王麗， 劉成鳳， 魏麗群， 尚靜， 彭瑛， 張燕

(1.樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院 腫瘤血液科， 四川 樂(lè)山 614000； 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)部， 四川 瀘州 646000； 3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 腫瘤血液二科， 四川 瀘州 646000)

研究發(fā)現(xiàn)，肺癌的已成為了人類死亡的重要因素之一[1-2]。研究指出，非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)患者的預(yù)后不良與腫瘤轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)聯(lián)[3]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是自發(fā)或經(jīng)外界因素進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[4]，腫瘤轉(zhuǎn)移的初始階段癌細(xì)胞可少量存活并形成轉(zhuǎn)移灶[5]。T淋巴細(xì)胞是可被抗原特異性激活的腫瘤免疫應(yīng)答效應(yīng)細(xì)胞[6]，而程序性細(xì)胞死亡配體1(recombinant programmed cell death protein 1 ligand 1，PD-L1)是一種通過(guò)與PD-1受體結(jié)合而調(diào)控免疫應(yīng)答的負(fù)性T細(xì)胞類共刺激分子[7]。PD-L1基因在體內(nèi)廣泛表達(dá)，受體主要為PD-1，因PD-1可對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，因此PD-1配體與其結(jié)合后會(huì)抑制T細(xì)胞活化[8]。腫瘤學(xué)檢查的傳統(tǒng)方法主要是影像學(xué)和組織病理學(xué)方法，但均存在一定的缺點(diǎn)，如影像學(xué)檢測(cè)無(wú)法對(duì)微小轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行發(fā)現(xiàn)和跟蹤，組織病理學(xué)檢查的重復(fù)性差，這些檢查對(duì)腫瘤的發(fā)展進(jìn)程無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[9]。近年來(lái)液態(tài)活檢技術(shù)因循環(huán)腫瘤細(xì)胞獲取簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小、易于連續(xù)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)已成為實(shí)時(shí)療效監(jiān)測(cè)和腫瘤無(wú)創(chuàng)診斷的工具，該技術(shù)發(fā)展?jié)摿薮螅谀[瘤領(lǐng)域具有一定的臨床研究?jī)r(jià)值[10-11]，但關(guān)于外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞活檢技術(shù)用于預(yù)測(cè)臨床療效及預(yù)后的研究較少，且PD-L1蛋白表達(dá)在臨床療效中的診斷效果更為少見(jiàn)，因此本研究擬通過(guò)分析NSCLC患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)與治療效果的相關(guān)性，為NSCLC患者的治療和預(yù)后檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇2018年10月—2019年4月臨床診斷和病理學(xué)分析確診的原發(fā)性NSCLC患者作為實(shí)驗(yàn)組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)NSCLC初治患者；(2)年齡≥18周歲，性別不限；(3)入組前1個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行NSCLC相關(guān)治療；(4)認(rèn)知、精神疾溝通能力均正常；(5)自愿參與本次研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤或全身感染者；(2)合并心、肝、腎等臟器功能不全者；(3)妊娠期或哺乳期者。納入32例患者作為實(shí)驗(yàn)組，男18例、女14例，年齡21～67歲、平均(48.21±6.44)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)21～26 kg/m2、平均(23.32±1.79)kg/m2。同時(shí)選取32例健康志愿者作為對(duì)照組，男20例、女12例，年齡20～70歲、平均(46.79±6.15)歲，BMI 21～25 kg/m2、平均(22.48±1.57)kg/m2。2組受試者一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20180902)。

1.2 方法

1.2.1治療方法 實(shí)驗(yàn)組患者采用替吉奧聯(lián)合奈達(dá)鉑化療，口服替吉奧(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20113281)40 mg/次、2次/d，連續(xù)14 d；靜脈滴注奈達(dá)鉑(江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20064294)、500 mL/次、75 mg/m2溶入生理鹽水、1次/d，連續(xù)42 d。

1.2.2靜脈血采集 采集2組受試者治療前1 d的清晨空腹靜脈血10 mL置于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA；德國(guó)Merck公司)抗凝管中，血液采集完成的1 h內(nèi)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的富集。

1.2.3磁珠富集和循環(huán)腫瘤細(xì)胞評(píng)估 使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的羥乙基淀粉550料液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的泛影葡胺料液制取并過(guò)濾獲取2組受試者的淋巴細(xì)胞分離液，將淋巴細(xì)胞分離液和血液混合加熱至25 ℃，加抗凝血7.5 mL和等量磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS；山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)混勻，緩慢貼壁倒入加熱后的淋巴細(xì)胞分離液上層面，室溫、2 000 r/min離心15 min；取環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層，加PBS 5 mL洗滌處理2次，室溫2 000 r/min離心15 min，并將沉淀細(xì)胞重懸置于磁珠緩沖液(備案號(hào)20180004，洛陽(yáng)吉恩特生物科技有限公司)中，并加抗體20 μL，4 ℃孵育15 min；加磁珠緩沖液2 mL，離心取上層，取重懸細(xì)胞500 μL經(jīng)過(guò)磁珠甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物(methyl methacrylate-styrene copolymer，MS)分流柱，重復(fù)2次洗滌MS分流柱，采集分流出的溶液，室溫3 000 r/min離心15 min，棄上清液，取沉淀物均勻放置于載玻片，風(fēng)干，4%多聚甲醛固定；熒光顯微鏡下觀察循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)(細(xì)胞呈長(zhǎng)型、橢圓形、圓形，其核質(zhì)比血細(xì)胞體積大，淡黃色、棕黃色及棕黑色分別表示弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性)并計(jì)算陽(yáng)性率[12]。

1.2.4PD-L1蛋白檢測(cè) 取富集后循環(huán)腫瘤細(xì)胞玻片，加封閉液，室溫孵育30 min，加稀釋后PD-L1抗體、CD45熒光抗體，室溫孵育2 h，CYP2洗3次、3 min/次，加稀釋后熒光抗體DRG，37 ℃孵育30 min，加DAPI細(xì)胞染色液10 μL，蓋玻片封片，置于熒光顯微鏡下讀片，將PD-L1(+)DAPI(+)CD45(-)的細(xì)胞判定為PD-L1陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞；以人肺腺癌細(xì)胞系NCI-H1975為陽(yáng)性對(duì)照，以健康人外周血作為陰性對(duì)照組。其中PD-L1兔單克隆抗體購(gòu)自上海Roche公司，PD-L1蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2.5血清干擾素-γ(interferon γ，IFN-γ)和群集分化8(cluster differentiation 8，CD8)+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平檢測(cè) 采集實(shí)驗(yàn)組患者治療前1 d清晨空腹靜脈血10 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，使用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒對(duì)血清IFN-γ進(jìn)行檢測(cè)，并于熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算CD8+T細(xì)胞比率。

1.2.6臨床療效和預(yù)后判斷[13]觀察實(shí)驗(yàn)組患者治療結(jié)束后30 d的臨床療效，按RESIST療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，CR(完全緩解)全部病灶消失維持4周，PR(部分緩解)病灶縮小≥30%維持4周，SD(穩(wěn)定)縮小不足30%或增大不足20%，PD(進(jìn)展),病灶增加20%，同時(shí)規(guī)定治療結(jié)束后30 d內(nèi)復(fù)發(fā)為預(yù)后較差，未復(fù)發(fā)為預(yù)后良好。

1.2.7臨床資料收集 收集實(shí)驗(yàn)組患者的臨床指標(biāo)，包括性別、年齡、腫瘤組織學(xué)類型、吸煙、疾病疾病家族史、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤原發(fā)灶(tumor, T)、區(qū)域淋巴結(jié)受累(node, N)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(metastasis, M)及TNM分期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出率明顯高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組受試者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞

2.2 實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PD-L1蛋白的表達(dá)

20例循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)組患者外周血中有14例檢測(cè)到不同程度的PD-L1熒光信號(hào)，陽(yáng)性表達(dá)率為70.00%，其中弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)分別為7、4及3例。見(jiàn)圖1。

弱陽(yáng)性 中等陽(yáng)性 強(qiáng)陽(yáng)性

2.3 實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、組織學(xué)檢測(cè)及疾病家族史等無(wú)關(guān)(P>0.05)，與吸煙、TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

2.4 實(shí)驗(yàn)組患者外周血血清IFN-γ及CD8+ T與循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)與的相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)陰性者血清IFN-γ水平及CD8+T細(xì)胞或單核細(xì)胞比例高于陽(yáng)性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；IFN-γ≤29 ng/L時(shí)與PD-L1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.658，P<0.05)，IFN-γ>29 ng/L時(shí)二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.476，P<0.05)；CD8+T細(xì)胞或單核細(xì)胞比例≤43%時(shí)與PD-L1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.733，P<0.05)，CD8+T細(xì)胞或單核細(xì)胞比例>43%時(shí)二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.357，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)與血清IFN-γ及CD8+T的關(guān)系[n(%)]

2.5 實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與臨床療效及預(yù)后的相關(guān)性

Spearman分析顯示，實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與其臨床療效呈負(fù)相關(guān)(r=-0.622，P<0.001)；實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與其預(yù)后呈負(fù)相關(guān)(r=-0.557，P<0.001)。見(jiàn)表4。

表4 實(shí)驗(yàn)組患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)與臨床療效及預(yù)后的關(guān)系

3 討論

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于其早期癥狀的不明顯性，極易錯(cuò)過(guò)手術(shù)治療的最佳時(shí)間，導(dǎo)致確診時(shí)間較晚，死亡風(fēng)險(xiǎn)較高[14]。因此，早期發(fā)現(xiàn)和診斷是治療肺癌、延長(zhǎng)患者生活質(zhì)量和生存時(shí)間的最好方法[15]。胃癌、胰腺癌及肺癌等多種惡性腫瘤均可通過(guò)誘導(dǎo)PD-L1蛋白高表達(dá)形成機(jī)體免疫抑制性，以此逃避機(jī)體產(chǎn)生的抗腫瘤反應(yīng)[16]。研究報(bào)道，各類腫瘤細(xì)胞內(nèi)PD-L1蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)，且與癌細(xì)胞免疫逃逸相關(guān)[17-18]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白表達(dá)與腫瘤間質(zhì)細(xì)胞有著一定關(guān)系，在原發(fā)性肝癌患者的癌旁單核巨噬細(xì)胞可通過(guò)促進(jìn)PD-L1分子表達(dá)避開(kāi)T細(xì)胞免疫[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢出率實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，且與患者吸煙、疾病分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性，治療后無(wú)論療效如何循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性檢出率均下降，同時(shí)PD-L1蛋白在療效較差組的循環(huán)腫瘤細(xì)胞血液內(nèi)表達(dá)較療效良好組升高，這說(shuō)明PD-L1在NSCLC的肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平高于癌細(xì)胞內(nèi)水平，其陽(yáng)性表達(dá)可能和NSCLC及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有正相關(guān)性，且和預(yù)后具有明顯的負(fù)相關(guān)性。Liu等[21]發(fā)現(xiàn)47例NSCLC患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞及淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率為48.93%、61.70%，同時(shí)其表達(dá)情況與肺癌患者淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分析具有正相關(guān)性，與預(yù)后生存具有負(fù)相關(guān)性；Sughayer等[22]對(duì)208例NSCLC患者體內(nèi)PD-L1蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示PD-L1陽(yáng)性檢出率達(dá)到65.3%，并與淋巴轉(zhuǎn)移和吸煙史呈負(fù)相關(guān)性。上述研究均與本研究結(jié)果相似。

本研究結(jié)果顯示循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)與患者吸煙、疾病分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Spearman分析結(jié)果則提示PD-L1表達(dá)與臨床療效、預(yù)后均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示通過(guò)對(duì)NSCLC患者的外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，有利于探究患者免疫微環(huán)境中的免疫抑制特征，幫助臨床腫瘤免疫治療的有效應(yīng)用。

IFN-γ可提高抗原遞呈能力，提高巨噬細(xì)胞功能，提高Th1細(xì)胞的活性及細(xì)胞免疫力，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化與增殖[23]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子，殺傷抗原物質(zhì)，是機(jī)體重要的免疫防線[24]。本研究中實(shí)驗(yàn)組患者中陰性者血清IFN-γ水平及CD8+T細(xì)胞或單核細(xì)胞比例均高于陽(yáng)性者，且二者與PD-L1蛋白表達(dá)均存在相關(guān)性，這提示NSCLC細(xì)胞可通過(guò)PD-L1分子對(duì)微環(huán)境中IFN-γ水平及CD8+T細(xì)胞或單核細(xì)胞比例進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)免疫功能產(chǎn)生影響，提示通過(guò)監(jiān)測(cè)PD-L1蛋白表達(dá)能夠了解NSCLC患者的免疫能力。然而Nunesx等[25]對(duì)手術(shù)治療NSCLC患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，52例患者組織中PD-L1均表達(dá)，但與患者的年齡、吸煙史、性別、TNM分期等無(wú)相關(guān)性，與患者的預(yù)后效果亦無(wú)關(guān)。這與本研究結(jié)果不同，可能與本研究樣本量較少有關(guān)，今后應(yīng)進(jìn)一步探究，提高研究的準(zhǔn)確性。另外，本研究納入對(duì)象均為初發(fā)NSCLC患者，未對(duì)復(fù)發(fā)NSCLC患者進(jìn)行研究分析，亦可能會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果偏差。

綜上所述，檢測(cè)NSCLC患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的血液中PD-L1表達(dá)情況可幫助指導(dǎo)臨床治療，但對(duì)于實(shí)現(xiàn)NSCLC患者治療效果的評(píng)估仍存在一定的局限性，如PD-L1的表達(dá)受多種因素的影響，從而使得其特異性較差。因此，今后可通過(guò)更為深入的研究確定PD-L1作為預(yù)測(cè)NSCLC治療效果有效生物標(biāo)志物的可行性，并研制出涵蓋多層面的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物體系。