劉春紅，湯燚聰，高瑜培，李云飛，陳曉光

（長春工業(yè)大學(xué)人文信息學(xué)院制藥工程學(xué)院，吉林長春 130122）

衰老是生理功能持續(xù)退化的過程，有關(guān)衰老的學(xué)說有免疫學(xué)說、遺傳基因?qū)W說、端粒學(xué)說和自由基學(xué)說等。自由基學(xué)說認(rèn)為隨著年齡的增長和外界環(huán)境的有害刺激，會(huì)使機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生大量自由基，并加速組織功能損傷或衰老[1-2]，大量抗衰老物質(zhì)的研究是從抗氧化為入口進(jìn)行探索，而衰老及與其相關(guān)的疾病已對(duì)人類健康和生命造成巨大威脅，成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界和社會(huì)界的重要問題。因此，機(jī)體抗氧化作用能保持自由基產(chǎn)生與消除的平衡，對(duì)預(yù)防衰老有重要意義。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）具有生命周期短、易培養(yǎng)、與人類基因相似度高等特點(diǎn)[3-4]，其可作為抗衰老、抗氧化研究的生物模型[5-6]，并廣泛用于藥物研究及評(píng)價(jià)。已有研究表明，胰島素/胰島素樣生長因子-1（Insulin/IGF-1）信號(hào)通路、飲食限制信號(hào)通路、線粒體信號(hào)通路在線蟲衰老調(diào)控中起重要作用[7-12]。紫薯提取物通過在胰島素信號(hào)通路中調(diào)控相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)抗氧化應(yīng)激能力，延長線蟲壽命[13]。紫果苷提取物通過daf-16介導(dǎo)的途徑延長線蟲壽命[14]。枸杞通過調(diào)控線粒體內(nèi)抗氧化基因的表達(dá)延長線蟲壽命[15]。

鹿茸的來源為鹿科動(dòng)物梅花鹿、馬鹿等雄鹿密生茸毛尚未骨化的幼角。其性味甘、咸，歸腎、肝經(jīng)，用于腎陽不足、精血虛虧、陽痿早泄、宮寒不孕、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、四肢冷、潰瘍久不愈合等[16]。鹿茸中含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、磷脂等多種活性物質(zhì)，胡太超等[17]通過測定鹿茸多肽對(duì)小鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等指標(biāo)的影響，證明了鹿茸多肽能降低MDA水平，提高SOD、GSHPx活性，加速自由基清除，增強(qiáng)小鼠抗氧化能力，達(dá)到延緩衰老和抗疲勞的作用。韓叢成等[18]通過研究復(fù)方鹿茸口服液對(duì)老年小鼠B型單胺氧化酶（monoamine oxidase B，MAO-B）、SOD、MDA、腦單胺類遞質(zhì)的影響，證明了復(fù)方鹿茸口服液具有清除體內(nèi)過多的活性氧自由基的作用，從而達(dá)到延緩衰老的效果。另外，鹿茸還具有提高免疫抗腫瘤、胃粘膜保護(hù)等作用[19-21]，有廣泛的藥用價(jià)值。

以往研究鹿茸抗衰老作用常以小鼠為動(dòng)物模型，本文選取鹿茸乙醇提取物（velvet antler ethanol extract，VAEE）為材料，以秀麗隱桿線蟲為模型，研究其對(duì)線蟲衰老的影響，為鹿茸的深度開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（Escherichia coli）OP50、野生型N2（Bristol）秀麗隱桿線蟲（C.elegans）、突變體線蟲clk-1（qm30）、daf-2（e1368）、eat-2（ad1116）Caenorhabditis Genetics Center（CGC）；鮮鹿茸 吉林省長春市雙陽鹿場；胰蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、酵母提取物、膽固醇 上海薩恩科技有限公司；胡桃醌 上海阿拉丁試劑公司；SYBRGreen BIO-RAD公司。

RE-5型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海雅榮公司；KQ-50B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FA2004N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；LRH-70F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SMZ-161顯微鏡 麥克奧迪公司；THZ-103B型恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YM50立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鹿茸乙醇提取物的制備 將鮮鹿茸切片為厚度0.2 cm，質(zhì)量30.8 g，加5倍量的50%乙醇，88 ℃回流提取4次，每次4 h。合并濾液，旋轉(zhuǎn)濃縮至流浸膏，將其加入5倍量的80%乙醇，醇沉后合并濾液并濃縮至每1.95 g濃縮液含1 g原藥材，濃縮液冷藏保存。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)及同期化 固體培養(yǎng)基（nematode growth media，NGM）配制：稱4.0 g瓊脂、0.5 g蛋白胨、0.6 g NaCl加入100 mL蒸餾水溶解搖勻，再加入1 mol/L MgSO4溶液、1 mol/L CaCl2溶液各200 μL，pH6.0磷酸氫鉀緩沖液3.25 mL，搖勻后補(bǔ)足蒸餾水至200 mL。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，溫度降至60 ℃左右，加入200 μL 5 mg/mL膽固醇乙醇溶液，倒板備用。取L4期野生型N2線蟲于涂布OP50的NGM培養(yǎng)基內(nèi)，觀察其產(chǎn)卵情況，開始產(chǎn)卵4 h后，將L4期成蟲挑去，將卵培養(yǎng)至L4期成蟲，該批成蟲即為同期化成蟲。

1.2.3 加藥組與對(duì)照組NGM的配制 加藥組NGM配制方法同1.2.2，加入VAEE后，分別配制成N2VAEE 5 mg/mL、N2 VAEE 2.5 mg/mL、N2 VAEE 1 mg/mL的NGM培養(yǎng)基，對(duì)照組NGM的配制方法同1.2.2，加入與VAEE等量的蒸餾水，配制成相應(yīng)各濃度的對(duì)照組NGM培養(yǎng)基。

1.2.4 對(duì)秀麗隱桿線蟲衰老指標(biāo)的檢測

1.2.4.1 壽命實(shí)驗(yàn) 將同期化的野生型N2線蟲，隨機(jī)挑取50條至各濃度加藥組（5、2.5、1 mg/mL VAEE）與對(duì)照組，此時(shí)記為第0 d，20 ℃下培養(yǎng)，每天同一時(shí)間將線蟲轉(zhuǎn)移至新的同濃度培養(yǎng)皿內(nèi)，并觀察線蟲的存活情況。線蟲死亡及剔除標(biāo)準(zhǔn)：無運(yùn)動(dòng)跡象，用鉑絲輕觸后10 s無反應(yīng)；線蟲因爬出培養(yǎng)皿失蹤或致死、蟲卵在體內(nèi)孵化成袋樣蟲的不計(jì)入數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，整理數(shù)據(jù)并繪制曲線。

1.2.4.2 紫外應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將同期化的野生型N2線蟲隨機(jī)挑取30條至各濃度加藥組（5、2.5、1 mg/mL VAEE）與對(duì)照組，20 ℃下培養(yǎng)3 d，第4 d于紫外條件下照射1 h，再轉(zhuǎn)入相應(yīng)NGM中繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)記為第0 d，每天更換培養(yǎng)基同時(shí)觀察并記錄線蟲死亡情況，標(biāo)準(zhǔn)同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，整理數(shù)據(jù)并繪制曲線。

1.2.4.3 熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 將同期化的野生型N2線蟲隨機(jī)挑取30條至各濃度加藥組（5、2.5、1 mg/mL VAEE）與對(duì)照組，20 ℃下培養(yǎng)3 d，第4 d于37 ℃下培養(yǎng)2 h，再轉(zhuǎn)入相應(yīng)NGM中繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)記為第0 d，每天更換培養(yǎng)基同時(shí)觀察并記錄線蟲死亡情況，標(biāo)準(zhǔn)同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，整理數(shù)據(jù)并繪制曲線。

1.2.4.4 運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 將同期化的野生型N2線蟲隨機(jī)挑取50條至加藥組（2.5 mg/mL VAEE）與空白對(duì)照組，此時(shí)記為第0 d，分別于第3、5、7、9 d，隨機(jī)取10條線蟲置于M9中（M9配制方法：稱取0.3 g H2PO4，1.51 g Na2HPO4·12H2O，0.5 g NaCl，置于蒸餾水中定容至500 mL，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，溫度降至50～60 ℃時(shí)為宜，加入無菌1 mol/L MgSO4溶液500 μL），2 min后觀察30 s內(nèi)每條線蟲的移動(dòng)情況（身體擺動(dòng)定義為頭或尾從一側(cè)擺向另一次側(cè)）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，整理數(shù)據(jù)并作圖。

1.2.4.5 產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn) 將同期化的L4期野生型N2線蟲，隨機(jī)挑取1條至加藥組（2.5 mg/mL VAEE）與空白對(duì)照組，每組10個(gè)培養(yǎng)皿，此時(shí)記為產(chǎn)卵第1 d，每隔24 h將線蟲挑至新培養(yǎng)基中，每天記錄蟲卵數(shù)目（產(chǎn)卵量），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，整理數(shù)據(jù)并作圖。

1.2.5 野生型N2線蟲及突變體線蟲氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)在20 ℃下將同期化線蟲{野生型N2線蟲、突變體線蟲eat-2（ad1116）、daf-2（e1368）、clk-1（qm30）}于加藥組、對(duì)照組NGM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)3 d后，轉(zhuǎn)入200 μmol/L胡桃醌NGM培養(yǎng)基中，NGM配制方法同1.2.2，待溫度降至60 ℃左右加入胡桃醌溶液，不斷攪拌，倒入培養(yǎng)皿中，形成終濃度為200 μmol/L的胡桃醌NGM培養(yǎng)基，全程盡量減少光照直射。每板50條，于顯微鏡下連續(xù)觀察線蟲每小時(shí)的死亡情況，直至線蟲全部死亡，死亡和剔除標(biāo)準(zhǔn)同上。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，整理數(shù)據(jù)并繪制生存曲線。

1.2.6 q-PCR實(shí)驗(yàn) 按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[22-23]，取30條野生型N2線蟲的成蟲產(chǎn)卵4 h，得到同期化的蟲卵，然后將蟲卵轉(zhuǎn)移到加藥組（2.5 mg/mL VAEE）和對(duì)照組線蟲的培養(yǎng)基上，線蟲成長到成蟲時(shí)期收集線蟲，按照試劑盒說明書的方法測定基因gst-4、gst-7、skn-1、hsp16.2的轉(zhuǎn)錄水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 8.0作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用兩步差異分析法（ANOVA）作顯著性差異分析，“*”表示P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，“**”表示P＜0.01，存在顯著性差異；“***”表示P＜0.001，存在極顯著差異；“****”表示P＜0.0001,存在極極顯著差異。實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸乙醇提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命及衰老生理指標(biāo)的影響

2.1.1 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲壽命的影響 壽命是反映衰老的一個(gè)直觀指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)檢測了鹿茸乙醇提取物對(duì)野生型N2線蟲壽命的影響。由圖1可以看出，各濃度加藥組與對(duì)照組相比壽命曲線均右移，說明VAEE對(duì)線蟲的壽命有明顯的延長作用，在第13 d現(xiàn)象較明顯，各濃度加藥組線蟲的活躍程度明顯強(qiáng)于對(duì)照組，最長壽命為28 d，從表1的平均壽命數(shù)值可以看出，與對(duì)照組相比，2.5 mg/mL加藥組效果最佳，平均壽命為19.59 d，壽命值延長了約18.2%，表明VAEE能延緩線蟲衰老。

圖1 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲壽命的影響Fig.1 Effect of ethanol extract of velvet antler on life span of nematode

表1 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲平均壽命的影響Table 1 Effect of ethanol extract of velvet antler on the average life of nematode

表2 紫外應(yīng)激、熱應(yīng)激下鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲平均壽命的影響Table 2 Effects of ethanol extract of velvet antler under ultraviolet and heat stress on the average life span of nematode

2.1.2 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲紫外應(yīng)激和熱應(yīng)激的影響 抗紫外輻射和耐熱的能力也是考察抗衰老的一種表現(xiàn)。有研究表明，過度的紫外輻射會(huì)引起機(jī)體DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。李貞景等[25]發(fā)現(xiàn)花生四烯酸對(duì)紫外輻射損傷后的線蟲具有一定的修復(fù)作用，能降低線蟲體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平。本實(shí)驗(yàn)檢測了鹿茸乙醇提取物對(duì)野生型N2線蟲紫外應(yīng)激和熱應(yīng)激的影響。由表2和圖2A可知，線蟲在紫外輻射條件下，1 mg/mL加藥組與對(duì)照組相比不能延長線蟲生存時(shí)間，2.5 mg/mL加藥組線蟲平均壽命為2.81 d，2.5 mg/mL與5 mg/mL加藥組與對(duì)照組相比，曲線明顯右移，具有極極顯著性差異（P＜0.0001），能增強(qiáng)線蟲抗紫外應(yīng)激的能力。由表2和圖2B可知，線蟲在高溫條件下，各濃度的加藥組與對(duì)照組相比，線蟲平均壽命均顯著延長，2.5 mg/mL加藥組線蟲平均壽命為3.28 d，曲線明顯右移，能增強(qiáng)線蟲抗熱應(yīng)激的能力，這與q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，VAEE能上調(diào)熱抗性基因hsp16.2的轉(zhuǎn)錄水平相一致。

圖2 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲紫外應(yīng)激和熱應(yīng)激的影響Fig.2 Effects of ethanol extract of velvet antler on ultraviolet and heat stress of nematode

2.1.3 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)能力和生殖能力的影響 線蟲運(yùn)動(dòng)能力和產(chǎn)卵量這兩個(gè)指標(biāo)同線蟲的壽命具有直接相關(guān)性，能評(píng)價(jià)線蟲的衰老速度。在壽命和紫外應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中2.5 mg/mL鹿茸乙醇提取物作用效果最佳，因此選用此濃度檢測線蟲運(yùn)動(dòng)能力和產(chǎn)卵量。線蟲的運(yùn)動(dòng)能力不但能夠體現(xiàn)機(jī)體健康情況，還能反映神經(jīng)系統(tǒng)的健康程度。從擺動(dòng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）可以看出，與對(duì)照組相比，從第5 d開始鹿茸乙醇提取物能顯著提高線蟲的運(yùn)動(dòng)能力（P＜0.01）（圖3A）；從產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，鹿茸乙醇提取物從第3 d開始能極極顯著提高線蟲的產(chǎn)卵量（P＜0.0001）（圖3B），表明其對(duì)線蟲的生殖能力有正向增強(qiáng)作用，達(dá)到延緩衰老的作用。

2.2 鹿茸乙醇提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲氧化應(yīng)激的影響

外界環(huán)境刺激以及線粒體會(huì)產(chǎn)生各種過氧化因子，如超氧陰離子、H2O2、羥自由基等，它們可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化反應(yīng)，同時(shí)細(xì)胞進(jìn)化了抗氧化防御系統(tǒng)，如SOD、GSH-Px、Vc、VE等[26-27]，來應(yīng)對(duì)過量的活性氧。趙玉紅等[28]發(fā)現(xiàn)鹿茸單一多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有清除作用，具有抗氧化活性；陳曉光等[29]發(fā)現(xiàn)鹿茸多胺能明顯提高小鼠清除自由基的能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，具有抗氧化作用；Ding等[30]從鹿茸中提取純化得到抗氧化四肽，它能夠抑制肝細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，在體外及斑馬魚模型中表現(xiàn)出明顯的抗氧化能力。

胡桃醌能使暴露在其中的線蟲體內(nèi)活性氧增多，影響機(jī)體正常生理代謝，造成組織損傷導(dǎo)致線蟲死亡[31]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了200 μmol/L胡桃醌氧化應(yīng)激條件，考察了鹿茸乙醇提取物對(duì)野生型N2線蟲在此條件下的生存時(shí)間。實(shí)驗(yàn)表明，各濃度加藥組線蟲的平均壽命均延長，且生存曲線較對(duì)照組都明顯右移（表3，圖4A），表明鹿茸乙醇提取物具有明顯的抗氧化應(yīng)激能力，這可能與其含有多種能降低各種過氧化因子的活性物質(zhì)有關(guān)。其中2.5 mg/mL與5 mg/mL加藥組效果接近，但在壽命實(shí)驗(yàn)中2.5 mg/mL加藥組效果最佳，因此選用該濃度應(yīng)用于突變體線蟲。

圖3 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)能力和生殖能力的影響Fig.3 Effects of ethanol extract of velvet antler on locomotor and reproductive ability of nematode

為進(jìn)一步探究鹿茸乙醇提取物抗衰老作用機(jī)理，考察了3條相關(guān)信號(hào)通路的突變體線蟲在氧化應(yīng)激條件下的生存時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在胰島素信號(hào)通路突變體線蟲daf-2和飲食信號(hào)通路突變體線蟲eat-2的氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，加藥組與對(duì)照組相比線蟲平均壽命延長，生存曲線明顯右移（表3，圖4B和4C），鹿茸乙醇提取物能增強(qiáng)daf-2、eat-2突變體線蟲的抗氧化應(yīng)激能力，然而clk-1突變體線蟲加藥組與對(duì)照組的平均壽命和生存曲線無明顯差異（P=0.8597），表明鹿茸乙醇提取物抗氧化作用可能與線粒體信號(hào)通路有關(guān)（表3，圖4D）。

表3 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲在氧化應(yīng)激下平均壽命的影響Table 3 Effects of ethanol extract of velvet antler on the average life spans of C.elegans under oxidative stress

2.3 鹿茸乙醇提取物對(duì)抗氧化基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

q-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為2.5 mg/mL的鹿茸乙醇提取物能夠上調(diào)經(jīng)典的抗氧化基因gst-4、gst-7和skn-1及熱抗性基因hsp16.2的轉(zhuǎn)錄水平，且差異具意義（P＜0.05）（圖5）。

3 結(jié)論

通過在鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲衰老影響的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)鹿茸乙醇提取物為2.5 mg/mL時(shí)具有最佳的抗衰老作用。線蟲壽命實(shí)驗(yàn)研究顯示，VAEE為2.5 mg/mL時(shí)線蟲平均壽命為19.59 d，最長壽命為28 d，強(qiáng)于對(duì)照組；線蟲紫外應(yīng)激和熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)研究顯示，VAEE為2.5 mg/mL時(shí)線蟲平均壽命分別為2.81 d和3.28 d，與對(duì)照組比具有極極顯著性差異（P＜0.0001）；VAEE在該濃度下與對(duì)照組比，從第5 d開始能顯著提高線蟲的運(yùn)動(dòng)能力，從第3 d開始極極能顯著（P＜0.0001）提高線蟲的產(chǎn)卵量；野生型N2線蟲氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)研究顯示，VAEE為2.5 mg/mL時(shí)線蟲平均壽命為4.58 h，優(yōu)于對(duì)照組；加藥組與對(duì)照組clk-1突變體線蟲在氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中生存時(shí)間無明顯差異，VAEE能夠通過clk-1信號(hào)通路促進(jìn)SKN-1細(xì)胞核轉(zhuǎn)位降低內(nèi)源性ROS，進(jìn)而上調(diào)抗氧化基因gst-4、gst-7和skn-1及熱抗性基因hsp16.2在線蟲體內(nèi)的表達(dá)。

綜上所述，鹿茸乙醇提取物具有抗衰老及抗氧化作用，本文為鹿茸的后續(xù)開發(fā)利用提供參考。

圖4 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲氧化應(yīng)激的影響Fig.4 Effect of ethanol extract of velvet antler on oxidative stress of nematode

圖5 鹿茸乙醇提取物對(duì)線蟲基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Effects of ethanol extract of velvet antler on gene transcription level of nematode