蘭 梅 張麗琴 胡靖鋒 徐學(xué)忠 楊紅麗 和江明

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，國(guó)家蔬菜改良中心云南分中心，云南昆明 650205）

葉用芥菜（Brassica junceaCoss.var.foliosaBailey）原產(chǎn)于中國(guó)，簡(jiǎn)稱葉芥菜，別名青菜、臘菜、春菜等，是十字花科蕓薹屬芥菜種中以葉片或葉球?yàn)楫a(chǎn)品器官的變種；喜冷涼濕潤(rùn)氣候，適應(yīng)性較強(qiáng)，品種繁多，長(zhǎng)江流域以南地區(qū)栽培較為普遍（劉佩英，1996）。早在19 世紀(jì)80 年代，國(guó)際飲食營(yíng)養(yǎng)及癌癥委員會(huì)（International Diets Nutrition and Cancer Committees）就建議多食用十字花科蔬菜，因?yàn)槭只剖卟烁缓哂谢瘜W(xué)預(yù)防特性的硫苷類(lèi)物質(zhì)，可以預(yù)防癌癥。Fahey 等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，4-甲基亞磺酰丁基硫苷（RAA）普遍存在于十字花科蕓薹屬蔬菜中，如芥菜、白菜、青花菜等，其水解產(chǎn)物萊菔硫烷（sulforaphane，SF）是迄今為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活性最強(qiáng)的物質(zhì)。流行病學(xué)和小鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，萊菔硫烷能夠顯著降低肝癌（Keck et al.，2003）、乳腺癌（Pawlik et al.，2013）、胃癌（Fahey et al.，2002）、前列腺癌（Cho et al.，2005）、結(jié)腸癌（Rong et al.，2003）、皮膚癌（Xu et al.，2006）等的發(fā)生幾率。當(dāng)前對(duì)萊菔硫烷的報(bào)道多集中在青花菜上(何洪巨 等，2003；Liang et al.，2006；張嬋娟 等，2007），且有研究表明萊菔硫烷/RAA 含量與基因型密切相關(guān)（Farnham et al.，2004；Abercrombie et al.，2005；邱海榮 等，2008；謝祝捷 等，2010）。

混合分組分析法（bulked segregant analysis，BSA）又稱集群分離分析法，是一種快速檢測(cè)與目標(biāo)性狀連鎖標(biāo)記的方法（Michelmore et al.，1991），現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物抗性基因、生長(zhǎng)相關(guān)性狀的篩選、鑒定等（白素蘭 等，2000；嚴(yán)長(zhǎng)杰 等，2000；Sun et al.，2009；Tripathi et al.，2009；史 明會(huì)，2013）。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定了葉用芥菜F2單株的萊菔硫烷含量，構(gòu)建F2混合分離群體（BSA）基因池，進(jìn)行與萊菔硫烷含量基因連鎖的SSR 分子標(biāo)記研究，以期為葉用芥菜新品種的選育和種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)，亦為研究萊菔硫烷的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試葉用芥菜材料由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所十字花科課題組提供（表1）。20 份材料均于2017 年11 月1 日播種，播種60 d 后每份材料分別隨機(jī)選取3 株，取中心幼嫩葉片頂端部位，采用HPLC 法測(cè)定萊菔硫烷含量，得到1 份萊菔硫烷含量最高的葉用芥菜材料太樂(lè)四季青，含量為（226.72 ± 8.04）mg · kg-1；1份萊菔硫烷含量最低的材料圓葉春菜，含量為（11.79 ± 0.53）mg ·kg-1。以太樂(lè)四季青為母本，以圓葉春菜為父本進(jìn)行雜交，2018 年4 月初收獲F1種子；6 月25 日加代播種F1，進(jìn)行套袋自交，11 月收獲F2種子，得到葉用芥菜萊菔硫烷含量分離群體材料。

表1 參試20 份葉用芥菜材料的品種名稱及來(lái)源

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉用芥菜F2萊菔硫烷含量的測(cè)定 2018 年12 月1 日播種100 份F2材料，播種60 d 后隨機(jī)選取80 個(gè)F2單株，分別取中心幼嫩葉片頂端部位，采用HPLC 法測(cè)定萊菔硫烷含量。

準(zhǔn)確稱取0.20 g 樣品放入研缽中磨碎，加入pH 值為7.0 的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol · L-1磷酸氫二鉀和0.1 mol · L-1磷酸二氫鉀）6.0 mL，37 ℃下酶解2.0 h，然后加入6 mL 乙酸乙酯（AR）繼續(xù)混勻30 min，4 000 r · min-1離心10 min，收集上清液；再重復(fù)提取2 次，將3 次收集的上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，旋蒸溫度為35 ℃；最后用6 mL 乙腈定容，過(guò)0.22 μm 濾膜后-20 ℃低溫保存待測(cè)。

采用Rigol L3000 高效液相色譜儀，紫外波長(zhǎng)201 nm；色譜柱：Kromasil C18 反相色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；時(shí)間：30 min；流速：0.8 mL · min-1；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相的配制：將超純水1 000 mL、甲醇1 000 mL用0.45 μm 的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱，甲醇∶水=35V∶65V。

1.2.2 葉用芥菜親本、F2各單株DNA 的提取 以親本太樂(lè)四季青、圓葉春菜及80 份F2單株幼嫩葉片為材料，采用2×CTAB 法（稱取EDTA 7.44 g、Tris 12.1 g 和NaCl 81.8 g，溶于800 mL 超純水中，用HCL 調(diào)pH 至8.0；再加入20 g CTAB，加熱至60 ℃使之溶解，用超純水定容至1 000 mL，37 ℃條件下保存）分別提取DNA（Fu et al.，2006）。然后用1×TE 溶解稀釋DNA 至50 ng · μL-1，檢測(cè)DNA 的質(zhì)量。置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 混合池的構(gòu)建 根據(jù)Michelmore 等（1991）提出的BSA 法，從F2群體中選取高萊菔硫烷含量和低萊菔硫烷含量單株各10 株，分別取10 μL DNA 混合均勻，構(gòu)成高萊菔硫烷含量池（H）和低萊菔硫烷含量池（L），并分別檢測(cè)DNA 質(zhì)量。

1.2.4 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) 根據(jù)蕓薹作物網(wǎng)（http：//www.brassica.info/tools/genetic_markers.html）公布的十字花科蕓薹屬共同引物和史明會(huì)（2013）關(guān)于青花菜中與RAA 含量相關(guān)的SSR 分子標(biāo)記研究結(jié)果，合成50 對(duì)引物用于PCR 擴(kuò)增。采用昆明碩擎生物科技有限公司提供的Golden Star T6 Super PCR Mix（1.1×），其中含有DNA polymerase、Buffer、dNTPs 等組分，添加上、下游引物和DNA 模板，利用梯度PCR 儀篩選引物退火溫度，最終得到適合葉用芥菜SSR 分析的體系（25 μL）：PCR Mix 22 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，72 ℃再延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；最后于4 ℃保存。

取PCR 反應(yīng)液5 μL，直接上樣，采用1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，在Bio-rad 凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.5 相關(guān)性驗(yàn)證 將初步篩選得到的引物在與其相對(duì)應(yīng)建立的F2高萊菔硫烷含量和低萊菔硫烷含量混合基因池中擴(kuò)增，進(jìn)一步確定篩選得到的引物具有穩(wěn)定遺傳的多態(tài)性。然后，再用篩選出來(lái)的引物在親本和F2分離群體中進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證其是否與萊菔硫烷目標(biāo)性狀連鎖，初步得到與萊菔硫烷含量相關(guān)的SSR 標(biāo)記及其引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉用芥菜F2 單株的萊菔硫烷含量

從表2 可以看出，80 個(gè)葉用芥菜F2單株中，萊菔硫烷含量相對(duì)較高的10 個(gè)單株編號(hào)分別為50、38、5、57、4、68、32、59、40、55，萊菔硫烷含量相對(duì)較低的10 個(gè)單株編號(hào)分別為74、7、16、73、69、15、71、43、24、22。

表2 葉用芥菜F2 單株萊菔硫烷含量的測(cè)定結(jié)果

2.2 DNA 的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 親本及F2單株DNA 的檢測(cè)結(jié)果 供試葉用芥菜親本太樂(lè)四季青、圓葉春菜及80 個(gè)F2單株提取的DNA 均表現(xiàn)為條帶清晰、整齊，無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明提取的DNA 質(zhì)量較好。利用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)顯示，親本以及80 個(gè)F2單株DNA 樣品濃度在800～2 000 ng · μL-1之間，A260/280在1.8～2.0之間，所提取的DNA 質(zhì)量能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。

2.2.2 混合池DNA 的檢測(cè)結(jié)果 分別取10 個(gè)萊菔硫烷含量較高的F2單株的DNA 各10 μL，等量混合，構(gòu)成H 池；再分別取10 個(gè)萊菔硫烷含量較低的F2單株的DNA 各10 μL，等量混合，構(gòu)成L 池。利用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)顯示，H 池DNA 濃度為92.5 ng · μL-1，A260/280為1.852；L 池DNA 濃度為86.7 ng · μL-1，A260/280為1.829?？梢詽M足后續(xù)的PCR 擴(kuò)增。

2.3 引物的篩選

用50 對(duì)引物組合對(duì)葉用芥菜親本太樂(lè)四季青和圓葉春菜進(jìn)行初步篩選，結(jié)果表明有16 對(duì)引物在雙親間表現(xiàn)出多態(tài)性；然后根據(jù)BSA 法構(gòu)建的高、低萊菔硫烷含量池進(jìn)一步篩選，得到9 對(duì)多態(tài)性引物（圖1）。

2.4 多態(tài)性引物的驗(yàn)證結(jié)果

將9 對(duì)多態(tài)性引物在高、低萊菔硫烷含量池的單株中進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到2 個(gè)SSR 多態(tài)性標(biāo)記SF12 和SF28，引物信息見(jiàn)表3 和圖2。

表3 2 個(gè)SSR 多態(tài)性標(biāo)記的引物序列

SF12 和SF28 都是顯性標(biāo)記，SF12 在父本圓葉春菜、低萊菔硫烷含量池L 和低萊菔硫烷含量池單株中均擴(kuò)增出大小約為250 bp 的條帶，而在母本太樂(lè)四季青、高萊菔硫烷含量池H 和高萊菔硫烷含量池單株中相應(yīng)位置未擴(kuò)增出條帶（圖2-A、B）；SF28 在母本太樂(lè)四季青、高萊菔硫烷含量池H 和高萊菔硫烷含量池單株中均擴(kuò)增出大小約為250 bp 的條帶，而在父本圓葉春菜、低萊菔硫烷含量池L 和低萊菔硫烷含量池單株中相應(yīng)位置未擴(kuò)增出條帶（圖2-C、D）。

M，BM 2000+DNA Marker；P1，太樂(lè)四季青；P2，圓葉春菜；H，高萊菔硫烷含量池；L，低萊菔硫烷含量池；H1～H10，高萊菔硫烷含量池單株；L1～L10，低萊菔硫烷含量池單株。

2.5 SF12 和SF28 在F2 群體中的擴(kuò)增結(jié)果

由圖3 可知，SF12 在低含量萊菔硫烷親本圓葉春菜和F2部分萊菔硫烷含量相對(duì)較低的單株中擴(kuò)增出條帶（圖3-A），而SF28 在高含量萊菔硫烷親本太樂(lè)四季青和F2部分萊菔硫烷含量相對(duì)較高的單株中擴(kuò)增出條帶（圖3-B），進(jìn)一步驗(yàn)證了這2 對(duì)引物與葉用芥菜中萊菔硫烷含量性狀的相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)萊菔硫烷的醫(yī)學(xué)價(jià)值報(bào)道較多，對(duì)葉用芥菜中萊菔硫烷含量的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以2 個(gè)萊菔硫烷含量差異較大的葉用芥菜高代自交系為親本雜交得到的F2分離群體為研究背景，利用BSA 法并結(jié)合SSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行萊菔硫烷含量相關(guān)的分子標(biāo)記篩選，初步確定了2 個(gè)與葉用芥菜中萊菔硫烷含量連鎖的標(biāo)記。

當(dāng)前對(duì)十字花科蔬菜萊菔硫烷的報(bào)道多集中在青花菜上，李占省等（2012）結(jié)合青花菜DH 群體花球中萊菔硫烷含量，最終獲得了與萊菔硫烷含量相關(guān)的13 個(gè)QTL，這些QTL 位點(diǎn)分布于4 條連鎖群上。史明會(huì)（2013）研究了青花菜中與RAA 相關(guān)的SSR 分子標(biāo)記，得到4 個(gè)與萊菔硫烷的前體物質(zhì)RAA 相關(guān)基因緊密連鎖的多態(tài)性標(biāo)記。本試驗(yàn)測(cè)定了葉用芥菜葉片中萊菔硫烷的含量，結(jié)果顯示不同品種間含量差異較大，但本試驗(yàn)沒(méi)有驗(yàn)證不同時(shí)期葉用芥菜葉片中萊菔硫烷含量是否差異較大；本試驗(yàn)雖然初步獲得了2 個(gè)與葉用芥菜中萊菔硫烷含量連鎖的標(biāo)記，但由于F2群體較小，試驗(yàn)結(jié)果的精確性可能會(huì)受到影響，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。