌患者劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。基于預(yù)后模型中基因的表達(dá)情況，采用R軟件中的“stats”包對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行主成分分析和不同組別的分布情況分析(t-SNE)。

1.2.3預(yù)后模型評(píng)價(jià)和K-M生存分析 采用R軟件中的“survival”包并利用K-M生存分析對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行評(píng)價(jià)；其次，通過(guò) “timeROC”包對(duì)3年及5年總生存率的ROC曲線下面積(AUC)值進(jìn)行計(jì)算，對(duì)預(yù)后模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。除此之外，本研究結(jié)合年齡、性別、病理分期等臨床信息，采用多因素Cox回歸對(duì)預(yù)后模型進(jìn)行分析，以驗(yàn)證構(gòu)建的模型的預(yù)測(cè)能力是否獨(dú)立于其他臨床因素，可以成為獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。

1.2.4功能富集及免疫功能狀態(tài)分析 繼續(xù)利用R軟件“cluster profiler”和“Limma”包對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異基因(log2FC的絕對(duì)值大于1，F(xiàn)DR<0.05)進(jìn)行基因本體論(GO)和京都基因百科全書(shū)(KEGG)分析。運(yùn)用“ssGSEA”包對(duì)兩組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分?jǐn)?shù)和免疫相關(guān)功能的活性進(jìn)行定量計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1納入患者的基本情況 最終符合納入標(biāo)準(zhǔn)的肺鱗癌患者482例，其中男性患者死亡235例(71.43%)，未死亡112例(73.20%)；女性患者死亡94例(28.57%)，未死亡41例(26.80%)；肺鱗癌死亡患者平均年齡(68.7±6.9)歲,未死亡患者平均年齡(65.4±8.5)歲，表1中包含患者種族、吸煙、化療、放療、生存時(shí)間等情況。見(jiàn)表1。

表1 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中納入分析的肺鱗狀細(xì)胞癌患者的基本特征(n=482)

2.2腫瘤組織和正常肺組織中差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因 對(duì)482例肺鱗癌患者腫瘤組織和49例癌旁正常肺組織的鐵死亡相關(guān)基因進(jìn)行Wilcoxon非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，經(jīng)分析滿足條件FDR<0.05的基因共有52個(gè)。大部分的鐵死亡相關(guān)基因在兩組間都有差異表達(dá)(86.67%,52/60)。

2.3與肺鱗癌預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵鐵死亡相關(guān)基因的確定 單因素Cox回歸分析顯示5個(gè)基因與總體生存時(shí)間有關(guān)，圖1A。上述條件取交集的基因也是5個(gè)，圖1B，他們分別是ALOX5,TFRC,PHKG2,FADS2,NOX1，基因表達(dá)量的熱圖見(jiàn)圖1C。通過(guò)LASSO回歸分析進(jìn)一步確定了這5個(gè)鐵死亡相關(guān)基因均是關(guān)鍵基因。見(jiàn)圖2A、2B及表2。

表2 5個(gè)關(guān)鍵基因的詳細(xì)信息

A為與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因；B為差異的鐵死亡基因和預(yù)后相關(guān)的鐵死亡基因的交集；C為5個(gè)鐵死亡基因表達(dá)量的熱圖；C中1代表癌旁組織，2代表肺鱗癌組織。

A代表LASSO回歸系數(shù)分布的剖面圖，B代表采用10倍交叉驗(yàn)證選擇最優(yōu)的λ值。

2.4肺鱗癌預(yù)后模型的構(gòu)建和評(píng)價(jià) 基于LASSO回歸分析確定的預(yù)后模型將所有患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組兩組，主成分分析和t-SNE分析表明，不同風(fēng)險(xiǎn)程度的兩組患者分布在兩個(gè)方向，見(jiàn)圖3。用K-M生存分析評(píng)估該模型的預(yù)測(cè)能，結(jié)果表明高風(fēng)險(xiǎn)組的中位生存期為1.65年，而3、5年生存概率分別為47%和37%；低風(fēng)險(xiǎn)組的中位生存期為2.26年，3、5年的生存概率分別為69%和55%，低風(fēng)險(xiǎn)組總體生存期比高風(fēng)險(xiǎn)組長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4A；3年總生存率的ROC曲線下面積AUC=0.635,5年總生存率的ROC曲線下面積AUC=0.619，見(jiàn)圖4B。同時(shí)，所有患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存時(shí)間的關(guān)系也提示高風(fēng)險(xiǎn)組的患者可能更早死亡，見(jiàn)圖5A、5B。以總生存時(shí)間為因變量，預(yù)后模型所計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、性別、病理分期等臨床指標(biāo)作為協(xié)變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析，其結(jié)果表明該預(yù)后模型可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)預(yù)后的因子[風(fēng)險(xiǎn)比(HR)=2.893,95%置信區(qū)間=1.687～3.379,P<0.05]，見(jiàn)圖6。

A為主成分分析，B為t-SNE分析。

A為肺鱗癌患者的生存曲線，藍(lán)色代表低風(fēng)險(xiǎn)人群，紅色代表高風(fēng)險(xiǎn)人群；B為預(yù)后模型的ROC曲線。

A為肺鱗癌中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的分布情況；B為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與生存時(shí)間的關(guān)系，黑色虛線是把患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的最佳分界線。

圖6 多因素Cox回歸分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與預(yù)后關(guān)系的森林圖

2.5功能富集分析 為了闡明和預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)的生物學(xué)功能和通路，利用高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異基因進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)離子通道活性和離子門控通道活性等幾個(gè)和鐵相關(guān)的分子功能在兩組的差異基因中均有富集，見(jiàn)表3。但值得注意的是，高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組的差異基因也顯著存在于許多與免疫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中，如細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用，細(xì)胞外基質(zhì)受體途徑(P<0.05)。

2.6免疫功能狀態(tài)分析 在所納入的患者中，巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞，中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間有顯著差異(P<0.05)。其次，除了抗原呈遞細(xì)胞的抑制功能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，其余免疫功能在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 高、低風(fēng)險(xiǎn)人群與免疫細(xì)胞及免疫功能的關(guān)系

表3 GO富集和KEGG通路分析

續(xù)表3 GO富集和KEGG通路分析

A為免疫細(xì)胞亞群圖，B為免疫相關(guān)功能圖，NS代表差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

鐵死亡是否可以像凋亡和自噬等程序性死亡一樣，參與機(jī)體的發(fā)育和正常生理過(guò)程，目前仍在積極研究中，但是關(guān)于鐵死亡在腫瘤中的潛在作用已經(jīng)有很多報(bào)道[13-14]。大多數(shù)腫瘤處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，以致腫瘤細(xì)胞也需要通過(guò)增加ROS的清除能力，以防止氧化損傷，因此多數(shù)腫瘤(如肝細(xì)胞癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌等)細(xì)胞比較易受鐵死亡的影響[15]。肺部組織相比與其他組織處于高氧濃度的環(huán)境中，這種特殊的環(huán)境造就了肺部腫瘤需要承受很大的氧化壓力。為了應(yīng)對(duì)氧化壓力，肺癌細(xì)胞系的System xc-上調(diào)水平在癌癥細(xì)胞中的相對(duì)較高以抵抗鐵死亡[16]。此外，鐵死亡相關(guān)基因半胱氨酸脫硫酶(NFS-1)在肺癌細(xì)胞中表達(dá)較高，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NFS-1明顯緩解了高氧誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)NSF-1敲除后細(xì)胞成瘤時(shí)間明顯延長(zhǎng)[17]。這表明鐵死亡相關(guān)基因調(diào)控的鐵死亡在肺癌的增殖和凋亡中發(fā)揮著重要作用。鑒于此，作者有理由推測(cè)鐵死亡相關(guān)基因在預(yù)測(cè)預(yù)后方面可能也發(fā)揮一定作用，為臨床鑒定理想的預(yù)后標(biāo)志物提供參考。

本研究通過(guò)文獻(xiàn)查閱及生物信息技術(shù)，系統(tǒng)地分析了60個(gè)鐵死亡相關(guān)基因在肺鱗癌組織中的表達(dá)及其與總體生存期的關(guān)系，首次構(gòu)建了一個(gè)基于5個(gè)鐵死亡相關(guān)基因的預(yù)后模型，該模型將482例肺鱗癌患者分為了高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組，兩組患者差異基因主要富集于免疫相關(guān)通路中。 雖然以往研究表明，部分鐵死亡基因可能調(diào)節(jié)藥物誘導(dǎo)的肺鱗癌中的鐵死亡現(xiàn)象[17]，但是這些基因的表達(dá)與肺鱗癌患者的總體生存期相關(guān)性仍然需要進(jìn)一步研究。但值得注意的是，大多數(shù)鐵死亡相關(guān)基因(86.67%)在肺鱗癌組織和癌旁組織中都有差異表達(dá)，單因素Cox回歸分析顯示其中5個(gè)鐵死亡相關(guān)基因與總體生存期相關(guān)。這些結(jié)果都表明鐵死亡在肺鱗癌中的潛在作用，以及利用鐵死亡相關(guān)基因建立預(yù)后模型的可能性。

本研究建立的預(yù)后模型由5個(gè)鐵死相關(guān)基因(ALOX5、TFRC、PHKG2、FADS2、NOX1)構(gòu)成。這些基因主要和4種代謝有關(guān)，即脂代謝、鐵代謝、能量代謝和抗氧化代謝?；ㄉ南┧?-脂氧合酶(ALOX5)是一種起始酶，主要介導(dǎo)炎癥介質(zhì)白細(xì)胞三烯和脂氧素生成，是腫瘤細(xì)胞存活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，ALOX5基因可通過(guò)過(guò)表達(dá)而抑制由于藥物誘導(dǎo)導(dǎo)致的鐵死亡[18]。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFRC)是重要蛋白質(zhì)分子，在機(jī)體鐵的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)化和利用等鐵代謝過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，此外還可介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及代謝，過(guò)度表達(dá)的TFRC能顯著抑制由c-Myc引起腫瘤的形成過(guò)程[19]。磷酸化酶催化亞基γ(PHKG2)基因抑制會(huì)導(dǎo)致線粒體中鐵的累及和隨后的氧化損傷，從而導(dǎo)致毛蘭素誘導(dǎo)的肺鱗癌細(xì)胞鐵死亡[20]。脂肪酸去氧飽和酶基因2(FADS2)可通過(guò)在脂肪酸的烴鏈中引入雙鍵來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)多不飽和脂肪酸合成的目的，F(xiàn)ADS2的過(guò)度表達(dá)可以加速腫瘤細(xì)胞的鐵死亡進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[21]。酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)參與催化產(chǎn)生活性氧過(guò)程，NOX1的敲除可以通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞脂質(zhì)活性氧的誘導(dǎo)來(lái)抑制毛蘭素誘導(dǎo)的鐵死亡[22]。

雖然以往研究顯示，腫瘤的免疫機(jī)制一直是熱門的研究領(lǐng)域，但腫瘤免疫和鐵死亡之間的潛在調(diào)控關(guān)系仍然未知。作者對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的差異基因進(jìn)行了GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因存在于與免疫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和通路中。根據(jù)結(jié)果，推測(cè)鐵死亡與腫瘤的免疫功能之間可能存在密切關(guān)聯(lián)。在本次研究中，低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組的免疫功能存在著顯著差異，一種可能性是鐵死亡細(xì)胞釋放不同的信號(hào)，如脂質(zhì)代謝產(chǎn)物、鐵代謝產(chǎn)物、細(xì)胞因子等，將抗原呈遞細(xì)胞吸引到鐵死亡細(xì)胞的位置[23]。此外，通過(guò)對(duì)比分析，高風(fēng)險(xiǎn)人群都有較高比例的巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。有研究表明，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增加和肺癌患者預(yù)后不良有關(guān)，因?yàn)檫@兩類細(xì)胞起到免疫侵襲作用[24]。同時(shí)，本研究通過(guò)免疫功能狀態(tài)分析還發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組患者與抗腫瘤免疫受損相關(guān)，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的Ⅱ型IFN應(yīng)答的比例更低，提示該組患者抗腫瘤免疫功能減弱，且可能是預(yù)后不良的原因之一。

本研究仍有一些不足之處：(1)鐵死亡相關(guān)基因建立的預(yù)后模型是基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA的臨床資料和基因表達(dá)譜，為驗(yàn)證此模型的臨床作用，需根據(jù)自身臨床數(shù)據(jù)加以確認(rèn)；(2)預(yù)后模型僅納入了鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)水平，許多顯著與肺鱗癌預(yù)后相關(guān)的基因可能排除在外；(3)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫功能的關(guān)系需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，經(jīng)多種生物信息學(xué)方法篩選出的5個(gè)鐵死亡相關(guān)基因組成的預(yù)后模型對(duì)肺鱗癌預(yù)后有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，可能對(duì)肺鱗癌患者人的個(gè)體化治療和評(píng)估提供一定依據(jù)。