鄧寒霜，楊文怡，賀 博，李 月

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院,陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,陜西 商洛 726000；3.陜西天士力植物藥業(yè)有限公司,陜西 商洛 726000)

中藥淫羊藿具有悠久的應(yīng)用歷史，具有補(bǔ)肝腎、袪風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨等功效，在我國(guó)最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有收錄，列為上品[1～3]。我國(guó)是淫羊藿屬植物地理分布中心，分布有40余種淫羊藿，2005年版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱"藥典")收載淫羊藿藥材的來(lái)源有5種小檗科植物，分別是淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)、朝鮮淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)、箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc) Maxim)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)以及巫山淫羊藿(EpimediumwushanenseT. S. Ying)的干燥地上部分[4]。從2010年起，巫山淫羊藿因?yàn)榕c其他幾種來(lái)源的淫羊藿藥材在化學(xué)成分上有較大的區(qū)別，而被單獨(dú)作為一味中藥收錄于藥典中。自此，藥典關(guān)于淫羊藿藥材的植物來(lái)源開始減少成4種，分別是淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿；同時(shí)，將淫羊藿藥用部位由"干燥地上部分"變更為"干燥葉"[5]。至目前最新發(fā)行的2020年版藥典，淫羊藿藥材來(lái)源一直沿用2010年的相關(guān)規(guī)定[6,7]。為驗(yàn)證淫羊藿藥用部位劃分的合理性，比較淫羊藿植物不同部位中藥用成分含量的差異，以期為擴(kuò)大淫羊藿藥材來(lái)源，減少自然資源的浪費(fèi)提供依據(jù)，本文對(duì)來(lái)自淫羊藿不同部位的樣品材料中幾種有效成分的含量進(jìn)行了對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

淫羊藿原植物，采集自陜西、甘肅等地，由商洛學(xué)院執(zhí)業(yè)藥師李筱鑒定為小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)或柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)，樣品來(lái)源詳細(xì)信息見(jiàn)表1。淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)201516)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；朝藿定A(批號(hào)1804027)、朝藿定B(批號(hào)19071403)、朝藿定C(批號(hào)190625)、寶藿苷Ⅰ(批號(hào)1804026)等對(duì)照品購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

表1 淫羊藿樣品產(chǎn)地信息

檢測(cè)使用的儀器為日本島津公司出品的LC-20A型HPLC儀，配有在線脫氣機(jī)、高壓泵、四元低壓梯度混合裝置、二極管陣列檢測(cè)器、原裝自動(dòng)進(jìn)樣器、原裝柱溫箱、島津LabSolutions色譜工作站等。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將淫羊藿原植物除去雜質(zhì)，按根、莖、葉柄、葉片等不同部位分成4類供試品，干燥后粉碎，過(guò)3號(hào)藥典篩(24目，篩孔內(nèi)徑355 μm±13 μm)，即得供試品粉末。

1.2.2 含量測(cè)定 色譜條件 采用十八烷基鍵合的硅膠色譜柱(250 mm×4.6 mm，填料粒度5 μm)，以乙腈(A)、水(B)為流動(dòng)相，按表2中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，記錄60 min內(nèi)色譜流出曲線。

表2 淫羊藿樣品含量測(cè)定梯度洗脫順序

供試品溶液的制備 取粉碎后通過(guò)三號(hào)藥典篩的樣品0.2 g左右，用萬(wàn)分之一的電子天平準(zhǔn)確稱量樣品的質(zhì)量，將樣品粉末裝于具塞磨口瓶中，加入20 mL稀乙醇作為提取溶劑后，立即塞密，稱取并記錄其重量，采用超聲波提取法提取樣品(功率400 W，頻率50 kHz)，提取時(shí)間為1 h 。提取完成后，取出樣品溶液放冷，再次帶塞稱取瓶中提取溶液的重量與前述記錄比較，補(bǔ)充損失的稀乙醇，將樣品提取溶液搖勻后，用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[7-9]。

對(duì)照品溶液的制備 取朝藿定A、B、C，寶藿苷Ⅰ以及淫羊藿苷等5種待測(cè)組分的對(duì)照品適量，準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量，用甲醇作為溶劑溶解并轉(zhuǎn)移至體積為25 mL的容量瓶?jī)?nèi)，再以甲醇為溶劑定容至刻度，即得對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察結(jié)果

2.1.1 精密度考察結(jié)果 準(zhǔn)確量取上述對(duì)照品的溶液10 μL注入HPLC儀進(jìn)行分析，記錄各組分色譜峰的峰面積，連續(xù)進(jìn)樣5次以上，經(jīng)計(jì)算后得到淫羊藿苷，朝藿定A、B、C和寶藿苷Ⅰ 等5個(gè)組分各自色譜峰峰面積的RSD值分別為0.21%、0.32%、0.24%、0.31%、0.35%，考察結(jié)果證明了儀器具有良好的精密度。

2.1.2 重復(fù)性考察結(jié)果 利用同一個(gè)淫羊藿藥材的樣品粉末，依據(jù)前述的方法處理樣品成為其供試品溶液，重復(fù)處理樣品溶液5份以上，準(zhǔn)確量取該供試品溶液10 μL注入HPLC儀進(jìn)行分析，記錄各組分色譜峰的峰面積，經(jīng)計(jì)算后得到淫羊藿苷，朝藿定A、B、C和寶藿苷Ⅰ 等5個(gè)組分各自色譜峰峰面積的RSD值分別為0.83%、0.87%、0.74%、0.86%、1.01%，表明研究所用供試品制備方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.3 穩(wěn)定性考察結(jié)果 取同一供試品溶液，照1.2.2項(xiàng)中色譜條件，分別間隔0 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，準(zhǔn)確量取該供試品溶液10 μL注入HPLC儀進(jìn)行分析，記錄各組分色譜峰的峰面積，經(jīng)計(jì)算后得到淫羊藿苷，朝藿定A、B、C和寶藿苷Ⅰ 等5個(gè)組分各自色譜峰峰面積的RSD值分別為2.03%、3.46%、2.81%、3.27%、3.79%，穩(wěn)定性考察試驗(yàn)結(jié)果證明供試品的溶液其內(nèi)在品質(zhì)在24 h內(nèi)不會(huì)發(fā)生較大變化。

2.1.4 校準(zhǔn)曲線繪制 分別吸取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ 不同濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，記錄色譜數(shù)據(jù)，以各有效成分的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制校準(zhǔn)曲線，得各對(duì)照品曲線方程如下。

淫羊藿苷：Y=22 990 302.7778X-35 033.3333，R2=0.9999，線性范圍0～0.36 mg·mL-1。

朝藿定A：Y=17 058 760.7143X+3 577.9524，R2=0.9996，線性范圍0～0.32 mg·mL-1。

朝藿定B：Y=19 818 696.4286X-17 005.0000，R2=0.9999，線性范圍0～0.28 mg·mL-1。

朝藿定C：Y=17 023 549.2611X+24 658.8571，R2=0.9991，線性范圍0～0.29 mg·mL-1。

寶藿苷Ⅰ ：Y=29 157 312.4286X+20 219.6640，R2=0.9998，線性范圍0～0.28 mg·mL-1。

各對(duì)照品校準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，混合對(duì)照品及空白對(duì)照色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 淫羊藿樣品含量測(cè)定用對(duì)照品校準(zhǔn)曲線

2.2 含量測(cè)定結(jié)果

淫羊藿藥材不同部位HPLC分析色譜圖見(jiàn)圖2，淫羊藿藥材不同部位有效成分含量測(cè)定結(jié)果表3、圖3。

a.淫羊藿根; b.淫羊藿莖; c.淫羊藿葉柄; d.淫羊藿葉片; e.混合對(duì)照品; f.空白對(duì)照.1.朝藿定A; 2.朝藿定B; 3.朝藿定C; 4.淫羊藿苷; 5.寶藿苷Ⅰ

圖3 8批淫羊藿樣品不同部位中5種有效成分含量平均值比較

表3 淫羊藿藥材不同部位有效成分含量測(cè)定結(jié)果

續(xù)表3 淫羊藿藥材不同部位有效成分含量測(cè)定結(jié)果

由圖2可知，空白對(duì)照色譜圖的基線平穩(wěn)，對(duì)樣品分析無(wú)干擾。相較于淫羊藿根和淫羊藿葉片，淫羊藿莖、淫羊藿葉柄色譜圖中色譜峰的數(shù)目少、峰面積小，表明淫羊藿此2個(gè)部位中含有的化學(xué)物質(zhì)較少。淫羊藿根、淫羊藿葉片色譜圖中色譜峰的數(shù)目更多、峰面積更大，表明淫羊藿根、葉片兩個(gè)部位中含有更豐富的化學(xué)物質(zhì)，有效成分的含量更高。淫羊藿根樣品色譜圖在保留時(shí)間26～28 min間，出現(xiàn)了3個(gè)較為明顯，且在其它樣品色譜圖中未出現(xiàn)的色譜峰，表明淫羊藿根中的化學(xué)成分種類與其它部位不同，淫羊藿根與淫羊藿葉片的藥理作用有區(qū)別。

由表3、圖3可知，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及寶藿苷Ⅰ 5種成分在淫羊藿藥材不同部位中的含量差異較為明顯，其中淫羊藿葉片中有效成分含量最豐富，有4種成分的含量在各部位樣品中最高，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 4種成分含量之和高于藥典"淫羊藿、柔毛淫羊藿、箭葉淫羊藿均不得少于1.5%"的規(guī)定[7]。其次為淫羊藿根，朝藿定A在根中的含量最高；根中前述4種有效成分的含量之和，也能達(dá)到2020年版藥典的要求；淫羊藿莖、淫羊藿葉柄中5種有效成分的含量均較低，幾乎沒(méi)有藥用價(jià)值；寶藿苷Ⅰ的含量，在淫羊藿藥材各部位中的含量均較低。上述檢測(cè)結(jié)果表明，藥典關(guān)于淫羊藿藥用部位為"干燥葉"，且生品藥材中不檢測(cè)寶藿苷Ⅰ的相關(guān)規(guī)定具有一定的合理性。

3 結(jié)論與討論

研究中發(fā)現(xiàn)以2020版藥典淫羊藿項(xiàng)目下規(guī)定的色譜條件，未能使朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷等4種成分獲得良好分離。為解決上述問(wèn)題，本文在新藥典規(guī)定方法的基礎(chǔ)之上，將樣品分析的色譜條件進(jìn)行了調(diào)整。在調(diào)整后的色譜條件下，上述4種成分色譜峰間的分離度均可達(dá)1.5以上，各色譜峰的理論塔板數(shù)均在2.5×104以上。

多年來(lái)，淫羊藿藥材生產(chǎn)中一直視淫羊藿原植物的根、莖、葉柄等部位為雜質(zhì)，造成了一定程度上的資源浪費(fèi)，也增加了生產(chǎn)過(guò)程中能源及人力資源的消耗。為了驗(yàn)證淫羊藿藥用部位劃分的合理性，本研究對(duì)淫羊藿不同部位中有效成分的含量進(jìn)行了對(duì)比分析。由研究結(jié)果可以看出，淫羊藿莖、葉柄中幾乎不含有效成分，在生產(chǎn)中應(yīng)作為雜質(zhì)除去，以增加藥材品質(zhì)。但淫羊藿根中化學(xué)物質(zhì)含量豐富，特別是幾種藥典規(guī)定的指標(biāo)性成分的含量之和可以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，表明淫羊藿根具有一定的藥用開發(fā)價(jià)值。課題組在今后的工作中，將重點(diǎn)對(duì)淫羊藿根的藥理、藥效作用進(jìn)行研究，探明其作為淫羊藿藥材使用的可行性，為拓寬淫羊藿藥用資源奠定基礎(chǔ)。