何邵波，蔣傳命

邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000

鎘作為常見的具有高毒性的重金屬污染物，通常以二價(jià)化合物的形式存在于水體和土壤中［1］。鎘目前已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為強(qiáng)致癌物質(zhì)，由于其分布廣、半衰期長(zhǎng)以及易攝取等特點(diǎn)，容易在動(dòng)物體內(nèi)積累，從而導(dǎo)致慢性中毒，如腎中毒［2］。長(zhǎng)時(shí)間鎘暴露也可引起器官纖維化或衰竭［3］，甚至癌癥［4］。鎘導(dǎo)致上述疾病的機(jī)制可能與細(xì)胞所受的外界刺激密切相關(guān)：當(dāng)刺激較大時(shí)，細(xì)胞死亡途徑被激活從而介導(dǎo)細(xì)胞死亡；而當(dāng)刺激不足以導(dǎo)致細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞可能失控而出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化［5］。鎘暴露導(dǎo)致的細(xì)胞死亡可分為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，現(xiàn)階段關(guān)于凋亡的研究較多，主要有凋亡樣、Caspase 依賴或非依賴的細(xì)胞凋亡途徑。

細(xì)胞壞死包括程序性壞死和非程序性壞死［6］。其中，細(xì)胞程序性壞死通常與活性氧（reactive oxygen species，ROS）導(dǎo)致的膜脂過氧化，ATP 產(chǎn)生不足導(dǎo)致的質(zhì)膜離子泵功能紊亂，以及有毒物質(zhì)的直接化學(xué)攻擊有關(guān)［6］。以往的研究大多關(guān)注鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，而其導(dǎo)致細(xì)胞程序性壞死的機(jī)制目前僅有少量報(bào)道。研究表明腸外急性鎘暴露可導(dǎo)致大鼠睪丸和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物睪丸出血壞死，而急性口服鎘溶液則可引起胃和腸黏膜壞死［7］。同時(shí)也有研究報(bào)道，濃度大于50 μmol·L-1的氯化鎘會(huì)引起腎細(xì)胞壞死，而低濃度鎘會(huì)引起細(xì)胞凋亡［8］。最新的研究也顯示重金屬鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過調(diào)控淋巴細(xì)胞的miR-216a-PI3K/AKT信號(hào)途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡和壞死［9］。此外，關(guān)于骨肉瘤的一項(xiàng)異種移植研究發(fā)現(xiàn)，鎘誘導(dǎo)骨肉瘤壞死并降低骨肉瘤殘余細(xì)胞的存活能力［10］。

細(xì)胞程序性壞死并不是一個(gè)孤立的生物學(xué)過程，細(xì)胞自噬在細(xì)胞程序性壞死過程中發(fā)揮作用。自噬的發(fā)生及發(fā)展受到精密調(diào)控，從自噬相關(guān)基因1（autophagy related gene 1，Atg1）發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在酵母以及哺乳動(dòng)物中相繼鑒定出了一系列自噬相關(guān)基因［11］，其中自噬相關(guān)基因8（autophagy related gene 8，Atg8）［哺乳動(dòng)物中為自噬微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3），包 括LC3A～C］，由于其能結(jié)合到自噬體膜的脂質(zhì)分子上，其活化形式可以作為自噬發(fā)生的標(biāo)志之一［12］。相反，若細(xì)胞或組織中自噬降解底物p62 蛋白積累或陽(yáng)性，則說(shuō)明自噬流被阻斷［13］。在神經(jīng)細(xì)胞中有研究表明細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡可以共同調(diào)控細(xì)胞死亡［14］。

為探究鎘誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死的機(jī)制，本研究將以小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞為材料，首先用氯化鎘處理細(xì)胞計(jì)算其存活率，然后用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)其細(xì)胞周期和細(xì)胞程序性壞死相關(guān)基因［受體相互作用絲氨酸蘇氨酸激酶3（receptor interacting serine threonine kinase 3，RIPK3）和混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）］轉(zhuǎn)錄水平，最后檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白p62 的蛋白表達(dá)水平以及p62和LC3-B 蛋白的熒光積累量，探討鎘誘導(dǎo)細(xì)胞程序性壞死是否依賴細(xì)胞自噬途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Sigma，美國(guó)），NeurobasalTMMedia（Gibco，美國(guó)），HBSS 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），Trypsin（Sigma，美國(guó)），胎牛血清（Gibco，美國(guó)），p62 抗 體（Sigma，美 國(guó)），GAPDH 抗 體 （TransGen Biotech，中國(guó)），羊抗鼠IgG-HRP 抗體（TransGen Biotech，中國(guó)），GFP-LC3-B 腺病毒、mCherry-p62 腺病毒（Beyotime，中國(guó)），氯化鎘（國(guó)藥，中國(guó)），多聚甲醛（國(guó)藥，中國(guó)），碘化丙啶（propidium iodide，PI）、臺(tái)盼藍(lán)、天冬氨酸蛋白酶抑制試劑Pepstatin A、絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑Leupeptin（Sigma，美國(guó)），RNase A、HEPES、PBS、NaCl、Glycerol、PMSF、Triton-X（上海生工，中國(guó)），WB 增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（Vazyme，中國(guó)），RNA 提取以及實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（上海生工，中國(guó)），BCA 試劑盒（Beyotime，中國(guó)），Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒（BestBio，中國(guó)）。

-80℃超低溫冰箱（Thermo，美國(guó)），7500 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI，美國(guó)），IX73 型倒置顯微鏡（Olympus，日本），H2050R 高速冷凍離心機(jī)（湘儀，中國(guó)），二氧化碳培養(yǎng)箱（Salvis，瑞士），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Molecular devices，美國(guó)），BD LSR Fortessa 流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）。

1.2 原代小鼠神經(jīng)元的分離和培養(yǎng)

取妊娠10～12 d 的ICR 小鼠（25～30 g）脫臼處死，用75%的乙醇浸泡15 min，在生物安全柜中取出小鼠子宮，放置于4℃預(yù)冷的HBSS 中備用。然后迅速取出胎鼠再在解剖鏡下剝離大腦皮質(zhì)置于培養(yǎng)皿中。將上述組織剪碎后轉(zhuǎn)移至離心管中，用體積分?jǐn)?shù)0.01%的胰酶消化至組織塊逐漸消失。取等量的含10% FBS 的DMEM輕輕吹打終止消化，100×g離心5 min，棄上清，用1 mL NeurobasalTMMedia重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取1×106個(gè)細(xì)胞接種于經(jīng)10 ng·L-1多聚賴氨酸包被過的6 孔板中培養(yǎng)，體積2 mL。每48 h進(jìn)行培養(yǎng)基半量換液，經(jīng)3次換液后即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)［15］。本實(shí)驗(yàn)已通過邵陽(yáng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（無(wú)編號(hào)）。

1.3 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率

取1×106個(gè)小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞接種到含2 mL 培養(yǎng)液的12 孔板中（經(jīng)10 ng·L-1多聚賴氨酸包被），培養(yǎng)2 d 后用10 μmol·L-1氯化鎘（用超純水配制）處理2、4、6、12、24、48 h，用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。

1.4 流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期和細(xì)胞程序性壞死

取1×106個(gè)小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，分別用10 μmol·L-1氯化鎘處理24、48 h。胰酶消化并離心收集細(xì)胞，棄上清，用預(yù)冷PBS 洗細(xì)胞兩次，加入預(yù)冷70%乙醇固定。然后離心去上清并用1 mL 的PBS洗一次，加入500 μL PBS（含40 mg·L-1PI、100 mg·L-1RNase A），4℃避光處理30 min 后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

通過Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞程序性壞死水平，將10 μmol·L-1氯化鎘處理48 h，細(xì)胞消化重懸后，1×PBS清洗3次，然后200 μL的1×PBS重懸，依次加入Annexin V-FITC及PI染色液，室溫孵育30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞程序性壞死狀況。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)細(xì)胞程序性壞死相關(guān)基因

參照試劑盒（上海生工）的說(shuō)明書進(jìn)行了RNA 提取以及實(shí)時(shí)熒光定量。引物序列如下，Actin正向引物：5’-CAACGAGCGGTTCCGATG-3’，Actin反向引物：5’-GCCACAGGATTCCATACCCA-3’；RIPK3正向引物：5’-GAAGACACGGCACTCCTTGGTA-3’，RIPK3反向引物：5’-GGTGGTTCTTGA TG ACGGAGTTC-3’；MLKL正向引物：5’-CTGAGGGAACTGCTGGATAGAG-3’，MLKL反向引物：5’-TAGTCGTCGAGGTCAAAGGAGC-3’。基因反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增程序如下：50℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火、延伸，采集熒光信號(hào)30 s，共擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。

1.6 自噬相關(guān)蛋白p62和LC3-B 蛋白檢測(cè)

1.6.1 蛋白免疫印跡法檢測(cè)p62 蛋白含量原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，分 別用5、10、20 μmol·L-1氯化鎘處理24 h 后用離心管收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 沖洗兩次，加入1 mL 預(yù)冷的裂解緩沖液［含50 mmol·L-1HEPES（pH=7.4）、137 mmol·L-1NaCl、10% Glycerol、1%TritonX-100、Pepstatin A（1 mg·L-1）、Leupeptin（1 mg·L-1）、PMSF（1 mmol·L-1）］置于冰上，超聲裂解10 s，冰浴10 min。13 000×g，4℃離心10 min，取上清，用BCA試劑盒（碧云天）測(cè)定蛋白濃度［16］。一抗p62、GAPDH按照1∶3 000的比例用PBST 進(jìn)行稀釋，4℃孵育過夜。經(jīng)PBST 漂洗后，二抗羊抗鼠IgG-HRP以1∶4 000進(jìn)行稀釋，室溫孵育2 h，用PBST漂洗后進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.2 顯微熒光觀察法檢測(cè)p62 和LC3-B 蛋白積累水平將5×106個(gè)小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞接種到含2 mL 培養(yǎng)基的6 孔板（已用多聚賴氨酸包被）上培養(yǎng)1 d，然后用GFP-LC3-B、mCherry-p62 腺病毒感染細(xì)胞24 h，用于標(biāo)記LC3-B、p62（熒光顯微鏡下分別顯示為綠色熒光、紅色熒光）。用10 μmol·L-1氯化鎘處理上述細(xì)胞，每個(gè)處理組設(shè)6 個(gè)平行重復(fù)，處理完畢后將所含有細(xì)胞的蓋玻片用PBS 漂洗3次，用4%多聚甲醛于室溫固定45 min，PBS 漂洗3 次，封片，于熒光顯微鏡下成像拍照［17］。饑餓細(xì)胞（即營(yíng)養(yǎng)匱乏，用HBSS 培養(yǎng)基代替DMEM 培養(yǎng)基）作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 鎘離子導(dǎo)致原代小鼠神經(jīng)元細(xì)胞活力降低

如圖1所示，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色以及統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，用鎘離子處理4 h 后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05）。

圖1 不同染毒時(shí)間10 μmol·L-1氯化鎘處理組小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞存活率（n=6）Figure 1 Survival rate of mouse primary neurons treated with 10 μmol·L-1 CdCl2 for different exposure time (n=6)

2.2 鎘離子導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯G0期

如圖2所示：對(duì)照組49.62%細(xì)胞停留在G0―G1期，10 μmol·L-1鎘離子處理24 h 組60.88%細(xì)胞停留在G0―G1期，處理48 h組82.94%細(xì)胞停留在G0―G1期。

圖2 鎘離子處理后小鼠原代神經(jīng)元經(jīng)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果Figure 2 Cell cycle of mouse primary neurons after treatment with cadmium ions

2.3 鎘離子處理導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞程序性壞死

相對(duì)于對(duì)照組而言，經(jīng)10 μmol·L-1鎘離子處理48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)PI 單染陽(yáng)性的水平明顯提高（47.50%）（圖3A、3B）。進(jìn)一步熒光定量PCR 結(jié)果顯示，經(jīng)鎘離子處理后，細(xì)胞程序性壞死相關(guān)基因RIPK3以及MLKL的mRNA水平是對(duì)照組的6.9 倍和3.7 倍（圖3C）。

圖3 小鼠原代神經(jīng)元經(jīng)鎘離子處理48 h后細(xì)胞程序性壞死水平Figure 3 Cell necroptosis of mouse primary neurons after treatment with cadmium ions for 48 h

2.4 鎘離子處理導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞自噬流阻斷

蛋白免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4A），經(jīng)5、10、20 μmol·L-1氯化鎘處理24 h后小鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p62 表達(dá)分別上調(diào)（587±17）%、（609±14）%、（893±16）%。進(jìn)一步，熒光檢測(cè)細(xì)胞自噬流的關(guān)鍵指標(biāo)LC3-B發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，經(jīng)10 μmol·L-1氯化鎘處理后GFP-LC3-B斑點(diǎn)數(shù)量明顯增多，熒光強(qiáng)度提高約3.24倍（圖4B）。GFP-LC3-B和mCherry-p62熒光位置能完全疊加，鎘離子處理組GFP-LC3-B 和mCherry-p62 熒光斑點(diǎn)數(shù)量和亮度高于對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（圖4C）。

圖4 鎘離子染毒后小鼠原代神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 4 Expressions of autophagy-related proteins in mouse primary neurons after treatment with cadmium ions

3 討論

鎘離子污染引起的人群健康風(fēng)險(xiǎn)近年來(lái)越來(lái)越受到學(xué)者們的重視［18］，其不僅可以影響基因表達(dá)，抑制DNA 損失修復(fù)，也可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等［19］。然而，鎘引起神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死的具體機(jī)制仍有待深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)鎘離子可通過抑制小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞的自噬流進(jìn)而引起細(xì)胞程序性壞死。當(dāng)小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)10 μmol·L-1鎘離子處理后，細(xì)胞活性在4 h 后開始降低，且處理時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞活力降低越明顯（圖1）。本研究推測(cè)細(xì)胞活力降低的原因主要有二：其一，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，10 μmol·L-1鎘離子處理24 h 或48 h 分別有60.88%或82.94%停留在G0―G1 期，無(wú)法進(jìn)入S 期（圖2）；其二，細(xì)胞程序性壞死檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)鎘離子處理的細(xì)胞，其細(xì)胞程序性壞死率可達(dá)47.50%（圖3），證實(shí)鎘離子能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞活力。

目前，對(duì)細(xì)胞程序性壞死機(jī)制的研究主要集中在腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）介導(dǎo)的通路［20］。TNF首先與其受體腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）結(jié)合，然后招募RIPK1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptorassociated factor 2，TRAF2）、凋亡抑制蛋白1/2（cellular inhibitor of apoptosis protein-1/2，cIAP1/2）以及線性泛素鏈組裝復(fù)合物（linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC）等蛋白形成復(fù)合物I，其解聚可進(jìn)一步形成復(fù)合物 II-a、II-b 和 II-c，前兩者與細(xì)胞凋亡相關(guān)，而 II-c又稱壞死體，則與細(xì)胞程序性壞死有關(guān)［21］。細(xì)胞程序性壞死的過程依賴激酶RIPK1、RIPK3 以及MLKL 的表達(dá)［22］。本研究發(fā)現(xiàn)鎘離子處理神經(jīng)元細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)了大量的碎片化，其細(xì)胞程序性壞死率可達(dá)47.50%，同時(shí)，經(jīng)鎘離子處理后RIPK3以及MLKL轉(zhuǎn)錄水平也明顯上升（圖3B），說(shuō)明鎘暴露確實(shí)導(dǎo)致了細(xì)胞程序性壞死。此研究為明確鎘離子引起神經(jīng)元細(xì)胞程序性壞死提供了較直接的依據(jù)。

另外，本研究證明了鎘離子引起小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死的機(jī)制與細(xì)胞自噬密切相關(guān)。當(dāng)用鎘離子處理小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞后，p62 蛋白表達(dá)水平明顯上升，同時(shí)通過熒光觀察發(fā)現(xiàn)GFP-LC3-B 和mCherry-p62 斑點(diǎn)的數(shù)量也明顯增多（圖4）。p62 以及GFP-LC3-B常被作為自噬流的檢測(cè)指標(biāo)，細(xì)胞內(nèi)p62表達(dá)上升以及GFP-LC3-B 數(shù)量增多，通常提示自噬流受阻。因此，本研究結(jié)果說(shuō)明鎘離子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞程序性壞死與自噬流阻滯有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明鎘離子可通過誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)細(xì)胞自噬流阻滯進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞程序性壞死。但鎘離子經(jīng)細(xì)胞自噬依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過程中的分子機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步探究。