郝雪潔，陳赫，周效寶，張步云，張安然，王瑞，張海東

1.山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院，山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院），山東 濟南 250062

2.青島阜外心血管病醫(yī)院，山東 青島 266034

3.濟寧市精神病防治院（濟寧市職業(yè)病醫(yī)院），山東 濟寧 272051

4.山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院）基礎醫(yī)學院（基礎醫(yī)學研究所），山東 濟南 250062

矽肺是塵肺中最為常見的一種類型，是由于長期吸入大量游離二氧化硅（SiO2）粉塵所引起，以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的疾病。對于矽肺的發(fā)病機制，細胞因子學說認為，SiO2進入肺部后被肺泡巨噬細胞吞噬，巨噬細胞受到刺激，從而產(chǎn)生大量細胞因子，如白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等，其中TGF-β1被認為是最重要的致纖維化因子，可與下游多種蛋白形成信號通路誘導塵肺病的發(fā)生［1］。因此，阻斷TGF-β1與下游蛋白的聯(lián)系成為研究矽肺臨床治療的一個重要途徑。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族是TGF-β1 的重要下游激酶，可刺激肺纖維化的形成，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（excellular signal-regulated kinase 5，ERK5）是MAPK 家族最后一個被發(fā)現(xiàn)的亞族，其對肺纖維化的作用少有研究，國內(nèi)尚未有明確研究證明TGF-β1/ERK5 信號通路在肺纖維化中的作用，國外也僅有少量報道證明體外實驗中TGF-β1/ERK5 信號通路對肺纖維化有影響［2］。本研究擬通過Disitertide 抑制大鼠體內(nèi)TGF-β1 與其受體的結(jié)合，觀察TGF-β1/ERK5信號通路在肺纖維化中的作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

選取SPF 級Wistar 健康雄性大鼠21 只（購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司），年齡為6～7 周，體重為240～260 g，實驗動物質(zhì)量合格證號為37009200019540號。實驗動物飼養(yǎng)于山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院SPF 屏障動物房，許可證號：SYXK（魯）20140012，溫度21～25℃，相對濕度45%～65%，晝夜交替時間為12 h/12 h，飼養(yǎng)期間動物自由攝食、飲水。飼養(yǎng)條件符合GB 14925—2010《實驗動物環(huán)境及設施》有關要求。本研究經(jīng)山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院動物倫理委員會批準（審批號：2019-16）。

1.2 主要儀器和試劑

偏振光顯微鏡（日本尼康有限公司），灰度分析 軟件（美國Alpha Innotech 公 司），SiO2粉 塵（美國Sigma 公司），ELISA 檢測試劑盒（中國武漢華美生物工程有限公司），TGF-β1 抑制劑Disitertide（美國MCE 公司），兔抗鼠絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MEKK）2、MEKK3、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶5（phospho-mitogen activated protein kinase kinase 5，P-MEK5）（英國 Abcam 公司），兔抗鼠磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（phospho-excellular signal-regulated kinase 5，P-ERK5）（德國CST 公司），IRDye680RD 羊抗兔抗體（美國Li-COR 公司），BCA 蛋白定量檢測試劑盒（中國武漢塞維爾生物科技公司）。

1.3 動物分組與染毒方法

大鼠適應性飼養(yǎng)7 d 后，隨機分為對照組（7 只）、模型組（7 只）和干預組（7 只）。用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl 溶 液配制100 mg·mL-1的SiO2粉 塵（質(zhì)量分 數(shù)80%，粉塵粒徑為1～5 μm）懸浮液，采用一次性非暴露氣管染塵法建造大鼠急性矽塵暴露模型，對照組大鼠經(jīng)同樣的方法氣管灌注1 mL 滅菌生理鹽水。造模完成24 h后，干預組大鼠腹腔注射Disitertide溶液0.8 mL（1 mg Disitertide粉末溶解于1 mL DMSO和9 mL生理鹽水混合液中），模型組大鼠腹腔注射同比例溶劑0.8 mL（1 mL DMSO混合9 mL生理鹽水），每3 d注射一次，共注射9 次。此染毒劑量和染毒頻率的成本較低且能較好地抑制TGF-β1 表達［3］。每天觀察大鼠一般情況，記錄大鼠體重變化。

1.4 肺濕重稱重及肺組織病理學檢查

造模后28 d，各組大鼠腹腔注射體積分數(shù)為10.0%的水合氯醛溶液麻醉，以心臟取血法處死，取肺組織稱重。稱重后取大鼠左肺上葉同一部位制備石蠟標本，用4℃、質(zhì)量分數(shù)為0.9%的氯化鈉溶液沖洗后，立即置于體積分數(shù)為4.0%的多聚甲醛溶液中固定24 h 以上，常規(guī)取材脫水、石蠟包埋，左肺行HE 染色、Masson染色，以3D Histech 掃描儀掃描病理切片，觀察大鼠肺組織病理學改變情況。

1.5 Western blotting 法檢測肺組織中MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5蛋白表達

剪取大鼠右肺下葉組織100 mg 放在離心管中置于碎冰上，研磨成漿，用RIPA蛋白裂解液抽提總蛋白，通過蛋白定量試劑盒，采用Brandford 法進行蛋白定量。每個樣取20 μg 在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠中電泳、轉(zhuǎn)膜。用質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂奶粉封閉2 h 后與一抗抗體孵育過夜，第二天與二抗抗體孵育1 h 后成像。

1.6 ELISA法檢測血清中TGF-β1

將血漿用離心機以3 000～3 500 r·min-1離心5 min（離心半徑10 cm），取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測細胞因子TGF-β1 水平。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗服從正態(tài)分布，以±s描述，多組間均數(shù)比較采用完全隨機設計資料的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t方法。檢驗水準α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

造模后第3 天時，對照組、模型組和干預組體重差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）；第14 天時，與對照組大鼠相比，模型組和干預組大鼠體重降低（P< 0.05），與模型組相比，干預組大鼠體重升高（P< 0.05）；第28 天時，與對照組相比，模型組和干預組大鼠體重均降低（P< 0.05）。第28天時，與對照組相比，模型組和干預組肺濕重、肺臟比升高（P< 0.05），與模型組相比，干預組肺濕重、肺臟比降低（P< 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體重、肺濕重及肺臟比（n=7，±s）Table 1 Body weight, lung wet weight, and lung coefficient of rats (n=7, ±s)

表1 各組大鼠體重、肺濕重及肺臟比（n=7，±s）Table 1 Body weight, lung wet weight, and lung coefficient of rats (n=7, ±s)

［注］a：與同時間對照組比，P < 0.05；b：與同時間模型組比，P < 0.05。

組別體重/g肺濕重/g 肺臟比第3天 第14天 第28天對照組 282.29±5.71 367.86±9.56 389.29±15.78 1.65±0.10 0.42±0.03模型組 288.29±13.38 331.00±16.21a 356.29±25.23a 3.12±0.36a 0.88±0.09a干預組 281.14±9.81 350.86±15.81ab 361.14±11.78a 2.73±0.30ab 0.75±0.09ab F 1.01 11.83 6.51 52.94 71.7 P 0.386 0.001 0.007 <0.001 <0.001

2.2 大鼠肺組織HE染色結(jié)果

第28 天時，對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，組織結(jié)構(gòu)正常（圖1A）；模型組大鼠肺組織呈肺氣腫樣改變，肺泡壁增厚，肺泡腔大小不一，局部可見單核細胞聚集成團（圖1B）；干預組大鼠組織肺泡壁略增厚，肺泡數(shù)較模型組增多，有輕微肺氣腫樣改變（圖1C）。見圖1。

圖1 大鼠肺組織HE染色結(jié)果Figure 1 HE staining results of rat lung tissues

2.3 大鼠肺組織Masson染色結(jié)果

第28天時，對照組大鼠未見明顯的藍色膠原產(chǎn)生（圖2A）；模型組可見藍色膠原分布，且有明顯纖維性結(jié)節(jié)產(chǎn)生（圖2B）；干預組大鼠肺組織內(nèi)有少量藍色膠原分布，有少量且小的結(jié)節(jié)產(chǎn)生（圖2C）。見圖2。

圖2 大鼠肺組織Masson染色結(jié)果Figure 2 Masson staining results of rat lung tissues

2.4 大鼠肺組織MEKK2、MEKK3、MEK5、P-ERK5蛋白表達變化

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，各組大鼠肺組織中MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 蛋白表達水平均發(fā)生改變。與對照組相比，模型組和干預組大鼠肺組織各蛋白表達水平均升高（P< 0.05）；與模型組相比，干預組大鼠MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 蛋白表達水平均降低（P< 0.05）。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠肺組織中相關蛋白的表達Figure 3 Relative expression levels of target proteins in lungtissues of rats

表2 各組大鼠肺組織MEKK2、MEKK3、MEK5、P-ERK5蛋白的相對表達變化Table 2 Relative expression levels of MEKK2, MEKK3, MEK5, and P-ERK5 in lung tissues of rats

2.5 大鼠血清TGF-β1質(zhì)量濃度

第28天時，對照組大鼠血清中TGF-β1表達量為（211.98±25.37）pg·mL-1，模型組為（577.02±35.43）pg·mL-1，干預組為（274.84±39.42）pg·mL-1。與對照組相比較，模型組、干預組大鼠血清TGF-β1質(zhì)量濃度升高（P< 0.05），與模型組相比較，干預組大鼠血清TGF-β1 質(zhì)量濃度降低（P< 0.05）。

3 討論

本實驗采用一次性非暴露式氣管灌注法建立大鼠矽肺模型，通過Disitertide 抑制TGF-β1 的表達，模型組大鼠肺濕重和肺臟比較對照組升高，干預組較模型組降低，HE、Masson染色后，模型組可見纖維性結(jié)節(jié)形成，干預組較模型組結(jié)節(jié)小且少，這與高芳瑜等［4］研究結(jié)果類似，表明矽肺模型造模成功。

研究表明，SiO2進入機體后與效應因子相互作用，活化細胞因子TGF-β1，TGF-β1 作為重要的促肺纖維化調(diào)控因子，可以促進肺成纖維細胞過度增殖及細胞外基質(zhì)的聚集，導致組織結(jié)構(gòu)破壞，當纖維化程度加重時，TGF-β1 表達增多［5-6］。ERK5 是TGF-β1 的下游信號分子，幾乎在所有細胞中都有表達，能夠被一些有絲分裂原和細胞應激等刺激因素激活。例如，當生長因子、氧化或高滲透壓發(fā)生變化時，細胞外信號首先刺激MEKK2/MEKK3，然后磷酸化MEK5，P-MEK5再激活ERK5，P-ERK5 從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核，從而將信號從細胞外傳遞到細胞內(nèi)，以活化底物［7］。Kadoya 等［2］通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/ERK5 信號通路對肺纖維化有促進作用，為探討體內(nèi)實驗中TGF-β1/ERK5 信號通路對矽肺纖維化的影響，本實驗通過Disitertide展開研究。

Disitertide 是一種肽型TGF-β1 抑制劑，用于阻斷與其受體的相互作用。Yang 等［8］采用Disitertide 研究發(fā)現(xiàn)，miR-590 可以通過TGF-β1/磷脂酞肌醇3 激酶（phosphatidyl inositol 3 kinase，PI3K）/絲氨酸蘇氨酸激酶（silk threonine protein kinase，Akt）信號通路的傳導介導骨關節(jié)炎并調(diào)節(jié)骨細胞凋亡；He 等［9］采用Disitertide 研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞在晚期胃癌耐藥性的形成中起著重要作用，而作用于TGF-β1 信號通路可能是抑制這種化學耐藥性的潛在策略。這些實驗結(jié)果表明Disitertide 可以有效抑制TGF-β1 的表達，為本實驗研究提供依據(jù)。

本研究TGF-β1含量測定結(jié)果顯示，干預組較模型組TGF-β1表達大量減少，表明Disitertide效果較好，可達到抑制TGF-β1表達的目的。與對照組相比，模型組和干預組MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 的表達量均出現(xiàn)明顯升高，提示ERK5及其相關蛋白可能與肺纖維化的進展密切相關；與模型組相比，干預組各蛋白表達均有下降，提示與Disitertide 阻斷了TGF-β1/ERK5信號通路中MEKK2、MEKK3、P-MEK5、P-ERK5 的表達有關，結(jié)合大鼠肺部病理學觀察，證明TGF-β1/ERK5信號通路對大鼠矽肺纖維化有影響，抑制TGF-β1/ERK5信號通路，可能對急性矽塵暴露導致的肺部損傷起一定的保護作用。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠矽肺纖維化進程中，抑制TGF-β1 能夠抑制ERK5 等相關蛋白表達，這與Badshah 等［10］的研究結(jié)果類似；Disitertide 在抑制肺泡炎、肺纖維化、膠原纖維方面和調(diào)控TGF-β1/ERK5信號通路中各蛋白表達方面都起著顯著作用，證明了抑制TGF-β1/ERK5 信號通路能夠抑制矽肺纖維化，這為矽肺的臨床防治提供了新的指標。在生產(chǎn)生活中，矽肺纖維化患者多為反復吸入游離SiO2粉塵，因而抑制TGF-β1/ERK5 信號通路對矽肺纖維化患者能發(fā)揮多少作用尚未可知，且本實驗為通過抑制TGF-β1 來抑制ERK5，關于直接抑制ERK5 能否減緩矽肺纖維化尚缺乏有效實驗。此研究為初步研究，若想證明臨床上長期應用TGF-β1 抑制藥物或ERK5 抑制藥物能否延緩或減輕矽肺纖維化以及是否會引起副作用，有待進一步研究。