張楠，張英英，王鶴霏，陳茜，白文琳，孫誼然，張文平

山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 a.衛(wèi)生毒理學(xué)教研室 b.流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室 c.兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)教研室，山西 太原 030000

苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）屬于典型的多環(huán)芳烴類物質(zhì)，廣泛存在于化石燃料燃燒，香煙煙霧及汽車尾氣中，是一種常見的環(huán)境致癌物，可通過呼吸道、消化道等途徑進(jìn)入機(jī)體，引起呼吸系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，嚴(yán)重威脅人體健康［1］。研究表明BaP 具有較強(qiáng)的脂溶性，易透過胎盤屏障及血腦屏障，引起胎兒出生體重降低，兒童期智力下降及攻擊行為增加等問題［2-4］。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)孕期暴露于BaP 可導(dǎo)致動(dòng)物胚胎畸形，成年認(rèn)知功能損傷或神經(jīng)行為缺陷等現(xiàn)象［5-7］。而目前關(guān)于外源化學(xué)物對(duì)孕期BaP 暴露所致胚胎神經(jīng)毒性的干預(yù)作用的研究鮮有報(bào)道。

近年來，隨著多哈理論（Developmental Origins of Health and Disease，DOHaD）即健康和疾病的發(fā)育起源的流行，越來越多的研究人員關(guān)注到孕期宮內(nèi)環(huán)境對(duì)胎兒生長(zhǎng)及出生后長(zhǎng)期發(fā)育的影響。目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，孕期暴露于BaP 可通過誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞過度氧化應(yīng)激，線粒體損傷和神經(jīng)遞質(zhì)活性下降，細(xì)胞凋亡等途徑引起神經(jīng)細(xì)胞或突觸可塑性損傷，導(dǎo)致出生缺陷或出生后神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常［8-9］。Wnt/β-catenin是一條進(jìn)化上保守的信號(hào)通路，對(duì)胚胎期和出生后個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，具體地說，Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和遷移等關(guān)鍵過程，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要，它的失調(diào)與包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［10］。Marchetti等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，老年帕金森病患者大腦中的Wnt/β-catenin信號(hào)激活可以促進(jìn)神經(jīng)再生，有助于恢復(fù)腦室下區(qū)微環(huán)境和增強(qiáng)神經(jīng)救援。

氯化鋰（lithium chloride，LiCl）是臨床上廣泛使用的情緒穩(wěn)定劑，已被證明具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和抑制神經(jīng)元凋亡的作用［12-13］。LiCl可抑制糖原合酶激酶-3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）的活性，主要通過GSK-3β 磷酸化失活，釋放其下游蛋白β-catenin，使其在細(xì)胞核內(nèi)蓄積，參與DNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)［14］。而目前，LiCl 對(duì)BaP 暴露所致的胚胎神經(jīng)毒性是否有改善作用未見報(bào)道。因此，本研究擬構(gòu)建孕期BaP 染毒模型，利用LiCl 進(jìn)行干預(yù)，探討LiCl 對(duì)BaP 暴露所致胚胎神經(jīng)毒性的改善作用，為研究其具體作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 主要試劑及器材

主要試劑：3，4-benzonpyrene（Sigma-Aldrich，美國(guó)），0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，中國(guó)），LiCl（上海生工，中國(guó)），植物油（金龍魚公司，新加坡），蘇木素-伊紅試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、二抗-羊抗兔（博士德，中國(guó)），Anti-beta catenin、Anti-GSK-3β（Abcam，英國(guó)），Anti-pGSK-3β（Abclonal，中國(guó)）。主要儀器：-80℃超低溫冰箱（Thermo，美國(guó)），智能化組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、全自動(dòng)切片機(jī)（Leica，德國(guó)），超聲波震碎儀（新芝生物公司，中國(guó)），高速低溫離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國(guó)），電泳儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（Bio-Rad，美國(guó)）。

1.2 動(dòng)物染毒及處理

8 周齡SPF 級(jí)SD 大鼠［山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（晉）2019-0004］，飼養(yǎng)于自然節(jié)律采光、環(huán)境溫度（25±1）℃、濕度50%～60%的清潔級(jí)環(huán)境中，期間自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，雌雄（1∶1）于18:00合籠，次日8:00觀察到陰栓視為合籠成功，記為妊娠第0 天（GD0 ），35只雌鼠連續(xù)合籠兩晚，共合籠成功32只，受孕率為91.4%，從中隨機(jī)選取30只孕鼠分為5 組，每組6只，分別為對(duì)照組（Control）、LiCl組（40 mg·kg-1LiCl）［15］、植物油組（soybean oil）、BaP 組（20 mg·kg-1BaP）和LiCl 干預(yù)組（20 mg·kg-1BaP+40 mg·kg-1LiCl）。LiCl 溶于生理鹽水，BaP 溶于植物油，GD8 開始染毒，每天1 次，連續(xù)7 d，以每100 g 體重0.5 mL 體積灌胃的方式給藥。LiCl干預(yù)處理于BaP 染毒前2 h 給藥，對(duì)照組和植物油組給予相同體積的生理鹽水或植物油。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究通過山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)審查（批準(zhǔn)號(hào)：2020GLL042）并嚴(yán)格遵循相關(guān)規(guī)定。

觀察孕鼠染毒期間的一般狀態(tài)、外觀體征、行為活動(dòng)及攝食情況，記錄其體重變化。GD14染毒結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)，GD18 時(shí)對(duì)孕鼠麻醉，剖腹取出子宮連胚胎，測(cè)量并記錄胎鼠總數(shù)、體重、身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)，組織保存于-80℃。

1.3 HE染色

取出胚胎后，冰上快速剝離大腦，4%多聚甲醛固定24 h后，脫水，石蠟包埋，冠狀切片厚度為5 μm；二甲苯常規(guī)脫蠟；梯度乙醇水化；37℃蘇木素染色5 min；1%的鹽酸酒精分化3 s；37℃伊紅染液染色20 s；沖洗、脫水、透明、封片；光學(xué)顯微鏡觀察并采圖。

1.4 Western blotting檢測(cè)

取出胚胎后，冰上快速剝離海馬，加入適量RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑，超聲30 s，冰上靜止15 min，低溫離心取上清，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度到同一水平，4℃孵育一抗過夜（Anti-beta catenin，1∶5 000；Anti-GSK-3β，1∶1 000；Anti-pGSK-3β，1∶2 000），TBST 洗3 次，4℃孵育二抗（1∶5 000）45 min，TBST 洗3 次，Bio-Rad 顯影儀顯影，Image J 1.46 分析蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，服從正態(tài)分布且滿足方差齊性時(shí)，多組間比較用單因素方差分析，多個(gè)均數(shù)之間兩兩比較采用Turkey’s 檢驗(yàn)；孕鼠體重變化采用重復(fù)測(cè)量方差分析，多個(gè)均數(shù)之間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠的一般情況及體重變化

染毒期間，各組孕鼠狀態(tài)良好，外觀未見明顯異常，被毛光澤。孕鼠體重采用重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果如圖1所示，各組間孕鼠體重增長(zhǎng)不全相同（F時(shí)間=92.25，P＜0.001；F組間=3.933，P=0.005；F交互=0.477，P=0.924）。GD14 和GD18，組間主效應(yīng)顯示，植物油組和LiCl組孕鼠體重增長(zhǎng)與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；BaP組孕鼠體重［（323.34±5.71）g、（364.34±10.41）g］均較對(duì)照組［（339.17±7.10）g、（390.32±11.35）g］減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026，P=0.045）；LiCl 干預(yù)組孕鼠體重［（345.05±7.72）g、（398.73±12.32）g］較BaP 組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034，P=0.029）。

圖1 BaP 暴露對(duì)孕鼠體重增長(zhǎng)的影響（n=6）Figure 1 Body weight of pregnant rats after BaP exposure (n=6)

2.2 胎鼠發(fā)育情況

表1為GD18胎鼠發(fā)育指標(biāo)測(cè)量結(jié)果。結(jié)果顯示，5組間胎鼠體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)不全相同，單因素方差分析差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F體重=17.60，P＜0.001；F身長(zhǎng)=8.04，P＜0.001；F尾長(zhǎng)=3.38，P=0.024）；兩兩比較，LiCl組和植物油組GD18 胎鼠體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)均與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），BaP 組胎鼠體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P=0.008，P=0.024），LiCl 干預(yù)組胎鼠體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)較BaP 組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001，P=0.022）。

表1 BaP暴露對(duì)GD18胎鼠發(fā)育指標(biāo)的影響（±s）Table 1 Development indexes of GD18 fetal rats after BaP exposure (±s)

表1 BaP暴露對(duì)GD18胎鼠發(fā)育指標(biāo)的影響（±s）Table 1 Development indexes of GD18 fetal rats after BaP exposure (±s)

［注］與對(duì)照組相比，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001；與BaP組相比，# ：P＜0.05，###：P＜0.001。［Note］Compared with the control group,*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001;Compared with the BaP group,#:P＜0.05,###:P＜0.001.

組別Group胎鼠數(shù)Number of fetal rats體重/g Weight/g身長(zhǎng)/cm Body length/cm尾長(zhǎng)/cm Tail length/cm對(duì)照組（Control） 90 2.563±0.091 3.284±0.078 1.276±0.041 LiCl 組（LiCl ） 80 2.678±0.078 3.340±0.086 1.261±0.163植物油組（Soybean oil） 80 2.648±0.100 3.281±0.133 1.240±0.090 BaP組（BaP） 81 2.325±0.061*** 3.072±0.077** 1.135±0.068*LiCl 干預(yù)組LiCl intervention 83 2.669±0.096### 3.356±0.107### 1.206±0.041#― 17.60 8.04 3.38 P―＜0.001＜0.001 0.024 F

2.3 胎鼠海馬組織的形態(tài)學(xué)改變

光鏡下觀察，GD18 胎鼠海馬組織HE 染色結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組、LiCl 組和植物油組海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常。BaP 暴露組出現(xiàn)不同程度神經(jīng)元胞體縮小，核固縮，細(xì)胞染色加深，胞核胞質(zhì)分界不清，數(shù)量減少，而LiCl 干預(yù)組上述情況有所減輕。

圖2 BaP暴露對(duì)GD18胎鼠海馬神經(jīng)元病理學(xué)形態(tài)的影響（HE染色）Figure 2 Morphology of neurons in hippocampus of GD18 fetal rats after BaP exposure (HE staining)

2.4 胎鼠海馬組織pGSK-3β、GSK-3β 及β-catenin表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，BaP 暴露致pGSK-3β 表達(dá)水平降低（對(duì)照組和BaP 組的灰度值比值分別為0.87±0.04、0.50±0.04，F(xiàn)=19.64，P＜0.001），GSK-3β表達(dá)升高（對(duì)照組和BaP組的灰度值比值分別為1.53±0.14、2.09±0.11，F(xiàn)=5.90，P=0.011），β-catenin 表達(dá)降低（對(duì)照組和BaP組的灰度值比值分別為1.41±0.14、0.90±0.04，F(xiàn)=11.16，P=0.001）；LiCl干預(yù)可明顯逆轉(zhuǎn)由BaP暴露引起的pGSK-3β 表達(dá)降低、GSK-3β 表達(dá)升高及β-catenin表達(dá)降低的現(xiàn)象（其灰度值比值分別為：pGSK-3β，0.69±0.08，P=0.036；GSK-3β，1.59±0.15，P=0.042；β-catenin，1.33±0.08，P=0.006）。LiCl 組和植物油組的pGSK-3β、GSK-3β 及β-catenin 表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 BaP暴露后GD18 胎鼠海馬組織β-catenin、pGSK-3β及GSK-3β 表達(dá)水平（n=6）Figure 3 Expressions of β-catenin,pGSK-3β,and GSK-3β protein in hippocampus of GD18 fetal rats after exposure to BaP (n=6)

3 討論

日常生活中，人們可以接觸到的多環(huán)芳烴類物質(zhì)多種多樣，主要來源于有機(jī)物的不完全燃燒，如汽車尾氣、主/被動(dòng)吸煙、熏烤食物等［16］。BaP 作為典型的多環(huán)芳烴類物質(zhì)，其致癌性、致畸性和神經(jīng)毒性眾所周知［17-18］。由于BaP 具有較強(qiáng)的脂溶性，易透過胎盤屏障進(jìn)入胎兒血液中，隨血液循環(huán)系統(tǒng)透過血腦屏障，影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［19-20］。而目前關(guān)于外源化合物對(duì)BaP 孕期暴露所致胚胎毒性的干預(yù)作用的研究較少，尋找其預(yù)防藥物成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注熱點(diǎn)。LiCl 是臨床上廣泛應(yīng)用的情緒穩(wěn)定劑，在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)元的保護(hù)及神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化上具有很好的療效［14］。以往有研究表明雙向情感障礙患者過量或長(zhǎng)期的鋰治療可能會(huì)存在鋰中毒的風(fēng)險(xiǎn)［21］，而細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LiCl 對(duì)大鼠胚胎中腦神經(jīng)細(xì)胞僅具有細(xì)胞毒性，而非致畸物［22］，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，一定劑量的LiCl 對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有改善作用［23］。本研究選取了未對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性作用的LiCl 劑量進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)孕期BaP暴露引起的胚胎毒性的保護(hù)作用及分子調(diào)控機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，染毒結(jié)束后GD14 和GD18，BaP 組孕鼠體重增長(zhǎng)明顯下降，表明BaP 暴露能夠引起胚胎宮內(nèi)發(fā)育遲緩，GD18 時(shí)BaP 組胎兒體重、身長(zhǎng)及尾長(zhǎng)較對(duì)照組減小，證實(shí)BaP 暴露能夠通過慢性毒性蓄積過程對(duì)胚胎后期生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生持續(xù)影響。劉維春等［24］在大鼠孕期皮下注射尼古丁GD21 取出胎鼠，其身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)均較對(duì)照組減??；倫宗姬等［25］的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了大鼠孕前吸入香煙煙霧3 個(gè)月，GD20 麻醉取出胎鼠，發(fā)現(xiàn)胎鼠體重、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)也均較對(duì)照組降低。本研究中LiCl 干預(yù)能夠明顯改善BaP 暴露引起的宮內(nèi)發(fā)育遲緩和胎鼠生長(zhǎng)受限，說明LiCl 能夠緩解BaP 暴露導(dǎo)致的胚胎發(fā)育遲緩。

腦組織神經(jīng)元的正常生長(zhǎng)是胚胎神經(jīng)發(fā)育的基礎(chǔ)。梁婧等［26］于孕前15 d經(jīng)口給予大鼠BaP（2 mg·kg-1·d-1），GD9 時(shí)取出胚胎觀察胚胎形態(tài)，發(fā)現(xiàn)胚胎內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)異常凋亡結(jié)構(gòu)等胚胎損傷。本實(shí)驗(yàn)利用HE 染色技術(shù)對(duì)海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，BaP 組胎鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞呈現(xiàn)部分胞體縮小，核固縮，細(xì)胞染色加深，胞核胞質(zhì)分界不清，LiCl 干預(yù)能明顯減少海馬組織神經(jīng)元固縮，表明孕期BaP 暴露可能導(dǎo)致胚胎神經(jīng)元細(xì)胞損傷，而LiCl 干預(yù)能發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

研究表明LiCl 能夠通過抑制GSK-3β 的活性，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和遷移，增加DG區(qū)新生神經(jīng)元數(shù)量［27-28］。為了闡明LiCl 改善BaP 暴露導(dǎo)致胚胎神經(jīng)毒性的分子調(diào)控過程，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了GD18 胎鼠海馬組織中pGSK-3β、GSK-3β 和β-catenin 的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，LiCl 組pGSK-3β、GSK-3β 及β-catenin 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LiCl 干預(yù)組較BaP 組pGSK-3β 蛋白表達(dá)升高，GSK-3β 蛋白表達(dá)降低及β-catenin 蛋白表達(dá)升高，提示40 mg·kg-1LiCl 單獨(dú)作用對(duì)GSK-3β 的磷酸化作用不大，但其與BaP 聯(lián)合作用時(shí)，可顯著改善BaP 所致的pGSK-3β 表達(dá)下降。苗利萍等［29］在LiCl 對(duì)異氟醚誘導(dǎo)發(fā)育期幼鼠海馬毒性的研究中也發(fā)現(xiàn)單獨(dú)LiCl 干預(yù)對(duì)GSK-3β 的磷酸化作用不大，但其可改善異氟醚誘導(dǎo)的幼鼠海馬毒性作用。以上結(jié)果提示LiCl 可通過調(diào)控GSK-3β/β-catenin 蛋白水平改善BaP 暴露所致胚胎毒性及海馬組織神經(jīng)元損傷。本研究通過構(gòu)建大鼠孕期BaP 暴露模型，探討氯化鋰對(duì)BaP 所致的胚胎神經(jīng)毒性的改善作用。結(jié)果表明，孕期BaP 暴露能夠引起胚胎生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及海馬神經(jīng)元病理學(xué)改變，LiCl 對(duì)上述形態(tài)學(xué)損傷有一定改善作用，其機(jī)制可能與LiCl 抑制GSK-3β 活性進(jìn)而提高β-catenin 的表達(dá)相關(guān)。值得深思的是，作為GSK的抑制劑，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)單獨(dú)LiCl 作用能夠引起pGSK-3β 表達(dá)的升高，這也正是我們需要進(jìn)一步通過不同干預(yù)劑量孕鼠給藥或者胎鼠直接給藥，從而進(jìn)行機(jī)制方面的深入研究和探討的關(guān)鍵所在，以期為尋求適宜的LiCl 作用劑量提供科學(xué)依據(jù)。