李秀涼，倪慶圓，楊 宸，宋 永，韓曉云，孫慶申,

（1.黑龍江大學(xué)，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江哈爾濱 150500；2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080；3.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校微生物重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150080）

調(diào)查顯示，我國15～69歲的人群當(dāng)中約有40%是高血脂癥患者，病癥主要是由長期高脂飲食導(dǎo)致對脂質(zhì)的過度吸收或者是體內(nèi)脂質(zhì)代謝及轉(zhuǎn)運異常引起[1]。目前，市面上治療高脂血癥的藥物主要包括他汀類及樹脂類藥物、煙酸和依折麥布等[2]，這些藥物大多具有副作用，所以尋找天然的降血脂物質(zhì)顯得尤其重要。

大量流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長期食用富含總黃酮的食品能夠有效降低心血管疾病的發(fā)病率[3]。陳會良等[4]研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮類物質(zhì)在降脂方面主要是通過對抗低密度脂蛋白的氧化、清除體內(nèi)自由基及抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生而發(fā)揮作用。

納豆主要是以大豆為原料，蒸煮后接入納豆芽孢桿菌發(fā)酵而成。納豆營養(yǎng)價值高，具有多種醫(yī)療保健功能。納豆含有總黃酮、卵磷脂、皂苷、生物堿等多種生理活性物質(zhì)，長期食用可提升機體的免疫力[5]。納豆中的總黃酮更是具有抗氧化[6-7]、抗癌[8-11]、降血壓和降血脂[12-15]等功效。因此，選擇特定的豆制品原料，再通過一定的生物技術(shù)手段提高其中的總黃酮類物質(zhì)的含量具有重要的研究價值和應(yīng)用前景。

菜用大豆是一種含有豐富植物蛋白、多種有益礦物質(zhì)、維生素及膳食纖維等成分的豆類植物。目前，我國對于菜用大豆深加工產(chǎn)品的研究和開發(fā)還比較落后。本課題研究目的是以菜用大豆等外品為原料，經(jīng)實驗室前期分析顯示，通過蘆丁比色法未能測到總黃酮類物質(zhì)，因此，本文擬利用納豆芽孢桿菌對其進行發(fā)酵處理，以期提高總黃酮含量，為企業(yè)提高菜用大豆的附加值、增加收入提供重要的解決方案。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌粉 日本有限會社高橋祐藏研究所；菜用大豆 山東陽光農(nóng)業(yè)生物科技有限公司；SPF級雄性C57BL/6J小鼠90只 6～8周齡，18～22 g，長春長生生物有限公司，實驗動物合格證號NO.SCXK（遼）2020-0001；高脂飼料 北京泰博宏達生物有限公司；普通飼料 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)；奧利司他 中山萬漢制藥；小鼠高密度脂蛋白（High density lipoprotein, HDL）、總膽固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）、白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、白細胞介素-10（interleukin-10, IL-10）、腫瘤壞死因子- α（tumor necrosis factor-α, TNF- α）ELISA試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其他試劑 市售分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 納豆發(fā)酵 按照傳統(tǒng)的方法[15]制作納豆，具體過程如下：挑選無發(fā)霉、蟲害的菜用大豆，清洗后浸泡過夜，在121 ℃條件下蒸煮20 min，自然冷卻至50～60 ℃后，按5.75×1010～2.3×1011CFU/100 g接入納豆菌菌液，接種完成后置于恒溫培養(yǎng)箱中，于35～41 ℃發(fā)酵12～48 h，發(fā)酵完成后，將納豆放入4 ℃冰箱中后熟6～24 h后取出，即得到發(fā)酵好的納豆。

1.2.2 總黃酮提取及含量測定 參考文獻[16-18]的方法提取總黃酮。將發(fā)酵好的納豆置于-20 ℃預(yù)凍12 h后，進行冷凍干燥，然后將冷凍干燥完成的納豆置于粉碎機中粉碎，過80目篩后，稱量所得納豆粉質(zhì)量。向納豆粉中加入10倍體積石油醚，在超聲功率為300 W的條件下間歇處理10次，每次3 min，萃取脂肪，棄去石油醚層后，加入30倍體積60%乙醇，80 ℃熱回流3 h，收集提取液，即得總黃酮粗提液。

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定總黃酮含量[16-19]。具體操作如下：準確吸取蘆丁標準溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL（相當(dāng)于0、75、150、300、450、600 μg蘆?。?，移入10 mL刻度比色管中，加入30%乙醇溶液至5 mL，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，振搖后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，于510 nm波長處測定吸光度，以零管為空白，以蘆丁含量（μg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線方程如下：

取適量的黃酮粗提物粉末，配制成合適濃度的溶液，按照對蘆丁標準品的處理過程獲得黃酮粗提物待測液，測得的OD510吸光值，代入上述標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

1.2.3 納豆發(fā)酵工藝單因素實驗 將菜用大豆清洗后倒入250 mL錐形瓶中，121 ℃、0.1 MPa下高溫蒸煮20 min后，以納豆中總黃酮的含量為評價指標，分別進行以下單因素實驗處理：

1.2.3.1 發(fā)酵時間 按1.150×1011CFU /100 g添加納豆芽孢桿菌，于37 ℃條件下分別靜置發(fā)酵12、24、36和48 h，發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱后熟12 h，測定不同發(fā)酵時間下得到的納豆中總黃酮的含量，確定最適合的發(fā)酵時間。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度 按1.150×1011CFU /100 g添加納豆芽孢桿菌，分別于35、37、39和41 ℃靜置發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱后熟12 h，測定不同發(fā)酵溫度下得到的納豆中總黃酮的含量，以確定最適合的發(fā)酵溫度。

1.2.3.3 接 菌 量 分 別 按5.750×1010、1.150×1011、1.725×1011和2.300×1011CFU /100 g添 加 菌 液，37 ℃靜置發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱后熟12 h，測定不同接菌量下發(fā)酵制得的納豆中總黃酮的含量，得到最適合的接菌量。

1.2.3.4 后熟時間 按1.150×1011CFU /100 g添加菌液，37 ℃分別靜置發(fā)酵24 h，發(fā)酵完成后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱分別后熟6、12、18和24 h，測定不同后熟時間下發(fā)酵制得的納豆中總黃酮的含量，得到最適合的后熟時間。

1.2.4 正交試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇對納豆黃酮產(chǎn)量影響顯著的三個因素，即發(fā)酵時間（A）、接菌量（B）和后熟時間（C）為變量，納豆中總黃酮含量為評價指標，選用正交表L9（34）進行3因素3水平正交實驗，確定納豆發(fā)酵條件最佳組合（如表1所示）。

表1 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for optimization of natto fermentation process

1.2.5 總黃酮粗提液的純化 參考文獻[16-18]的方法純化黃酮粗提液。將D101型大孔樹脂倒入95%乙醇中預(yù)處理12 h，然后填入層析柱中，用蒸餾水洗至無味，然后以1.5 mL/min的流速加入250 mL總黃酮粗提液，靜置平衡30 min；平衡完成后使用70%乙醇溶液以1.5 mL/min的流速洗滌直至大孔樹脂無色，收集洗脫液。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮洗脫液，濃縮完成后置于-20 ℃預(yù)冷凍后進行冷凍干燥，獲得純化的總黃酮粉末。將純化的總黃酮粉末配制成一定濃度的總黃酮水溶液，并根據(jù)1.2.2的方法確定總黃酮的含量。

1.2.6 動物實驗分組及劑量 實驗選擇80只雄性SPF級C57BL/6J小鼠，體重18～22 g。將實驗小鼠放置在動物飼養(yǎng)室中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間12 h光照和12 h黑暗，動物自由飲食攝水。適應(yīng)性飼養(yǎng)完成后，進行以下分組實驗。

1.2.6.1 緩解實驗 隨機選取48只小鼠，分為6組，每組8只，除空白對照組（A組）以外，其余各組連續(xù)喂養(yǎng)8周的高脂飲食以建立高脂動物模型。建模成功后，A組繼續(xù)飼喂普通飼料，每天灌胃0.2 mL/d的無菌水；陽性對照組（B組）每天飼喂高脂飼料，同時灌胃1.8 mg/d的奧利司他1次；模型組（C組）每天飼喂高脂飼料并灌胃與陽性對照組等量的生理鹽水1次；總黃酮高、中、低劑量組（D～F組）每天飼喂高脂飼料并分別按照100、50和20 mg/kg·d灌胃總黃酮水溶液1次。每只小鼠的灌胃量為0.2 mL/d，連續(xù)灌胃處理4周。

1.2.6.2 預(yù)防實驗 32只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)完成后，隨機分為4組，即空白對照組（A組）：飼喂普通飼料，灌胃0.2 mL/d的無菌水；陽性對照組（B組）：飼喂高脂飼料，灌胃1.8 mg/d的奧利司他；模型組（C組）：飼喂高脂飼料，灌胃與陽性對照組等量的生理鹽水；總黃酮提取物處理組（D組）：飼喂高脂飼料，灌胃50 mg/（kg·d）的納豆總黃酮提取物。每組8只，連續(xù)灌胃處理喂養(yǎng)8周，每只小鼠的灌胃量為0.2 mL/d，每日灌胃1次。

1.2.7 總黃酮對小鼠體重及Lee’s指數(shù)影響 實驗過程中每周測定小鼠的體重和體長（從鼻子到肛門），按照如下公式計算Lee’s指數(shù)：

1.2.8 總黃酮對小鼠肝脾指數(shù)影響 在眼球取血結(jié)束后，斷頸處死小鼠，迅速收集小鼠的肝臟和脾臟，并用濾紙吸去血漬，除去周圍的組織和脂肪后稱量其濕重。根據(jù)以下公式計算免疫器官的指數(shù)：

1.2.9 總黃酮對小鼠血清中血脂及炎癥因子影響 實驗結(jié)束時，小鼠禁食12 h，期間自由飲水，采用摘眼球法取血，用不含內(nèi)毒素的1.5 mL離心管收集血液，1652 g離心10 min，取上清到新離心管中，-20 ℃的冰箱保存，待檢測時，提前將血清放入冰浴環(huán)境中解凍，使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中TNF-α、HDL、IL-6、IL-10、TG和TC的含量，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均進行三次重復(fù)實驗，用Origin 2018軟件對結(jié)果進行分析和作圖。通過ANOVA對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果表示為平均值±標準差的形式。標記小寫字母不同者表示差異顯著(P＜0.05)，字母相同或部分相同或未標記者表示差異不顯著(P＞0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆發(fā)酵產(chǎn)黃酮工藝的確定

2.1.1 單因素實驗 如圖1A所示，納豆中總黃酮含量隨著發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在12～24 h這個階段，納豆中總黃酮含量逐漸升高，發(fā)酵時間為24 h時，納豆中總黃酮含量達到最高；而當(dāng)發(fā)酵時間超過24 h時，發(fā)酵底物的營養(yǎng)物質(zhì)可能不足以維持納豆菌的代謝，同時次級代謝產(chǎn)物過多，對初級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生抑制[16-18]，使得納豆中總黃酮含量逐漸降低。為此，選擇發(fā)酵時間為24、36和48 h進行后續(xù)實驗。

本實驗中發(fā)酵溫度對納豆中總黃酮含量的影響如圖1B所示。隨著發(fā)酵溫度的升高，納豆中的總黃酮含量不斷變化。而當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時，納豆中總黃酮含量最高。因此，發(fā)酵溫度選擇為37 ℃。

如圖1C所示，接菌量對納豆發(fā)酵過程中總黃酮的產(chǎn)生具有一定影響。當(dāng)接菌量為5.75×1010CFU/100 g時，納豆的總黃酮含量較低，造成這種結(jié)果的原因可能是因為接菌量太少，細菌生長速度緩慢，發(fā)酵過程不完全；當(dāng)接菌量為1.15×1011CFU/100 g時，納豆中總黃酮含量達到最大；接菌量大于1.15×1011CFU/100 g時，納豆中總黃酮含量隨接菌量增大而降低，此時細菌繁殖速度過快導(dǎo)致菜用大豆中營養(yǎng)成分迅速耗竭，從而導(dǎo)致納豆中總黃酮含量減少[16-18]。因此，接菌量選擇為5.75×1010、1.15×1011、1.73×1011CFU/100 g進行后續(xù)實驗。

從圖1D可以看出，當(dāng)后熟時間為12 h時，納豆的總黃酮含量最高，納豆的獨特氨味較少、黏度較低；當(dāng)后熟時間大于12 h時，納豆的氨臭味過大，納豆中總黃酮含量逐漸降低。因此，后熟時間選擇為6、12和18 h進行后續(xù)實驗。

圖1 發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接菌量（C）和后熟時間（D）對納豆中總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time (A), fermentation temperature (B), inoculation dose (C) and ripening time (D)on the content of total flavonoids in natto

有研究表明，大豆產(chǎn)品經(jīng)微生物發(fā)酵后，可以實現(xiàn)一些次級代謝物的轉(zhuǎn)化，如大豆經(jīng)黑曲霉（A. nigerM46）發(fā)酵，其異黃酮化合物的組成發(fā)生了改變，提高了發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性[20]。Moktan等[21]研究也顯示，大豆經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵以后，其總酚含量明顯增加，導(dǎo)致其抗氧化能力得到顯著提高。因此，本研究以納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵劑，經(jīng)發(fā)酵后提高菜用大豆黃酮含量具有可行性。

2.1.2 正交試驗 由表2、表3可知，3個因素對菜用大豆發(fā)酵納豆中總黃酮類物質(zhì)含量影響順序為A＞B＞C，即發(fā)酵時間＞接菌量＞后熟時間。A1B2C3是正交試驗得出的納豆中總黃酮類物質(zhì)含量最高的發(fā)酵方案，即菜用大豆發(fā)酵時間24 h，接菌量1.15×1011CFU /100 g，后熟時間18 h，此發(fā)酵方案下納豆中的總黃酮類含量為4.35 mg/g（以菜用大豆計）；經(jīng)驗證試驗，該條件下納豆黃酮產(chǎn)量與A1B2C2（4.30 mg/g）條件下差異不顯著（P＞0.05），考慮到后熟時間18 h時間過長，選擇A1B2C2作為最優(yōu)發(fā)酵方案。

F檢驗結(jié)果表明，各因素F值遠小于F0.05（2，4），這說明三個因素的交互作用對總黃酮含量的影響均不顯著，可以選擇上述實驗方案作為最優(yōu)組合。

表2 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment result for optimization of natto fermentation process

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of orthogonal experimental variance

2.2 總黃酮對小鼠體重及Lee’s指數(shù)的影響

圖2A為緩解實驗中第0、8、12周小鼠體重變化情況。第8周末時，飼喂高脂飼料的小鼠體重顯著高于正常對照組（A）的體重（P＜0.05），表明高脂動物模型建立成功。建模成功后再連續(xù)灌胃總黃酮4周，各組小鼠體重變化差異明顯，第12周末時，總黃酮各劑量處理組的小鼠體重顯著低于模型組（C）（P＜0.05）。

圖2B為預(yù)防實驗中第0周、第4周、第8周小鼠體重變化情況。第4周末時，模型組（C）和正常對照組（A）小鼠的體重顯著高于灌胃奧利司他干預(yù)的陽性對照組（B）和總黃酮組（D）小鼠的體重（P＜0.05）；在第8周末時，模型組（C）小鼠體重顯著高于其他三組小鼠體重（P＜0.05），其中總黃酮組（D）小鼠的體重略低于正常對照組（A）。

如表4所示，緩解實驗中各組小鼠在第12周末體長無顯著性差異（P＞0.05），C組小鼠Lee’s指數(shù)顯著高于其他五組（P＜0.05）?？傸S酮各劑量處理組小鼠的Lee’s指數(shù)與正常對照組（A）、陽性對照組（B）無顯著性差異（P＞0.05）。

預(yù)防實驗中第8周末各組小鼠體長無顯著性差異（P＞0.05），C組小鼠Lee's指數(shù)顯著高于另外三組（P＜0.05），正常對照組（A）、陽性對照組（B）和總黃酮組（D）Lee's指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 緩解實驗（A）和預(yù)防實驗（B）各組小鼠體重變化Fig.2 Body weight change of mice in remission experiment (A) and prevention experiment (B)

2.3 總黃酮對小鼠肝脾指數(shù)的影響

高脂飲食會損害肥胖動物的肝臟，這主要是由于空泡樣變性、肝脂肪變性和肝纖維化所致[22]。脾臟是人體中最大的淋巴器官，能夠合成某些具有生物活性的物質(zhì)，同時也是發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的場所[23]。由表5可以看出，在緩解實驗中，總黃酮處理的各組小鼠肝脾指數(shù)均顯著高于模型組（C）（P＜0.05）。在預(yù)防實驗中，模型組（C）小鼠肝臟指數(shù)最低，各組小鼠脾臟指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

表4 各組小鼠體長及Lee’s指數(shù)Table 4 Body length and Lee’s index of mice in different groups

表5 緩解實驗及預(yù)防實驗各組小鼠肝臟及脾臟系數(shù)Table 5 Liver and spleen coefficients of mice in alleviating experiment and prevention experiment

2.4 總黃酮對小鼠血清中血脂的影響

由圖3可知，在緩解實驗中模型組（C）小鼠的血清中TG水平最高，顯著高于其他5組（P＜0.05），總黃酮處理的各組小鼠血清中TG水平與正常對照組（A）和陽性對照組（B）無顯著差異（P＞0.05）。預(yù)防實驗結(jié)果與緩解實驗類似，模型組（C）小鼠血清中的TG水平顯著高于其他三組（P＜0.05），灌胃奧利司他和黃酮粗提物都顯著地降低了小鼠TG含量（P＜0.05）。

圖3 緩解實驗（A）和預(yù)防實驗（B）各組小鼠血清甘油三酯變化Fig.3 Changes of triglycerides in mice in remission experiment (A) and prevention experiment (B)

圖4 緩解實驗（A）和預(yù)防實驗（B）各組小鼠血清總膽固醇變化Fig.4 Changes of total cholesterol in mice in remission experiment (A) and prevention experiment (B)

由圖4A可知，緩解實驗中模型組（C）小鼠血清中TC含量顯著高于其他五組（P＜0.05）；灌胃奧利司他處理的陽性對照組（B）小鼠血清中TC含量與總黃酮各劑量處理組沒有顯著性差異。如圖4B所示，預(yù)防實驗中模型組（C）小鼠血清TC含量顯著高于其他三組（P＜0.05），正常對照組（A）的TC含量也顯著高于陽性對照組（B）和總黃酮組（D）（P＜0.05）。

由圖5可知，緩解實驗中，灌胃總黃酮的三組小鼠血清中的HDL水平顯著高于其他三組（P＜0.05），其中總黃酮處理組小鼠血清中的HDL水平呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。預(yù)防實驗與緩解實驗結(jié)果一致，同樣是模型組（C）小鼠血清中HDL水平最低，總黃酮組（D）HDL水平最高。Aloud等[24]研究顯示，高良姜黃素（一種天然黃酮類化合物）可以降低糖尿病大鼠血清中低密度脂蛋白（LDL）水平，并升高HDL含量，使得糖尿病大鼠的血脂水平恢復(fù)到正常水平，這與本研究所得到的結(jié)果一致。

圖5 緩解實驗（A）和預(yù)防實驗（B）各組小鼠高密度脂蛋白變化Fig.5 Changes of High density lipoprotein in mice in remission experiment (A) and prevention experiment (B)

圖6 緩解實驗（A、C、E）和預(yù)防實驗（B、D、F）各組小鼠血清炎性因子含量的變化Fig.6 Changes of proinflammatory factors in mice serum in alleviating experiment (A, C, E) and prevention experiment (B, D, F)

2.5 總黃酮對小鼠炎癥因子的影響

總黃酮提取物對高脂飲食小鼠炎癥因子產(chǎn)生的影響如圖6所示。高脂飲食會引起血清促炎因子IL-6、TNF-α含量提高（圖6A, B, E, F），而抗炎因子IL-10含量下降（圖6C, D）。緩解實驗中總黃酮各劑量處理組促炎因子IL-6、TNF-α含量都明顯降低，沒有明顯的劑量依賴效應(yīng)。緩解實驗中給予總黃酮處理的三組小鼠血清中IL-10含量顯著高于其他各組（P＜0.05）（圖6C），預(yù)防實驗中總黃酮組（D）小鼠血清中IL-10含量顯著高于其他三組（P＜0.05）（圖6D）。IL-10具有抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的作用[25]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)酵菜用大豆產(chǎn)生的總黃酮提取物具有降血脂、抗炎的功效，這與文獻報道的一致[26]。

本研究中，從納豆菌發(fā)酵菜用大豆中提取了總黃酮，其中含有多種成分，有研究顯示，總黃酮中的不同成分在降脂方面具有協(xié)同效應(yīng)[27]，本研究中也顯示出總黃酮的優(yōu)異效果。

3 結(jié)論

本研究利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵菜用大豆，優(yōu)化了總黃酮的發(fā)酵工藝，通過大孔樹脂純化，得到黃酮粗提物，其含量為4.30 mg/g菜用大豆。該黃酮粗提物可預(yù)防和緩解高脂飲食引起小鼠的血脂升高，降低血清中炎癥因子水平。本研究進一步證實了利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵可以提高菜用大豆中黃酮類物質(zhì)的含量，這為通過生物發(fā)酵法提高菜用大豆的產(chǎn)品附加值提供了新思路。