唐忠斌，蘇彧，劉偉

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1-2]。由于早期胃癌及癌前病變患者無明顯癥狀，且缺乏準(zhǔn)確有效的診斷性生物標(biāo)志物，導(dǎo)致大多數(shù)胃癌患者就診時(shí)皆為晚期[3-5]。胃癌晚期時(shí)，腫瘤細(xì)胞侵入血液或淋巴管，并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。此過程涉及多個(gè)步驟及因素，其中腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間的相互作用是影響腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一[6-7]。腫瘤微環(huán)境是一種復(fù)雜的組織環(huán)境，由細(xì)胞外基質(zhì)和各種類型的基質(zhì)細(xì)胞，如胃癌成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、巨噬細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等組成[8]。成纖維細(xì)胞是腫瘤的重要組成部分，通過分泌細(xì)胞因子、生長因子及趨化因子構(gòu)成了誘導(dǎo)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的有利環(huán)境[9-10]。張子文[11]研究發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸合成酶(hyaluronan synthases 2，HAS2)在舌癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)舌癌細(xì)胞的侵襲。HAS2是細(xì)胞膜整合蛋白，廣泛分布于各組織，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、激活血管形成通路，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的功能[12-13]。在口腔癌中，HAS2在口腔癌組織及癌成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，且HAS2的高表達(dá)與口腔癌的進(jìn)展密切相關(guān)[14]。因此，本研究通過探究HAS2在胃癌組織CAFs中的表達(dá)，闡明CAFs中HAS2對(duì)胃癌侵襲、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，以期為臨床胃癌進(jìn)展的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2017年4月至2020年3月在我院進(jìn)行胃癌切除手術(shù)的患者19例。所有患者術(shù)前未接受放化療等治療，病歷資料完整。其中，男13例，女6例；年齡(46.00±4.27)歲；淋巴轉(zhuǎn)移患者4例，無淋巴轉(zhuǎn)移患者15例。手術(shù)獲得的標(biāo)本保存于-80 ℃。本研究上報(bào)我院倫理委員會(huì)申報(bào)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：2017-0024)，患者及其家屬對(duì)本研究知情并簽字知情同意書。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

胃癌細(xì)胞SGC7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。HAS2、α-SMA、vimentin、E-cadherin與N-cadherin抗體購自美國CST公司。si-NC與si-HAS2由Genepharma公司合成。Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司。改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清及胰酶購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

收集胃癌組織及癌旁正常組織，剪下 5 mm×5 mm的組織塊，根據(jù)組織塊貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)原代細(xì)胞，差異消化法去除上皮細(xì)胞后，保留正常成纖維細(xì)胞(normal tibroblasts,NFs)與胃癌相關(guān)CAFs細(xì)胞，利用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胃癌細(xì)胞SGC7901用含有15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期的胃癌相關(guān)CAFs，依據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書將si-NC與si-HAS2轉(zhuǎn)染胃癌相關(guān)CAFs，分別設(shè)置為si-NC組與si-HAS2組，6 h后更換培養(yǎng)基。

1.4 CAFs條件培養(yǎng)基的收集

收集各組對(duì)數(shù)生長期的CAFs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，收集20 mL細(xì)胞在培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長融合至90%時(shí)，收集CAFs細(xì)胞，離心去除細(xì)胞碎片，收集上清，獲得各組CAFs條件培養(yǎng)基。

1.5 Western blot檢測(cè)HAS2、α-SMA、vimentin、E-cadherin與N-cadherin蛋白表達(dá)

提取NFs及各組CAFs條件培養(yǎng)基孵育24 h后的胃癌細(xì)胞SGC7901總蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法檢測(cè)總蛋白濃度，調(diào)整總蛋白濃度為4 μg/μL，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉1 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(Phosphate buffer solution tween, PBST)洗膜，加入 HAS2、α-SMA、vimentin、E-cadherin與N-cadherin抗體，4 ℃搖床孵育過夜，PBST洗膜。加入辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶1 000)，37 ℃孵1 h，PBST 洗膜。顯影曝光，通過Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.6 免疫熒光染色檢測(cè)HAS2、α-SMA、vimentin、E-cadherin的表達(dá)

將NFs、各組CAFs細(xì)胞在含4%多聚甲醛的培養(yǎng)基中固定30 min，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗滌。滴加0.2% TritonX-100 在37 ℃下孵育15 min，PBS洗滌。加入5%山羊血清封閉0.5 h，滴加一抗HAS2、α-SMA、vimentin及E-cadherin在4 ℃下孵育過夜。滴加TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG為二抗，37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗滌。避光加入4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4′,6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色 10 min，熒光防猝滅劑密封，在熒光顯微鏡下觀察并拍攝免疫熒光圖像。

1.7 Transwell檢測(cè)胃癌細(xì)胞侵襲能力

離心收集對(duì)數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞SGC7901，利用各組CAFs細(xì)胞條件培養(yǎng)基重懸胃癌細(xì)胞SGC7901，調(diào)整SGC7901細(xì)胞濃度，在上室接種5×104個(gè)SGC7901細(xì)胞，下室加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，棉簽基質(zhì)膠，結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌后，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.8 劃痕閉合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移能力

將胃癌細(xì)胞SGC7901接種于6孔板內(nèi)，15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至達(dá)90%時(shí)，無菌槍頭在細(xì)胞單層上輕劃。PBS輕輕洗滌細(xì)胞，去除脫落細(xì)胞及細(xì)胞碎片。將各組CAFs條件培養(yǎng)基加入含有胃癌細(xì)胞的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察并測(cè)量胃癌細(xì)胞的傷口閉合度。通過image J系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞遷移面積。劃痕閉合率(%)=(0 h時(shí)劃痕面積-24 h時(shí)劃痕面積)/0 h時(shí)劃痕面積×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 胃癌組織中CAFs的表型鑒定

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1A)顯示，α-SMA在CAFs細(xì)胞中高表達(dá)，在NFs中低表達(dá)，vimentin在CAFs與NFs中均表達(dá)，而上皮標(biāo)志物E-cadherin在CAFs與NFs中均不表達(dá)。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1B、C、D)顯示，α-SMA在CAFs細(xì)胞高表達(dá)，且vimentin在CAFs與NFs中均表達(dá)，E-cadherin在CAFs與NFs中均不表達(dá)。

圖1 胃癌組織中CAFs的表型鑒定 A: Western blot檢測(cè)α-SMAz、vimentin、E-cadherin在CAFs和NFs中的表達(dá), *P<0.05, vs CAFs; B: 免疫熒光染色檢測(cè)α-SMAz在CAFs和NFs中的表達(dá)(×200); C: 免疫熒光染色檢測(cè)vimentin在CAFs和NFs中的表達(dá)(×200); D: 免疫熒光染色檢測(cè)E-cadherin在CAFs和NFs中的表達(dá)(×200)

2.2 HAS2在CAFs與NFs中的表達(dá)

Western blot(圖2A)與免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)(圖2B)結(jié)果顯示，HAS2在CAFs中高表達(dá)，在NFs中低表達(dá)。

圖2 HAS2在CAFs和NFs中的表達(dá) A:Western blot檢測(cè)， *P<0.05, vs NFs; B:免疫熒光染色檢測(cè)

2.3 沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3A)顯示，與si-NC組相比，si-HAS2組CAFs中HAS2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3B)顯示，與si-NC組相比，si-HAS2組CAFs中HAS2表達(dá)降低。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3C)顯示，與si-NC組相比，si-HAS2組胃癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)。

圖3 沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲影響 A:Western blot檢測(cè)沉默HAS2對(duì)CAFs中HAS2表達(dá)的影響, *P<0.05, vs si-NC;B:免疫熒光染色(Bar=100 μm)檢測(cè)沉默HAS2對(duì)CAFs中HAS2表達(dá)的影響;C: Transwell檢測(cè)沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲的影響, *P<0.05, vs si-NC

2.4 沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移的影響

劃痕閉合實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4A)顯示，與si-NC組相比，si-HAS2組胃癌細(xì)胞劃痕閉合率降低(P<0.05)。

圖4 沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移的影響 通過劃痕閉合試驗(yàn)檢測(cè)沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移的影響, *P<0.05, vs si-NC

2.5 沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5A)顯示，與si-NC組相比，si-HAS2組胃癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Vimentin與N-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

圖5 沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 Western blot檢測(cè)沉默HAS2對(duì)CAFs促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響, *P<0.05, vs si-NC

3 討論

胃癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟過程，最終癌細(xì)胞擴(kuò)散到腫瘤起源以外的組織和器官，并形成新的腫瘤病灶，致使患者的預(yù)后較差，死亡率居高不下[15-16]。腫瘤間質(zhì)中的CAFs是腫瘤獲得侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性行為的重要細(xì)胞。CAFs是異質(zhì)活化的成纖維細(xì)胞，其形態(tài)為紡錘形，細(xì)胞核細(xì)長，較未激活的成纖維細(xì)胞略厚[17]。研究顯示，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的位置不同，CAFs可分為：p-CAFs(原發(fā)腫瘤的CAFs)、c-CAFs(血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的CAFs)和m-CAFs(轉(zhuǎn)移部位的CAFs)，而且每種CAFs細(xì)胞在誘導(dǎo)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲方面都具有不同程度的作用[18-19]。與NFs相比，CAFs高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(monocarboxylate transporters 4，MCT4)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、白細(xì)胞介素-22(interleukin-22，IL-22)、透明質(zhì)酸合酶2(recombinant hyaluronan synthase 2，HAS2)等，誘導(dǎo)細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積、促進(jìn)血管生成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)代謝重編程、增強(qiáng)增殖和化療耐藥等[20]。Wang等[21]研究顯示，乳腺癌CAFs通過自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；Naito等[22]研究顯示，間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化與胃癌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移性相關(guān)，胃癌細(xì)胞外囊泡通過誘導(dǎo)趨化因子，活化CAFs，致使其異質(zhì)性的形成，而且CAFs中趨化因子CXC型趨化因子配體1(CXC chemokine ligand 1，CXCL1)和趨化因子CXC型趨化因子配體8(CXC chemokine ligand 8，CXCL8)的異常激活與胃癌患者的生存相關(guān)，說明CAFs在調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。近年研究報(bào)道已證明，CAFs可作為癌癥治療的潛在治療靶點(diǎn)[23-24]。因此，探究CAFs促進(jìn)胃癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)臨床診斷及治療胃癌具有一定的參考價(jià)值。

本研究成功分離培養(yǎng)CAFs與NFs細(xì)胞，vimentin在CAFs與NFs中均表達(dá)，且上皮標(biāo)志物E-cadherin在CAFs與NFs中不表達(dá)，說明CAFs與NFs細(xì)胞都是間質(zhì)細(xì)胞，具有纖維細(xì)胞特征，細(xì)胞純度高。α-SMA是肌纖維母細(xì)胞標(biāo)志，也是間質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志。研究顯示，NFs與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，可自發(fā)高表達(dá)α-SMA，獲得CAFs表型特征[25]。本研究結(jié)果顯示，α-SMA在所分離培養(yǎng)的CAFs中高表達(dá)，說明分離培養(yǎng)的CAFs是由腫瘤刺激而處于活化狀態(tài)的成纖維細(xì)胞。HAS2是位于質(zhì)膜上的一種關(guān)鍵酶，利用胞質(zhì)底物udp-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和udp-n-乙酰氨基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)，將正在生長的聚合物通過膜擠壓形成伸長的透明質(zhì)酸分子，透明質(zhì)酸通過與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)結(jié)合或分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26]。研究顯示，HAS2是癌相關(guān)成纖維細(xì)胞調(diào)控的主要酶之一，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，HAS2在胃癌CAFs中高表達(dá)，提示HAS2可能與CAFs促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Zhang等人[14]研究結(jié)果顯示，HAS2在口腔癌組織中高表達(dá)，可能參與口腔癌的淋巴轉(zhuǎn)移。通過連續(xù)切片發(fā)現(xiàn)HAS2定位于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，敲減HAS2抑制了口腔癌成纖維細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用。本研究通過siRNA下調(diào)胃癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中HAS2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力降低，而且降低了胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)，說明沉默胃癌CAFs中的HAS2，可以抑制胃癌細(xì)胞侵襲、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，HAS2在胃癌成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)胃癌CAFs中HAS2的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞侵襲、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。HAS2是透明質(zhì)酸(haluronic acid、HA)合成所需關(guān)鍵酶，在乳腺癌研究中，HA的合成及表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。因此，胃癌成纖維細(xì)胞中HAS2對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)展的影響是否與透明質(zhì)酸有關(guān)，需進(jìn)一步研究與探討。本研究在體外細(xì)胞水平上進(jìn)行，提示下調(diào)CAFs中HAS2表達(dá)可能是阻礙胃癌進(jìn)展的一個(gè)策略，對(duì)深入研究腫瘤微環(huán)境中CAFs的作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。