劉宏 宋奇 王添敏 張慧 翟延君 康廷國

中圖分類號 R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）08-0933-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.07

摘 要 目的：建立同時測定胡桃楸枝和根中沒食子酸、逆沒食子酸、1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖等5個成分含量的方法，并分析枝和根中上述5個成分的含量差異。方法：采用高效液相色譜法，以Agilent Poroshell 120 SB-C18為色譜柱，以水（含0.2%甲酸）-乙腈（含0.2%甲酸）為流動相進行梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為270 nm，進樣量為5 μL。利用獨立樣本t檢驗和偏最小二乘法判別分析對5個成分含量進行比較分析。結(jié)果：沒食子酸、逆沒食子酸、1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.989～63.3、1.58～101、1.01～64.7、3.31～212、3.34～214 μg/mL（r≥0.997 3）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（12 h）試驗的RSD均小于3.2%，平均加樣回收率分別為103.2%、99.1%、101.5%、102.9%、104.7%（RSD分別為4.85%、2.80%、1.31%、2.73%、1.28%）。在胡桃楸枝中，上述成分的平均含量分別為0.296 5、0.621 1、0.562 5、3.111 7、3.451 3 mg/g;在根中，上述成分的平均含量分別為0.673 4、2.755 5、0.964 0、2.946 6、4.836 4 mg/g;在枝、根中上述成分的平均總量分別為8.043 2、12.175 9 mg/g。根中沒食子酸、逆沒食子酸和1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖含量均顯著高于枝中的含量（P<0.05或P<0.01），而枝和根中其余2個成分的含量及5個成分的總量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。偏最小二乘法判別分析所建模型的累積解釋度（R 2X、R 2Y）、累積預(yù)測度（Q 2）分別為0.943、0.745、0.710;模型載荷圖顯示，逆沒食子酸與原點距離最遠，僅逆沒食子酸含量的變量投影重要性值大于1。結(jié)論：成功建立了可同時測定胡桃楸枝和根中5個成分含量的方法。除1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖外，胡桃楸根中其余4個成分的含量及總含量均高于胡桃楸枝，逆沒食子酸是區(qū)分兩類樣品的主要差異成分。

關(guān)鍵詞 胡桃楸;枝;根;沒食子酸;逆沒食子酸;鞣質(zhì);含量測定

Establishment of Content Determination of 5 Components and Their Content Difference Analysis in the Branch and Root of Juglans mandshurica

LIU Hong，SONG Qi，WANG Tianmin，ZHANG Hui，ZHAI Yanjun，KANG Tingguo（School of Pharmacy， Liaoning University of TCM， Liaoning Dalian 116600， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 5 components in the branch and root of Juglans mandshurica as gallic acid，ellagic acid，1，6-di-O-galloyl-β-D-glucose，1，2，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose and 1，2，3，6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose， and to analyze the content difference of above 5 components between the branch and root samples. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Poroshell 120 SB-C18 column with mobile phase consisted of water （containing 0.2% formic acid）-acetonitrile （containing 0.2% formic acid）. A gradient elution was performed at a flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was 270 nm. The sample size was 5 μL. Independent samples t-test and partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA） were applied for statistical analysis of 5 components. RESULTS： The linear range of gallic acid， ellagic acid，1，6-di-O-galloyl-β-D-glucose，1，2，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose and 1，2，3，6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose were 0.989-63.3， 1.58-101，1.01-64.7，3.31-212，3.34-214 μg/mL （r≥0.997 3），respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （12 h） were all lower than 3.2%. The average recoveries of the 5 components were 103.2%（RSD=4.85%），99.1%（RSD=2.80%），101.5%（RSD=1.31%），102.9%（RSD=2.73%） and 104.7%（RSD=1.28%），respectively. The average contents of the above components in the branch of J. mandshurica were 0.296 5，0.621 1，0.562 5，3.111 7 and 3.451 3 mg/g， respectively. The average contents of above components in the root were 0.673 4，2.755 5，0.964 0，2.946 6 and 4.836 4 mg/g， respectively. The total contents of the 5 components in the branch and root of? J. mandshurica were 8.043 2 and 12.175 9 mg/g，respectively. The contents of gallic acid， ellagic acid and 1，6-di-O-galloyl- β-D-glucose in roots were significantly higher than those in branches （P<0.05 or P<0.01）. There were no significant differences in the contents of the other 2 components and the total contents of the 5 components in branches and roots （P>0.05）. The cumulative interpretability （R 2X，R 2Y） and cumulative predictability （Q 2） of the model established by PLS-DA were 0.943，0.745，and 0.710 respectively. The model load diagram showed that the distance between the ellagic acid and the origin was the farthest， and only variable projection importance of the content of the ellagic acid was greater than 1. CONCLUSIONS： The established method can be used for the content determination of 5 components in the branch and root of? ? ?J. mandshurica. Except for 1，2，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose， the contents of other 4 components and total contents of the 5 components in the root of J. mandshurica are higher than those of the branch. Ellagic acid is selected as the potential marker for discriminating the branch and root samples.

KEYWORDS? ?Juglans mandshurica; Branch; Root; Gallic acid; Ellagic acid; Tannins; Content determination

胡桃楸Juglans mandshurica Maxim.為胡桃科植物，又名核桃楸，主要分布于我國東北和華北地區(qū)，其青果皮、樹皮和枝皮為傳統(tǒng)中藥、滿藥[1]。據(jù)考證，該藥以“胡桃”之名入藥的記載始于唐代，《千金食治》和《食療本草》中均有記載[2]?！侗静菥V目》記載，胡桃果實能“補氣養(yǎng)血，潤燥化痰，益命門，利三焦，溫肺潤腸”，胡桃青皮能“止水痢”[3]。滿藥文字記載較少，但滿族人民流傳“楸樹皮，打雞蛋，治癌癥，別小看”之說[4]。現(xiàn)《中藥大辭典（上冊）》以及《遼寧省中藥材標準（第1冊）》中均收載了胡桃楸果（未成熟果實或果皮）和胡桃楸皮（干皮或枝皮），兩者具有清熱解毒、止痢、止痛、抗腫瘤等功效[5-6]。

現(xiàn)代研究表明，胡桃楸的枝、根和未成熟果皮等不同部位均具有抗腫瘤作用，在臨床上可用于治療腫瘤[7-10]。但該藥并未被2020年版《中國藥典》收錄，且其相關(guān)質(zhì)量評價研究也主要集中在未成熟果皮以及有效部位的含量等方面[11-13]，而關(guān)于該植物枝和根的質(zhì)量評價研究較少，亦未見同時測定多個成分含量的報道。本課題組前期采用液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）對胡桃楸中不同部位的化學(xué)成分進行研究，發(fā)現(xiàn)其枝和根中成分類似，均主要含有鞣質(zhì)類化合物，其中1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖含量較高[14]?；诖?，本研究擬建立測定胡桃楸枝和根中3個鞣質(zhì)類成分（1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖）及2個組成鞣質(zhì)類成分的有機酸（沒食子酸、逆沒食子酸）含量的高效液相色譜法（HPLC），并利用獨立樣本t檢驗和偏最小二乘法判別分析法（PLS-DA）對其枝和根中上述5個成分的含量差異進行分析，以期為胡桃楸枝和根的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1260型HPLC儀（美國Agilent公司）、JA21002型電子分析天平（舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、Sartorius型電子天平（德國Sartorius公司）、TDZ4-WS型低速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

40批胡桃楸枝樣品（編號SZ1～SZ40）、23批胡桃楸根樣品（編號SG1～SG23）均為產(chǎn)地自采，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為胡桃科植物胡桃楸J. mandshurica Maxim.的枝或根。胡桃楸枝和根樣品來源信息見表1。

1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖和1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖對照品均由本課題組分離純化，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測定其純度均大于95%;沒食子酸（批號410860050，純度>98%）、逆沒食子酸（批號117710025，純度>98%）對照品均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;乙腈（色譜純）購自德國Merck公司，甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 分別稱取沒食子酸、1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、逆沒食子酸對照品各適量，精密稱定，以50%甲醇（含0.5%甲酸）溶解，配制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.316 7、0.323 3、1.060 0、1.070 0、0.101 0 mg/mL的對照品貯備液。精密量取上述前4種貯備液各1 mL，置于5 mL量瓶中，加入50%甲醇（含0.5%甲酸）稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為0.063 3、0.064 7、0.212 0、0.214 0 mg/mL的沒食子酸、1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖混合對照品貯備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。逆沒食子酸因其在甲醇中溶解度相對較差，故不與其他對照品混合配制。

2.1.2 供試品溶液 將不同批次的胡桃楸枝、根樣品切段，陰干后粉碎。取各樣品粗粉（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入50%甲醇（含0.5%甲酸）10 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率50 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇（含0.5%甲酸）補足減失的質(zhì)量，以4 000 r/min離心5 min，取上清液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以Agilent Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）為色譜柱，Agilent Poroshell 120 SB-C18（5 mm×2.1 mm，2.7 μm）為預(yù)柱，以水（含0.2%甲酸）為流動相A、乙腈（含0.2%甲酸）為流動相B進行梯度洗脫（0～5 min，5%B→10%B;5～25 min，10%B→16%B;25～40 min，16%B→22%B;40～45 min，22%B→45%B;45～50 min，45%B→65% B;50～52 min，65%B→100%B;52～55 min，100%B）;流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為270 nm，進樣量為5 μL。在該色譜條件下，沒食子酸、逆沒食子酸、1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖的色譜峰均能夠較好地分離，分離度均大于1.5;其他成分對待測成分的測定無干擾，理論板數(shù)均大于3 000;空白對照溶液[50%甲醇（含0.5%甲酸）]對測定無干擾，詳見圖1。

2.2.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取逆沒食子酸對照品貯備液和混合對照品貯備液各適量，用50%甲醇（含0.5%甲酸）逐級稀釋，得稀釋倍數(shù)分別為0、2、8、16、64倍的系列對照品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸分析，結(jié)果見表2。

2.2.3 精密度試驗 取胡桃楸枝（編號SZ16）供試品溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、逆沒食子酸、1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖峰面積的RSD分別為0.58%、1.28%、0.29%、0.42%、0.57%（n=6），表明方法精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 精密稱取胡桃楸枝（編號SZ16）粗粉0.2 g，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，代入回歸方程計算含量。結(jié)果，沒食子酸、逆沒食子酸、1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖平均含量的RSD分別為0.47%、3.19%、0.69%、0.93%、0.95%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取胡桃楸枝（編號SZ16）供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、逆沒食子酸、1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖峰面積的RSD分別為0.81%、2.33%、0.89%、0.59%、0.88%（n=6），表明樣品在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的胡桃楸枝（編號SZ16）粗粉6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入與樣品中成分等量的各對照品貯備液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果，沒食子酸、逆沒食子酸、1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖、1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖的平均加樣回收率分別為103.2%、99.1%、101.5%、102.9%、104.7%，RSD分別為4.85%、2.80%、1.31%、2.73%、1.28%（n=6）。

2.3 樣品含量測定

取各批胡桃楸枝、根樣品各適量，分別按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，以原濃度或稀釋/濃縮到適當(dāng)濃度后，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，代入回歸方程計算5個成分的含量，重復(fù)測定2次。采用SPSS 25.0軟件進行獨立樣本t檢驗，比較枝和根樣本中各成分含量的差異，結(jié)果見表3。

由表3可知，1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖在胡桃楸枝和根樣品中的平均含量均為最高，分別為3.451 3、4.836 4 mg/g;1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖的平均含量也較高，分別為3.111 7、2.946 6 mg/g;逆沒食子酸在枝和根中的平均含量差異較大，分別為0.621 1、2.755 5 mg/g;1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖和沒食子酸在枝和根中的平均含量均較低，前者在枝和根中分別為0.562 5、0.964 0 mg/g，后者在枝和根中分別為0.296 5、0.673 4 mg/g。從5個成分的總量看，胡桃楸枝和根中所測含量有所差異，兩者的平均值分別為8.043 2、12.175 9 mg/g。

通過獨立樣本t檢驗顯示，逆沒食子酸在根中的含量顯著高于其在枝中的含量（P<0.01），1，6-二-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖和沒食子酸在根中的含量也顯著高于兩者在枝中的含量（P<0.05）。對于1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖，枝中的含量稍高于根中的含量;對于1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖，根中的含量稍高于枝中的含量，但兩者組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 PLS-DA

為了進一步明確能否通過上述5個成分的含量來區(qū)分胡桃楸枝和根樣品，同時找出對枝和根分類貢獻較大的成分，本研究采用SIMCA-P 12.0軟件對樣品數(shù)據(jù)進行PLS-DA。以63批枝和根樣品中5個成分的含量為變量，得到63×5階數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件建立PLS-DA模型，提取2個主成分，模型的累積解釋度（R 2X、R 2Y）分別為0.943、0.745，累積預(yù)測度（Q 2）為0.710，均大于0.5，說明模型穩(wěn)定可靠[15-16]。設(shè)定置換次數(shù)為200進行置換檢驗，結(jié)果見圖2。由圖2可見，R 2擬合直線與Y軸的截距為-0.018，Q 2擬合直線與Y軸的截距為-0.181，說明模型可靠、無過度擬合[16]。

63批胡桃楸枝和根樣品的PLS-DA得分散點圖見圖3。由圖3A可見，SG4和SG13兩批根樣品分布在95%置信區(qū)間外，說明兩者與其他樣品差異較大。SG4樣品2018年8月采自遼寧省鐵嶺市西豐縣，其中5個待測成分的含量均明顯高于其他樣品;SG13樣品2018年8月采自遼寧省本溪市連山關(guān)鎮(zhèn)，其中逆沒食子酸含量僅次于SG4樣品，高于其他樣品。除上述2批樣品外，其余樣品均在95%置信區(qū)間內(nèi)。由圖3B可見，大部分枝和根樣品分布于不同區(qū)域，區(qū)分較明顯，但仍有4批枝樣品（SZ4、SZ16、SZ24、SZ39）與根樣品無法區(qū)分。

PLS-DA模型載荷圖可反映5個成分含量對判別模型貢獻的大小，離原點越遠的成分對區(qū)別兩組樣品的貢獻越大[16]，結(jié)果見圖4。由圖4顯示，逆沒食子酸（色譜峰4）與根的距離更近，且離原點距離最遠;而其他成分位于根和枝之間，且與原點距離較近。

胡桃楸根和枝中5個成分的變量投影重要性（VIP）值見圖5。由圖5可見，5個成分中只有逆沒食子酸含量的VIP值大于1，說明該成分含量是區(qū)分胡桃楸根和枝樣品貢獻較大的成分[15-16]。

3 討論

胡桃楸中的化學(xué)成分主要有萘醌、鞣質(zhì)、二芳基庚烷、有機酸和黃酮等[17]。本課題組前期對胡桃楸不同部位的LC-MS分析表明，其枝和根中主要含有鞣質(zhì)和有機酸類化合物[14]。其中，1，2，6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖和1，2，3，6-四-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖是枝中含量最高的2個鞣質(zhì)類化合物，兩者在根中含量也較高;同時，本文選擇了與上述2個鞣質(zhì)化合物具有生源關(guān)系的沒食子酸、1，6-二-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖、逆沒食子酸作為含量測定的指標成分。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，上述5個成分對人肝癌細胞HepG2增殖均具有不同程度的抑制作用，因此這些成分能夠為合理評價胡桃楸枝和根的質(zhì)量提供依據(jù)。

本研究采集了東北省不同產(chǎn)地、不同采收時間的40批胡桃楸枝和23批胡桃楸根樣品，樣品量較多、具有一定的代表性。根據(jù)PLS-DA分析結(jié)果，可見大部分樣品數(shù)據(jù)分布在95%置信區(qū)間內(nèi)，但也有個別樣品如SG4和SG13的測定數(shù)據(jù)離群，4個枝樣品SZ4、SZ16、SZ24和SZ39在PLS-DA模型中與根樣品無法區(qū)分。在本研究中，這些樣品的采收和處理與其他樣品并無不同，植物中化學(xué)成分的累積受采收時間、產(chǎn)地、采收加工、生長年限、生境等多因素影響[18]。胡桃楸為野生喬木，大都生長于溝谷兩旁，結(jié)合研究目的本研究明確了采收時間、產(chǎn)地，統(tǒng)一了加工方法，但未對生長年限和生境進行詳細考查，因此尚不能完全闡明幾個樣品數(shù)據(jù)離群的原因。若要進一步明確樣品中成分含量的變化規(guī)律，仍需通過固定部分因素進行詳細考察。

本研究結(jié)果表明，胡桃楸根中所測5個主要成分的總量稍高于胡桃楸枝中的總量，這與以往報道的根中總鞣質(zhì)含量高于枝中總鞣質(zhì)含量基本一致[13]。本課題組前期研究表明，枝和根均主要含鞣質(zhì)但又有所不同，枝中主要為沒食子鞣質(zhì)，根中包括沒食子鞣質(zhì)和逆沒食子鞣質(zhì)而以后者為多[14]。因此，胡桃楸根中合成逆沒食子鞣質(zhì)的前體——逆沒食子酸含量顯著高于枝中的含量，并且該成分也是區(qū)分枝和根樣品的主要差異成分。

綜上所述，本研究成功建立了可同時測定胡桃楸枝和根中5個成分含量的方法。除1，2，6-三-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖外，胡桃楸根中其余4個成分的含量及總含量均高于胡桃楸枝，逆沒食子酸是區(qū)分兩類樣品的主要差異成分。

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（投稿日期：2020-12-02 修回日期：2021-02-24）

（編輯：鄒麗娟）