于曉楠，忻酈菁，張靜，楊吉星，王斌

上海市虹口區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200082

諾如病毒（norovirus，NoV）屬杯狀病毒科諾如病毒屬，是非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原之一，該病毒引起的急性胃腸炎在每年冬春季高發(fā)［1-2］。全球每年約200 000人因感染諾如病毒而致死，多數(shù)為發(fā)展中國家和地區(qū)的兒童［3-4］。諾如病毒是引起我國兒童和成人急性胃腸炎暴發(fā)及散發(fā)流行的主要病原之一，急性胃腸炎患者諾如病毒的檢出率均在20%以上［5］。諾如病毒具有豐富的遺傳多樣性，根據(jù)主要衣殼蛋白VP1 序列的同源性，諾如病毒可分為7 個基因群（GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ、GⅥ以及GⅦ），其中GⅠ、GⅡ和GⅣ是目前已知可以感染人的基因群［6-7］。由于傳播途徑廣泛且缺乏安全有效的疫苗，近年來，諾如病毒感染性腹瀉在世界各地多次引發(fā)大規(guī)模的暴發(fā)流行，目前已成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。本研究旨在通過研究虹口區(qū)2017―2019年諾如病毒感染性腹瀉病例樣本的聚合酶RdRp基因和衣殼蛋白VP1基因序列來分析諾如病毒感染性腹瀉聚集性疫情流行特征和病原學(xué)特征，為今后指導(dǎo)防控工作提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 病例定義

參考《上海市諾如病毒感染性腹瀉防控方案（2014版）》制定的病例定義，符合以下臨床診斷病例標(biāo)準(zhǔn)者，可初步診斷為諾如病毒感染：潛伏期24～48 h；主要癥狀為嘔吐和腹瀉，可伴有惡心、發(fā)熱和腹痛，兒童病例以嘔吐為主，成人病例腹瀉為多；病程12～60 h；糞便、血常規(guī)檢查無特殊發(fā)現(xiàn)；排除常見細(xì)菌、寄生蟲及其他病原感染。確認(rèn)病例除符合臨床診斷病例標(biāo)準(zhǔn)外，在糞便標(biāo)本或嘔吐物中需檢測出諾如病毒。

1.2 密切接觸者定義

密接接觸者就是指與諾如病毒感染確診病例或臨床診斷病例有共同居住、共同生活、共同學(xué)習(xí)經(jīng)歷的人員，或者暴露于病例嘔吐或排泄物的人員，或是根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查人員綜合評定確定的有其他形式接觸的直接接觸者。

1.3 聚集性疫情標(biāo)準(zhǔn)

參考《上海市諾如病毒感染性腹瀉防控方案（2014版）》制定的疫情標(biāo)準(zhǔn)，諾如病毒感染的聚集性疫情是指：學(xué)校、托幼機(jī)構(gòu)等集體單位內(nèi)同一班級或同一宿舍，1 d內(nèi)發(fā)生1例及以上，或連續(xù)3 d 內(nèi)發(fā)生5例以上，以嘔吐和（或）腹瀉等為主要癥狀的病例；3 d內(nèi)出現(xiàn)20 例及以上臨床診斷為急性胃腸炎的病例為疑似暴發(fā)疫情；一周內(nèi)出現(xiàn)20 例及以上的諾如病毒感染性腹瀉確診病例為暴發(fā)疫情。

1.4 研究對象

2017―2019年上海市虹口區(qū)發(fā)生的37 起諾如病毒感染性腹瀉聚集及暴發(fā)疫情病例。所有病例調(diào)查采用諾如病毒感染聚集性和暴發(fā)疫情個案調(diào)查表、上海市病毒性腹瀉個案調(diào)查表對病例進(jìn)行個案調(diào)查，主要內(nèi)容包括：一般情況、發(fā)病就診情況、臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)史等相關(guān)信息，并對疫情發(fā)生單位基本情況及飲食飲水、外環(huán)境等情況進(jìn)行調(diào)查。本研究已通過上海市虹口區(qū)疾病預(yù)防控制中心倫理審查委員會審批（編號：2020-002）。

1.5 采樣及檢測

采集各類樣本共699 份（其中病例糞便、肛拭或嘔吐物樣本208 份，無癥狀密切接觸者糞便、肛拭或嘔吐物樣本67 份，從業(yè)人員肛拭樣本142 份，廚房砧板等環(huán)節(jié)樣本239 份，留樣食品樣本43 份），送虹口區(qū)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室檢測。采用羅氏全自動核酸純化與加樣系統(tǒng)MagNA pure LC 2.0（Roche Applied Science，德國） 進(jìn)行病毒RNA 的提取，初始樣本體積為200 μL，最后洗脫體積為100 μL，提取的核酸分裝后置于-80°C凍存。

采用上海伯杰醫(yī)療科技有限公司的諾如病毒Ⅰ型/Ⅱ型核酸檢測試劑盒（雙重?zé)晒釶CR 法），使用ABI 7500 實(shí)時熒光定量PCR 擴(kuò)增儀。反應(yīng)條件：50℃10 min逆轉(zhuǎn)錄，95℃ 5 min預(yù)變性，95℃ 10 s，55℃ 40 s，40個循環(huán)。

采用Onestep RT-PCR 試劑盒（Qiagen，德國）進(jìn)行RdRp和VP1的部分基因擴(kuò)增，其中G2SKF/G2SKR引物［8］用于VP1基因（387 bp）擴(kuò)增，若RT-PCR 結(jié)果為陰性則選用CoG2F/G2SKR 引物［9］進(jìn)行擴(kuò)增。使用JV12/JV13引物［10］對RdRp基因（326 bp）進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，由5 μL 5×QIAGEN Onestep RT-PCR Buffer，1 μL DNTP Mix，0.5 μL正向、反向引物（10 mmoL），1 μL QIAGEN Onestep RT-PCR Enzyme Mix 試 劑，12 μL 無Rnase水和5 μL 核酸組成。反應(yīng)條件：50℃，30 min；95℃，15 min；再按94℃、15 s，60℃、60 s，72℃、60 s，循環(huán)40 次；最后72℃，10 min，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，陽性擴(kuò)增條帶送上海伯杰醫(yī)療科技有限公司進(jìn)行測序。

利用DNAstar 中Seqman 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接整理，將整理好的序列提交到諾如病毒基因分型網(wǎng)站（http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool/）進(jìn)行基因分型。從Genbank 中下載國內(nèi)外GⅡ型諾如病毒相關(guān)序列片段，采用MEGA 軟件（7.0.14 版本）對病毒RdRp基因和VP1基因核苷酸分別進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。使用鄰近法（Neighbor-Joining）繪制進(jìn)化樹，Bootstrap Replications 數(shù)值設(shè)置為1 000，用于評估進(jìn)化樹的可靠性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Excel 2010 建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS 16.0 對不同場所諾如病毒聚集性疫情罹患率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 疫情概況

2017―2019年上海市虹口區(qū)共報(bào)告諾如病例聚集疫情37 起，病例數(shù)474 例，總罹患率為1.95%（474/24 266）。每起疫情罹患人數(shù)中位數(shù)11 例，罹患率在0.54%～34.12%間；病例數(shù)＜20例的疫情累計(jì)33起，病例數(shù)≥20 例的疫情共4 起。其中疫情持續(xù)時間≤4 d共有5起，5～7 d共有20起，≥8 d有11 起。經(jīng)采樣檢測發(fā)現(xiàn)，37起疫情中共有29起檢出NoV GⅡ（其中5 起疫情檢出NoV GⅡ混合札如病毒、NoV GⅠ和金黃色葡萄球菌感染），8起疫情未檢出病原。

2.2 流行特征分析

2.2.1 時間分布2017年報(bào)告24起，占64.86%（24/37），2018年報(bào)告7起，占18.91%（7/37），2019年報(bào)告6起，占16.22%（6/37），以2017年流行最為嚴(yán)重。從流行季節(jié)分布上，主要發(fā)生在冬春季，占總數(shù)的78.38%（29/37），見圖1。

圖1 2017—2019年虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情時間分布Figure 1 Temporal distribution of norovirus clusters in Hongkou District,Shanghai from 2017 to 2019

2.2.2 地區(qū)分布全區(qū)8個街道均有疫情發(fā)生，罹患率在0.76%～2.88%之間，罹患率居前3 位的街道依次為嘉興路街道、曲陽路街道和四川北路街道，見表1。

表1 2017—2019年虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情地區(qū)分布Table 1 Regional distribution of norovirus clusters in Hongkou District,Shanghai from 2017 to 2019

2.2.3 人群分布報(bào)告病例中，年齡最小2歲，最大93歲。2～6 歲兒童143 例，占30.17%，7～11 歲學(xué)生217 例，占45.78%；12～18 歲中學(xué)學(xué)生91 例，占19.20%；19 歲及以上成人23 例，占4.85%。發(fā)病人群中，男性265例，女性209，男女性別比為1.27：1。

2.2.4 發(fā)生場所分布諾如病毒聚集性疫情發(fā)生場所主要在小學(xué)（37.84%，14/37）和幼托機(jī)構(gòu)（35.14%，13/37）；不同場所發(fā)生疫情報(bào)告罹患率在1.67%～2.94%之間，其中幼托機(jī)構(gòu)報(bào)告罹患率最高（2.94%）。見表2。

表2 2017—2019年虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情發(fā)生場所分布情況Table 2 School distribution of norovirus clusters in Hongkou District,Shanghai from 2017 to 2019

2.2.5 臨床特征病程1～3 d，均為輕癥，臨床癥狀以嘔吐為主（89.66%，425/474），部分病例伴有發(fā)熱、腹瀉、腹痛、乏力等其他癥狀。見表3。

表3 2017—2019年虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情臨床特征Table 3 Clinical characteristics of norovirus clusters in Hongkou District,Shanghai from 2017 to 2019

2.2.6 傳播途徑2017―2019年虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情主要傳播途徑為接觸傳播，達(dá)到36起，占97.30%（36/37），病例數(shù)444，罹患率3.44%（444/23 458），接觸傳播和食源性傳播1起，占2.70%，發(fā)病報(bào)告30例，罹患率3.71%（30/808）。對37 起聚集性疫情傳播機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，23 起病例數(shù)大于等于10 例的疫情中，病例排泄物處置不當(dāng)造成疫情蔓延達(dá)到17 起，占比73.91%（17/23）。

2.3 病原學(xué)特征分析

2.3.1 病原檢測情況37 起聚集性疫情的699 份樣本中NoV GⅡ核酸陽性130份，陽性率為18.60%。其中病例相關(guān)樣本檢出率為47.12%（98/208），無癥狀的密切接觸者相關(guān)樣本檢出率為29.85%（20/67），從業(yè)人員相關(guān)樣本檢出率為7.04%（10/142），廚房砧板等環(huán)節(jié)樣本檢出率為0.84%（2/239）。

2.3.2 GⅡ型諾如病毒基因型分布情況對45 份（2017年采集的4 份，2018年采集的22 份，2019年采集的19 份）GⅡ型諾如病毒陽性的病例糞便肛拭樣本分別進(jìn)行了VP1和RdRp的部分基因擴(kuò)增，其中成功獲得VP1基因的樣本45 例（2019年19 例，2018年22 例，2017年4 例）和RdRp基因的樣本19 例（2019年）。通過測序和序列分析發(fā)現(xiàn)，2017年和2018年上海市虹口區(qū)諾如病毒VP1基因型為GⅡ.2，而2019年RdRp基因型為GⅡ.P17，VP1基因型為GⅡ.17。

2.3.3 GⅡ型諾如病毒序列對比和進(jìn)化樹構(gòu)建通過對RdRp基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，2019年上海虹口地區(qū)疫情的諾如病毒位于GⅡ.P17 分支中LC037415株所在小分支上（自展值94），與LC037415 的核苷酸序列同源性達(dá)99.4%～99.6%。

通過對VP1基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，2019年上海虹口地區(qū)疫情的諾如病毒位于GⅡ.17 分支（自展值為99），核苷酸同源性為98.9%～99.2%。而2017 和2018年上海虹口地區(qū)疫情的26 株諾如病毒則聚在GⅡ.2 分支（自展值99），總體同源性為97.9%～100%。具體詳見補(bǔ)充材料（http://www.jeom.org/article/cn/10.13213/j.cnki.jeom.20462）。

3 討論

近年來，國內(nèi)外研究顯示諾如病毒感染性腹瀉聚集性疫情呈上升趨勢，疫情主要發(fā)生在學(xué)校、兒童保育中心、療養(yǎng)院、軍事設(shè)施和游輪等人員密集、封閉場所［6-7］。為了更全面了解上海市虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情流行趨勢和病原變化，本課題對2017―2019年虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情開展調(diào)查分析及病原監(jiān)測，以便為防控措施的制定提供科學(xué)依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情大部分與GⅡ型諾如病毒感染有關(guān)，呈現(xiàn)出明顯的冬春季流行高峰，這與本市、江浙地區(qū)既往研究結(jié)果一致［11-13］，但與北京等地流行高峰有所不同［14-15］。諾如病毒感染所致聚集性疫情流行高峰的地域差異，可能與不同地域地理位置、氣候環(huán)境及病毒流行株型別差異有關(guān)，因此，冬春季應(yīng)作為虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情防控的重點(diǎn)時期。

虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情在全區(qū)8 個街道均有疫情發(fā)生，差異可能受到疫情監(jiān)測敏感性及學(xué)校、幼托機(jī)構(gòu)等重點(diǎn)機(jī)構(gòu)分布的影響。幼托機(jī)構(gòu)和小學(xué)為諾如病毒聚集性疫情的高發(fā)場所，可能與幼兒園人員密集、集體活動頻密以及直接或間接接觸機(jī)會較多有關(guān)，且幼兒衛(wèi)生習(xí)慣和防護(hù)意識差，免疫力較低造成幼兒易發(fā)病。另外，近年來各類教育培訓(xùn)機(jī)構(gòu)的興起，參加各類課外培訓(xùn)的幼兒數(shù)量增加，為病毒傳播和疫情擴(kuò)散提供了條件。

病例的主要癥狀為嘔吐、腹瀉、發(fā)熱，發(fā)病兒童嘔吐癥狀多見，可用于聚集性疫情早期識別和病原判定，但嘔吐所產(chǎn)生的氣溶膠增加了周圍人員的暴露風(fēng)險(xiǎn)，加快了病毒的傳播和疫情蔓延。

2017―2019年虹口區(qū)諾如病毒聚集性疫情主要傳播途徑為接觸傳播，與本市既往研究結(jié)果一致［11］，與廣東省以食源性傳播為主不同［16］。對傳播機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，因嘔吐物、排泄物處置不當(dāng)容易造成疫情擴(kuò)散，研究提示應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)重點(diǎn)機(jī)構(gòu)諾如病毒聚集性疫情防控培訓(xùn)和督導(dǎo)，指導(dǎo)衛(wèi)生老師和保潔人員規(guī)范開展公共場所內(nèi)嘔吐物和排泄物的消毒處置，在兒童和學(xué)生中開展有針對性的健康教育，減少和控制疫情的蔓延。本次研究中，經(jīng)食源性傳播聚集性疫情僅報(bào)告1 起，但在監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)部分從業(yè)人員無癥狀攜帶并檢出病毒，因此落實(shí)食源性傳播的防范措施，在學(xué)校托幼機(jī)構(gòu)、養(yǎng)老院等易感人群密集單位仍具有重要公共衛(wèi)生學(xué)意義。

虹口區(qū)37起諾如病毒聚集性疫情病毒檢出以GⅡ型為主，諾如病毒感染急性胃腸炎病例和無癥狀的隱性感染者均可以成為傳染源，由于隱性感染者很難發(fā)現(xiàn)和隔離，在疾病傳播過程的貢獻(xiàn)率更高［17］，本研究中密接和從業(yè)人員病毒檢出率與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［18］。因此，在疫情防控中，在做好病例管理的同時，加強(qiáng)對無癥狀感染者和從業(yè)人員日常健康管理和監(jiān)測，對其引起的疫情傳播風(fēng)險(xiǎn)需高度重視。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［19-20］，我國2015―2016年流行的優(yōu)勢株為GⅡ.P17-GⅡ.17 型，之后是GⅡ.P16-GⅡ.2 型。本研究中通過對虹口區(qū)2019年聚集性疫情進(jìn)行病毒檢測和基因分型，首次發(fā)現(xiàn)了GⅡ.P17-GⅡ.17 基因型諾如病毒在虹口區(qū)的存在。對RdRp基因序列進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，GⅡ.P17 基因型毒株序列與同一分支上的2015年日本Kawasaki308 病毒株（LC037415）有較近的親緣性關(guān)系。對VP1基因序列進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，2019年上海虹口地區(qū)的諾如病毒與2015年安徽地區(qū)報(bào)道的一株GⅡ型諾如病毒（MK387010）親緣關(guān)系較近，而2017和2018年上海虹口地區(qū)的26株諾如病毒與同期上海市、江蘇、浙江地區(qū)報(bào)道的GⅡ型諾如病毒核苷酸序列親緣性關(guān)系較近。

上述研究提示虹口區(qū)GⅡ基因型在遺傳進(jìn)化上與本市、周邊省份及日本地區(qū)流行株共同循環(huán)和傳播。由于本次研究檢測樣本數(shù)量有限，后續(xù)還需持續(xù)開展病原學(xué)監(jiān)測，重點(diǎn)關(guān)注病毒株重組的出現(xiàn)，掌握病毒株變異趨勢，為做好聚集性疫情應(yīng)對做好準(zhǔn)備。