李娟，賀玲，王春枝，馬艷美，張競方，安珍，姜靜，吳衛(wèi)東

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003

2.陸軍第八十三集團(tuán)軍醫(yī)院眼耳鼻喉科，河南 新鄉(xiāng) 453003

近年來，伴隨經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，大氣污染已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)影響生態(tài)環(huán)境和人群健康的主要因素。細(xì)顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）是大氣污染物的主要成分之一，也是近年來我國霧霾污染的首要成因，可以對人體造成潛在的健康危害［1］。雖然近幾年來我國各地區(qū)大氣中PM2.5的濃度較前期有所下降，但是其濃度仍然較高。大量的研究證實(shí)PM2.5可以損害機(jī)體多種組織器官，尤以呼吸系統(tǒng)最為嚴(yán)重［2-4］。北京地區(qū)2004―2009年間，PM2.5質(zhì)量濃度（后簡稱：濃度）每升高10 μg·m-3，呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率分別升高4.60%（95%CI：3.84%～4.60%） 和4.48%（95%CI：3.53%～5.41%）［5］。我國的PM2.5污染與工業(yè)生產(chǎn)、城市化進(jìn)程和汽車保有量等社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展各類因素有關(guān)，我國大多數(shù)城市居民在較長時(shí)期內(nèi)可能仍然會(huì)生活在PM2.5等大氣污染物超標(biāo)的環(huán)境中。

我國大氣中PM2.5的來源及形成原因復(fù)雜且其毒性組分和致病機(jī)制尚不清楚，因此在研究方面不能完全照搬國外的研究模式和結(jié)果解析，要結(jié)合我國的大氣污染物的特點(diǎn)來開展對其組分的毒理學(xué)和健康危害研究。流行病學(xué)及毒理學(xué)研究結(jié)果均顯示，PM2.5的毒性效應(yīng)除與其濃度有關(guān)外，還與其組分密切相關(guān)［6-7］。

大量PM2.5成分分析發(fā)現(xiàn)，PM2.5重金屬含量較高，而鋅離子（Zn2+）是大氣顆粒物的主要水溶性金屬成分［8］。已有研究表明，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物吸入或灌注外源性鋅離子可以誘發(fā)其急性呼吸道炎癥損傷［9］。課題組前期發(fā)現(xiàn)鋅含量較高的大氣PM10和外源性鋅離子溶液對人呼吸道上皮細(xì)胞和動(dòng)物肺臟具有急性炎性作用［10］，并且外源性鋅離子可能引起環(huán)境氧化性肺損傷［11］。本研究擬構(gòu)建PM2.5暴露的小鼠動(dòng)物模型，進(jìn)一步探討PM2.5及鋅離子是否引起機(jī)體肺臟炎性損傷。

1 對象與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用6～8周齡雄性BALB/c小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），共計(jì)24 只。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院IVC 動(dòng)物房并適應(yīng)性飼養(yǎng)一周（19～22℃，濕度40%～70%）。本實(shí)驗(yàn)已通過新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)審查（無編號）。

1.1.2 主要儀器與試劑大流量粉塵采樣器（T-6070C，Tisch Environmental，美國），真空冷凍干燥機(jī)（2-4LD Plus，Christ，德國），光學(xué)顯微鏡（Motic AE2000，麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司，中國），酶標(biāo)儀（Enspire，PerkinElmer，美國），超聲清洗儀（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司，中國），流式細(xì)胞儀（Accuri C6，BD，美國），ZnSO4（Sigma，美國），BCA蛋白測定試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，中國），白介素（interleukin，IL）-1β 檢測試劑盒（深圳達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司，中國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PM2.5 收集、分析和懸液的制備本研究采集地點(diǎn)位于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科技樓頂部（距離地面30 m），采樣點(diǎn)周邊無明顯遮擋物及污染源。使用大流量采樣器將PM2.5收集在玻璃纖維濾膜上。采樣時(shí)間：2015年11月―2016年3月（雨雪天和大風(fēng)天除外），每次連續(xù)采樣24 h，采樣流量100 L·min-1。采樣結(jié)束后用錫箔紙包裹采樣膜保存。實(shí)驗(yàn)前將玻璃纖維濾膜裁剪至2 cm×4 cm 的長條狀，隨后轉(zhuǎn)移至燒杯后加入50 mL超純水，使用超聲清洗儀震蕩3 次，每次20 min。使用8 層紗布過濾顆粒物混懸液后將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干、干燥。將獲取的顆粒物于-20℃冰箱內(nèi)避光保存。實(shí)驗(yàn)使用前用磷酸鹽緩沖液配成PM2.5懸液備用。取部分PM2.5懸液于4℃和14 000×g速度離心30 min，收集上清液。采用ICP-MS對PM2.5水溶性金屬成分進(jìn)行分析。

1.2.2 PM2.5和鋅離子染毒劑量選擇本研究采用氣管滴注法對小鼠進(jìn)行染毒，具體染毒濃度通過以下方式來確定：①重度霧霾天氣情況下，新鄉(xiāng)市PM2.5濃度可達(dá)500 μg·m-3；②成年小鼠的呼吸速率為53 mL·min-1。根據(jù)計(jì)算可知，成年小鼠的每日呼吸量為0.076 m3，每只小鼠每天吸入PM2.5的量約為0.038 mg。每2 天每只BALB/c 小鼠的PM2.5染毒量為4 mg·kg-1（以體重計(jì)，后同）。因此，本次染毒時(shí)間設(shè)定為1 周，PM2.5染毒量為4 mg·kg-1，隔日染毒，共計(jì)3次。同時(shí)，檢測細(xì)顆粒物中鋅離子濃度，并用外源性鋅離子濃液進(jìn)行染毒，低濃度ZnSO4組鋅離子濃度（30 μg·kg-1）與PM2.5樣品中鋅離子相同，高濃度ZnSO4組鋅離子濃度（60 μg·kg-1）是PM2.5樣品中鋅離子的2倍。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和染毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將24 只雄鼠隨機(jī)分為對照組（PBS）、PM2.5組（4 mg·kg-1）、低濃度ZnSO4組（30 μg·kg-1）和高濃度ZnSO4組（60 μg·kg-1），每組6 只。采用氣管滴注法對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行PM2.5和外源性Zn2+染毒。使用乙醚將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，用自制的小鼠固定儀器固定小鼠并暴露口腔，用線掛住上切牙后，迅速用鑷子夾住小鼠舌部并拉出口腔，將PM2.5懸液緩慢注入小鼠咽部，然后迅速捏緊小鼠鼻腔，迫使小鼠經(jīng)口呼吸，使液體吸入肺內(nèi)，當(dāng)聽到肺部濕 音后即染毒成功。全部染毒結(jié)束后，按常規(guī)正常飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠。對照組、低濃度ZnSO4組和高濃度ZnSO4組采用相同方式進(jìn)行染毒。

1.2.4 肺臟組織病理學(xué)檢測末次染毒次日處死小鼠，取右肺于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片（厚度為5 μm），采用HE染色，光鏡下觀察肺臟的組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)改變。參照以往方法對肺組織進(jìn)行炎癥評分和計(jì)算肺泡平均截距（mean linear intercept，Lm）［12-13］。選取3～4 個(gè)中型支氣管和肺泡，觀察支氣管周圍炎癥程度，分為0～3 級。0 級：無炎癥反應(yīng)；1 級：輕度炎癥伴支氣管或肺泡間隔炎性細(xì)胞灶，伴輕度支氣管上皮損傷；2 級：中度炎癥伴斑片狀或局部炎癥，支氣管壁、肺泡間隔或支氣管上皮損傷，不到1/3的支氣管上皮橫斷面受累；3 級：重度炎癥，即支氣管壁和肺泡間隔彌漫性炎癥細(xì)胞，支氣管上皮損傷，1/3～2/3 的支氣管上皮受累。光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)200）隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)算Lm，用Image-Pro Plus 6.0軟件對Lm進(jìn)行定量。

1.2.5 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluids，BALFs）細(xì)胞數(shù)分析處死小鼠后，迅速結(jié)扎小鼠右肺，對左肺行肺泡灌洗術(shù)。每只小鼠灌肺3 次，每次0.5 mL，共計(jì)1.5 mL，灌洗液回收率為80%。收集好的灌洗液于4℃，500×g離心20 min，分別收集上清液和下層細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測肺泡灌洗液中的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6 BCA 蛋白測定試劑盒檢測總蛋白水平用BCA蛋白測定試劑盒測定反映肺損傷情況。

1.2.7 乳酸脫氫酶（lactic acid dehydrogenase，LDH）的檢測用LDH 檢測試劑盒測定BALFs 中LDH 含量。

1.2.8 炎癥細(xì)胞因子測定采用ELISA 法檢測支氣管肺泡灌洗液中IL-1β 水平，以反映肺部炎性損傷情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 軟件。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；方差分析用于多組間均數(shù)的比較，組間比較采用LSD 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大氣PM2.5中金屬成分分析

如圖1A 所示，光學(xué)顯微鏡下觀察到染毒懸液中PM2.5分散，未出現(xiàn)明顯聚集現(xiàn)象。本研究檢測了PM2.5中水溶性金屬元素和陰離子的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（如表1），包括11 種金屬元素（Ca、Mg、Zn、Mn、Al、Cu、Ni、Cr、Pb、Cd、Se）和8 種陰離子（F-、Ac-、Br-、Cl-、NO3-、HPO42-、SO42-、NO2-）。

其中PM2.5可溶性金屬元素中Ca、Al 和Zn 含量最多，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（21.83±0.15）、（4.55±0.25）、（4.38±0.06）μg·mg-1。

2.2 小鼠肺臟病理形態(tài)的變化

圖1B 顯示，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物吸入PM2.5后，其主要分布在肺泡區(qū)域，并被巨噬細(xì)胞吞噬。如圖2所示，對照組中小鼠暴露于PBS 后，其肺組織結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化；而PM2.5暴露組中小鼠肺臟顯示炎性損傷，包括炎性細(xì)胞（巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）浸潤至呼吸道周圍，低濃度ZnSO4組和高濃度ZnSO4組也同樣觀察到明顯的炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象及肺臟正常生理結(jié)構(gòu)破壞，高濃度ZnSO4組上述病理改變更為明顯。炎癥評分和Lm結(jié)果如圖3所示，與對照組相比［（0.40±0.22）分］，PM2.5組［（1.64±0.31）分］、低濃度ZnSO4組和高濃度ZnSO4組［（1.30±0.34）、（1.90±0.20）分］炎癥評分明顯升高（P＜0.05），且高濃度ZnSO4組得分高于低濃度ZnSO4組（P＜0.05）（圖3A）。與對照組［（51.40±4.72）μm］相比，PM2.5組［（61.00±1.41）μm］、低濃度ZnSO4組和 高濃度ZnSO4組［（62.40±2.41）、（65.00±2.55）μm］BALF 中Lm 距離變寬（P＜0.05），但染毒各組間沒有差異（圖3B）。

圖1 PM2.5在小鼠肺臟蓄積Figure 1 Accumulation of PM2.5 in the lungs of mice

2.3 小鼠肺臟炎性損傷

如圖4A所示，與對照組［（14.78±2.82）×104個(gè)·mL-1］相比，PM2.5組［（24.11±5.30）×104個(gè)·mL-1］、低濃度ZnSO4組和高濃度ZnSO4組［（24.00±4.61）×104、（24.00±4.61）×104個(gè)·mL-1］BALF中總細(xì)胞數(shù)量升高（P＜0.05），但染毒各組間沒有差異。如圖4B 所示，與對照組［（1.40±0.14）g·L-1］相比，PM2.5組、低濃度ZnSO4組和高濃度ZnSO4組BALF中總蛋白濃度升高［（2.58±0.50）、（2.69±0.41）、（3.62±0.98）g·L-1］（P＜0.05），并且高濃度ZnSO4組較PM2.5組升高更為明顯（P＜0.05）。與對照組［（44.18±11.54）U·L-1］相比，PM2.5組［（443.02±123.33）U·L-1］、低濃度ZnSO4組和高濃度ZnSO4組［（185.16±64.00）、（428.37±70.71）U·L-1］BALF 中LDH 水平升高（P＜0.05），并且PM2.5組和高濃度ZnSO4組升高更明顯（圖4C）。與對照組［（9.54±2.38）×103ng·L-1］相比，PM2.5組［（20.51±3.04）×103ng·L-1］、低濃度ZnSO4組和高濃度ZnSO4組［（15.98±0.53）×103、（26.36±4.87）×103ng·L-1］BALF 中IL-1β 水平升高（P＜0.05），并且高濃度ZnSO4組較另外2 組升高更明顯（P＜0.05，圖4D）。

表1 大氣PM2.5中可溶性金屬離子及陰離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)（±s）Table 1 Concentrations of soluble metals and anions in PM2.5 (±s)

表1 大氣PM2.5中可溶性金屬離子及陰離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)（±s）Table 1 Concentrations of soluble metals and anions in PM2.5 (±s)

水溶性金屬元素 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/（μg·mg-1） 水溶性陰離子 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/（μg·mg-1）Ca 21.83±0.15 F- 4.14±0.05 Mg 3.62±0.09 Ac- 22.80±0.17 Zn 4.38±0.06 Cl- 45.56±0.54 Mn 0.20±0.03 NO2- 0.85±0.04 Al 4.55±0.25 Br- 0.51±0.02 Cu 0.17±0.02 NO3- 236.41±5.40 Ni 0.09±0.01 HPO4 2- 180.22±5.25 Cr 0.69±0.12 SO4 2- 0.83±0.11 Pb 0.33±0.02 Cd 0.01±0.005 Se 0.28±0.03

圖2 PM2.5和Zn2+暴露誘導(dǎo)小鼠肺部形態(tài)的變化（HE染色，×10）Figure 2 Exposure to PM2.5 and Zn2+ induce changes of lung morphology in mice (HE staining,×10)

圖3 PM2.5和Zn2+暴露誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥損傷評分和肺泡平均截距的變化Figure 3 Exposure to PM2.5 and Zn2+ induce changes of lung inflammation score and mean linear intercept in mice

圖4 PM2.5和Zn2+暴露誘導(dǎo)小鼠肺部炎性損傷Figure 4 PM2.5 and Zn2+ exposure induce inflammatory lung injury in mice

3 討論

一項(xiàng)關(guān)于大氣顆粒物對全球疾病負(fù)擔(dān)貢獻(xiàn)的研究顯示，1990―2015年，長期暴露于PM2.5導(dǎo)致420萬人死亡，占全球總死亡人數(shù)的7.6%，而PM2.5污染在健康危險(xiǎn)因素中排名第五［14］。研究報(bào)道，預(yù)計(jì)至2050年，因大氣污染的持續(xù)存在而引起各類相關(guān)疾病死亡人數(shù)可達(dá)660 萬［15］。而PM2.5主要進(jìn)入呼吸系統(tǒng)誘發(fā)或進(jìn)行性加重呼吸系統(tǒng)疾病，導(dǎo)致相關(guān)發(fā)病率和死亡率明顯升高，其在空氣污染導(dǎo)致的死亡中貢獻(xiàn)較大［16］。因此，研究PM2.5毒理學(xué)機(jī)制，對預(yù)防空氣污染造成的健康危害具有重要的意義。目前眾多學(xué)者對PM2.5毒理學(xué)機(jī)制進(jìn)行了大量研究，早期研究也發(fā)現(xiàn)PM2.5可以引起呼吸道急慢性損傷，但是目前其確切的毒作用機(jī)制尚不清楚。

細(xì)顆粒物成分復(fù)雜，其成分包括有機(jī)物、重金屬、微生物等。以往的大部分研究主要將收集的顆粒物直接進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，并未對其主要組分的毒理學(xué)貢獻(xiàn)進(jìn)行分析研究［17］。也有學(xué)者對提取的顆粒物上有機(jī)物成分進(jìn)行分析，表明其有一定的毒性作用［18］。但是，關(guān)于PM2.5的另一重要組成成分重金屬毒性的研究還較少。已有大量的研究表明，重金屬是PM2.5最主要的組成成分之一，而其中的鋅離子含量較多，并且主要以離子的形式存在［19］。本研究通過對水溶性金屬離子的測定，發(fā)現(xiàn)PM2.5樣品中鈣和鋁含量最高，鈣是建筑揚(yáng)塵標(biāo)志性元素，而鋁是地殼源的代表性元素，這表明新鄉(xiāng)市的建筑塵和土壤揚(yáng)塵對大氣PM2.5貢獻(xiàn)較多。除上兩種元素外，本研究進(jìn)一步證實(shí)了新鄉(xiāng)市PM2.5中鋅離子含量較高，處于第三位，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)4.38 μg·mg-1，這也與其他城市研究結(jié)果相似［20］。鋅是一類重要的過渡金屬，研究表明鋅也普遍存在于大氣PM2.5中，并且PM2.5上的鋅多以硫酸鋅的形式存在［21］。

鑒于前期檢測新鄉(xiāng)市PM2.5中鋅離子含量較多，在霧霾天氣吸入過量的PM2.5后，其上附著的鋅離子是否也是呼吸道損傷的誘因之一，是本研究要探討的問題。肺臟是環(huán)境污染物研究的重要靶器官之一，它不僅是人體進(jìn)行氣體交換的重要器官，還是機(jī)體防御的初級屏障。BALF中總蛋白濃度是反映肺部血管通透性的指標(biāo)之一，BALF中的蛋白主要來自血漿滲出，總蛋白可反映肺泡上皮毛細(xì)血管屏障損傷，是肺泡氣血屏障完整性的指標(biāo)［22］。LDH主要來源于細(xì)胞膜損傷后的胞質(zhì)內(nèi)釋放，可以反映肺內(nèi)細(xì)胞損傷水平［23］。IL1-β 是一種急性反應(yīng)的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，還可激活B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞［24］。IL-1β 還可以直接引起炎癥性肺損傷，并誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，使損傷進(jìn)一步加重和擴(kuò)大。在本研究中發(fā)現(xiàn)，PM2.5組、低濃度ZnSO4組和高濃度ZnSO4組小鼠BALF 中LDH 均明顯高于PBS 對照組，上述研究結(jié)果表明PM2.5和與PM2.5中等量的外源性Zn2+均可以影響小鼠肺部血管通透性和造成肺部細(xì)胞損傷；炎性因子檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示PM2.5組、低濃度Zn2+組和高濃度Zn2+組小鼠BALF 中IL-1β 水平均明顯高于PBS 對照組，提示 PM2.5由氣管進(jìn)入小鼠肺部后，其上的Zn2+也會(huì)對小鼠氣道產(chǎn)生炎性刺激作用，釋放炎性介質(zhì)，引起肺部炎性損傷；小鼠肺部HE 染色病理切片也證實(shí)PM2.5和Zn2+可引起小鼠肺組織結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致肺泡壁斷裂融合增寬，支氣管內(nèi)炎性細(xì)胞聚集，肺組織的正常結(jié)構(gòu)遭到一定程度破壞。本研究表明，PM2.5及同等量的Zn2+暴露均能引起小鼠肺組織炎癥反應(yīng)。這也進(jìn)一步提示新鄉(xiāng)市重度霧霾天氣中吸入的細(xì)顆粒物上的Zn2+可以造成肺部的炎癥損傷。以往研究也發(fā)現(xiàn)，鋅組分的含量與吸入顆粒物毒性效應(yīng)之間常常存在正相關(guān)關(guān)系［25］。因此，PM2.5誘導(dǎo)的呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)可能與其過渡金屬成分鋅離子相關(guān)。

鋅是人體必不可少的一類重要微量元素，對維持機(jī)體的正常生理功能至關(guān)重要。但是攝入或者接觸過量的鋅也會(huì)導(dǎo)致健康損傷。職業(yè)人群長期接觸鋅及其氧化物可以誘發(fā)機(jī)體損傷。而過量吸入含ZnO 顆粒物的煙霧可以直接導(dǎo)致急性呼吸道損傷并且伴氣道高反應(yīng)性［26］。研究表明，外源性鋅離子誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)主要包括促進(jìn)活性氧釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)升高［20］。課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞活性氧釋放，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而加重呼吸道炎癥［27］。因此，推測PM2.5中鋅離子組分可能通過影響肺臟氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)而造成肺炎性損傷。但是本次研究未對此進(jìn)行進(jìn)一步的研究，PM2.5中過多的鋅離子組分是否可通過引起呼吸道氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡，進(jìn)而參與PM2.5暴露導(dǎo)致的呼吸道炎癥的過程，而其具體的機(jī)制又是通過哪些信號通路進(jìn)行調(diào)控，這是下一步要進(jìn)行的研究。

綜上所述，本研究表明與PM2.5中等量的鋅離子可以引起肺組織損傷和急性呼吸道炎癥反應(yīng)，這提示鋅離子組分可能是PM2.5毒性效應(yīng)的潛在研究靶點(diǎn)，為更深入地探索PM2.5暴露導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生機(jī)制提供了潛在的研究靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。