張綿松，賈愛榮，史亞萍，劉雪，趙福江，劉昌衡 *

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250103；2.山東省海珍品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103；3.中澳特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103）

羅漢參（俗稱香芋），主要種植于魯西南平原地區(qū)，為多年蔓生草本植物，其塊根呈圓球形或不規(guī)則長圓形，長3 cm～5 cm，表皮呈土黃色，上有斷續(xù)的環(huán)狀紋理，肉質(zhì)潔白細(xì)嫩。魯西南地區(qū)居民通常將羅漢參作為藥膳食用，也有少量報(bào)道認(rèn)為羅漢參有預(yù)防某些慢性疾病的作用，但相關(guān)的現(xiàn)代科學(xué)研究報(bào)告較少。劉彬[1]研究結(jié)果表明，生、熟羅漢參中抗性淀粉的含量均高于土豆、芋頭、地瓜和山藥等4種常見的薯類，另外韓文婷[2]研究表明羅漢參具有降低糖尿病小鼠血糖和改善糖耐量的作用，因此羅漢參可能成為天然抗性淀粉的良好食物來源。

抗性淀粉（resistant starch，RS）可以用來提高食物的纖維含量[3]，根據(jù)美國谷物化學(xué)家協(xié)會(huì)和美國國家科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究所食品營養(yǎng)委員會(huì)的定義，RS可以被歸類為一種膳食纖維，RS似乎對(duì)人類結(jié)腸健康有相當(dāng)大的好處，但對(duì)脂質(zhì)和葡萄糖代謝的影響較小。此外，在Eerlingen等[4]的研究中，X-射線衍射被用來對(duì)RS的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RS是由支鏈淀粉首先形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，再由該結(jié)構(gòu)堆積進(jìn)一步形成B型結(jié)晶，此外還包含少量的支鏈淀粉、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)，所以RS的化學(xué)結(jié)構(gòu)并不同于纖維，仍是淀粉類物質(zhì)。作為一種新型的食品添加劑，RS具有降低血糖和胰島素的反應(yīng)，適合肥胖病人和糖尿病人食用，對(duì)調(diào)節(jié)人體健康起到重要的作用。本研究為拓寬羅漢參淀粉的應(yīng)用范圍，對(duì)其基本的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，并采用高血糖模型小鼠對(duì)羅漢參淀粉的降糖活性進(jìn)行初步的研究，為羅漢參淀粉在普通食品或輔助降血糖功能食品中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

羅漢參淀粉：山東省科學(xué)院生物研究所食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室自制[5]；SPF級(jí)KM小鼠，雄性，體重18 g～20 g（質(zhì)量合格證號(hào)：37009200019058）、基礎(chǔ)飼料、墊料：濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；拜糖平：拜耳醫(yī)藥保健有限公司；蔗糖：山東東都食品有限公司；膽酸鈉、膽固醇：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；豬油：臨沂新程金鑼肉制品集團(tuán)有限公司；肝糖原測(cè)定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；血糖測(cè)定試紙：上海羅氏制藥有限公司；鏈脲佐菌素：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；胃蛋白酶（1∶10 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；α-淀粉酶（26 000 RAU/g）：丹尼斯克（中國）有限公司；葡萄糖淀粉酶（10萬U/mL）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3，5-二硝基水楊酸：上海源葉生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

EX124ZHIAD電子天平：美國奧豪斯儀器有限公司；SUPRATM55熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡：德國蔡司公司；HHS21-4-S水浴鍋：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ACCU-CHEK Active血糖測(cè)定儀：上海羅氏制藥有限公司；INFINITE 200 PRO酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；TU-1810S紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DW-86W100超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；TDL-5-A臺(tái)式大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RVA-TecMaster快速黏度分析儀：瑞典波通儀器公司。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 淀粉含量的測(cè)定

按照GB 5009.9—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中淀粉的測(cè)定》的測(cè)定方法進(jìn)行[6]。具體方法為酸水解法，試樣經(jīng)除去脂肪及可溶性糖類后，其中淀粉用酸水解成具有還原性的單糖，然后按還原糖測(cè)定，并折算成淀粉。

1.3.2 抗性淀粉含量測(cè)定

改良Goni法[7-8]，具體試驗(yàn)步驟如下。

1）準(zhǔn)確稱取2.000 g樣品，置于250 mL三角瓶中。添加HCl-KCl緩沖溶液（pH值2.0～4.0）20 mL，加入胃蛋白酶20 mg，60℃水浴振蕩1 h，以除去樣品中的蛋白質(zhì)。

2）取出，冷卻至25℃，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)整pH值至5.4，加入耐高溫α-淀粉酶20 μL，90℃水浴振蕩16 h，酶解糊化狀態(tài)的淀粉為小分子的糊精。

3）加入4倍體積的無水乙醇沉淀，4 000 r/min離心20 min；棄去上清液，沉淀用80%乙醇洗滌3遍，徹底洗去葡萄糖。

4）用4 mol/L KOH溶解沉淀，調(diào)整pH值至4.1～4.3，加入葡萄糖淀粉酶 20 μL，40 ℃水解 45 min；沸水浴加熱 5 min；4 000 r/min離心20 min，收集上清液，10 mL蒸餾水洗滌沉淀2次；上清液合并，定容至100 mL。

5）使用 3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定上清液中還原糖含量，在DNS反應(yīng)中，3，5-二硝基水楊酸與還原糖經(jīng)過共熱后被還原成棕紅色，在一定范圍內(nèi)，溶液的顏色與還原糖的含量成正比。測(cè)定樣品在540 nm下的吸光值，經(jīng)過相應(yīng)的換算，得到還原糖的含量。

6）抗性淀粉含量的計(jì)算：還原糖數(shù)據(jù)乘以0.9即為抗性淀粉質(zhì)量。

抗性淀粉含量/%=抗性淀粉的質(zhì)量/總淀粉的質(zhì)量×100

1.3.3 持水性的測(cè)定

稱取1.00 g樣品分散于15 mL蒸餾水中，分別置于45、55、65、75、85℃水浴加熱 30 min，冷卻至 25 ℃后，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，稱沉淀質(zhì)量[9]。

持水性/%=沉淀質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100

1.3.4 透明度的測(cè)定

取1 g淀粉樣品加水配成1%的淀粉乳液，100℃保溫15min，冷卻至25℃后以蒸餾水為空白測(cè)定620nm下的透光率[9]。

1.3.5 膨潤度的測(cè)定

取0.50 g的干燥淀粉與25 mL蒸餾水在預(yù)先稱重的50 mL離心管中混勻，置于95℃水浴鍋內(nèi)振蕩30 min。然后在3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，稱量離心后沉淀物質(zhì)量[9]。按照以下公式計(jì)算樣品的膨潤度。

膨潤度/%=離心后沉淀物質(zhì)量/樣品質(zhì)量×100

1.3.6 凍融穩(wěn)定性的測(cè)定

取一定量的淀粉樣品，配成6%的淀粉乳，100℃加熱20 min，冷卻至25℃，然后-20℃冷凍24 h，取出自然解凍，在5 000 r/min離心15 min，去除上清液，稱重[9]，按照以下公式計(jì)算樣品的析水率。

析水率/%=離心后上清液質(zhì)量/離心前淀粉乳的質(zhì)量×100

1.3.7 黏度特性的測(cè)定

取淀粉樣品3.0000g，置于測(cè)定鋁筒內(nèi)，加25.00mL蒸餾水，用攪拌器槳葉在試樣中上下劇烈攪動(dòng)10次，然后將樣品置于快速黏度分析儀（rapid viscosity analyzer，RVA）中，攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)速度為 160 r/min。RVA初始溫度為50℃保持1 min，然后以12℃/min升高至95℃，在95℃保持2.5 min，再以12℃/min降到50℃保持2.5 min，每測(cè)定一個(gè)樣品需用時(shí)13 min[10-11]。

1.3.8 淀粉的顆粒形態(tài)表征

將經(jīng)過干燥和良好碾磨后純化的抗性淀粉均勻分布在粘有導(dǎo)電雙面膠的樣品臺(tái)面上，真空條件下噴上一層鉑金薄膜，然后固定在載物臺(tái)上，置于掃描電子顯微鏡下觀察，并拍攝不同淀粉樣品顆粒的照片[12]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 高血糖小鼠模型的建立

1.4.1.1 高脂高糖飼料配方（100 kg）及制作方法

小鼠基礎(chǔ)飼料66.5 kg、蔗糖20 kg、膽酸鈉1 kg、豬油10 kg、膽固醇2.5 kg[13]。具體制作方法為：基礎(chǔ)飼料粉碎過篩，混入干料，然后拌入豬油，加適量水壓入塊狀模具，成型后倒出，50℃干燥后直接飼養(yǎng)試驗(yàn)小鼠。

1.4.1.2 鏈脲佐菌素注射造模

在適應(yīng)性飼喂1～2周之后，選擇所要造模的KM小鼠，禁食不禁水16h后，尾靜脈注射鏈脲佐菌素（1%，醫(yī)用生理鹽水注射液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光）45 mg/kg BW空白對(duì)照組注射等劑量醫(yī)用生理鹽水注射液。

1.4.1.3 造模成功的判斷

繼續(xù)喂養(yǎng)1周～2周后，禁食3h采集鼠尾血用血糖測(cè)定儀測(cè)定小鼠的空腹血糖值，根據(jù)保健食品輔助降血糖功能評(píng)價(jià)方法中的規(guī)定，空腹血糖值10 mmol/L～25 mmol/L為高血糖模型成功動(dòng)物，將造模成功小鼠和未成功小鼠分開標(biāo)記飼養(yǎng)，以備下一步實(shí)驗(yàn)分組。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組

將實(shí)驗(yàn)用高血糖模型小鼠和正常KM小鼠進(jìn)行隨機(jī)分配，一共分為4組：空白對(duì)照組（正常小鼠25只，喂養(yǎng)普通飼料）；模型對(duì)照組（高血糖模型小鼠25只，喂養(yǎng)普通飼料）；抗性淀粉組（高血糖模型小鼠25只，喂養(yǎng)含羅漢參淀粉飼料）；陽性對(duì)照組（高血糖模型小鼠25只，除了喂養(yǎng)普通飼料之外，每天灌胃一次拜糖平溶液，劑量為24.9 mg/kg BW）。

1.4.3 含羅漢參淀粉的飼料配方及制作方法

羅漢參淀粉10%，基礎(chǔ)飼料88%，另外為了防止淀粉的增加，減少飼料中蛋白質(zhì)的含量，補(bǔ)充2%酪蛋白到飼料中以平衡飼料中蛋白質(zhì)供給量。制作方法同1.4.1.1。

1.4.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

在標(biāo)記分組之后，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)正式開始，30 d后尾部取血，采用試紙法測(cè)定各組小鼠的空腹血糖值，然后脫頸處死，立即進(jìn)行解剖，取出肝臟，稱重后勻漿-80℃凍存，按照肝糖原試劑盒上的方法進(jìn)行操作測(cè)定肝糖原含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均使用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。若計(jì)量資料的方差齊，采用單因素方差分析最小顯著性差異法檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；若計(jì)量資料的方差不齊，采用單因素方差分析檢驗(yàn)，p＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性淀粉含量、透明度、膨潤度、凍融穩(wěn)定性

羅漢參淀粉和玉米淀粉的抗性淀粉含量、透明度、膨潤度和凍融穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 羅漢參淀粉與玉米淀粉的部分理化指標(biāo)比較Table 1 Comparison of some physicochemical properties between Luohanshen starch and corn starch

從表1可以看出，羅漢參淀粉在透明度和膨潤度明顯優(yōu)于同濃度的玉米淀粉；而兩者在衡量凍融穩(wěn)定性的析水率方面沒有顯著性差異。

2.2 黏度特性

RVA儀測(cè)定結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 羅漢參淀粉的RVA譜圖Fig.1 RVA spectrum of Luohanshen starch

圖2 玉米淀粉的RVA譜圖Fig.2 RVA spectrum of corn starch

數(shù)據(jù)表明，羅漢參淀粉的糊化溫度79.15℃、峰值黏度4 097 cP、保溫黏度2 266 cP、最終黏度3 315 cP、衰減值18 31 cP、回生值1 049 cP。玉米淀粉的糊化溫度78.25℃、峰值黏度3 062 cP、保溫黏度2 254 cP、最終黏度3 544 cP、衰減值808 cP、回生值1 290 cP。羅漢參淀粉的糊化溫度、保溫黏度均大于玉米淀粉，說明羅漢參淀粉比玉米淀粉難糊化，且黏度穩(wěn)定性較好。糊化溫度與淀粉的直鏈淀粉含量、分支的長短以及結(jié)晶的致密程度等因素都顯著相關(guān)，一般直鏈淀粉含量低、淀粉顆粒較大、結(jié)構(gòu)比較疏松的淀粉較容易糊化[14]。淀粉糊在達(dá)到低谷黏度后，隨著溫度的繼續(xù)下降，淀粉糊發(fā)生老化、回生現(xiàn)象。淀粉分子之間經(jīng)氫鍵連接，重新締合行程聚集體，導(dǎo)致淀粉糊黏度再次升高，達(dá)到最終黏度。羅漢參淀粉的最終黏度和回生值均比玉米淀粉的低，說明羅漢參淀粉在降溫階段的穩(wěn)定性比玉米淀粉好，不易老化。

2.3 持水性

羅漢參淀粉與玉米淀粉持水性比較見圖3。

圖3 羅漢參淀粉與玉米淀粉持水性比較Fig.3 Comparison of water holding capacity between Luohanshen starch and corn starch

淀粉分子在水中形成親水性膠體，隨著溫度的升高，淀粉分子逐漸糊化斷裂，生成更多氫鍵[10]。羅漢參淀粉在45℃～75℃的溫度區(qū)間里，持水性趨勢(shì)大致相同，但是在接近它們的糊化溫度時(shí)，也就是在75℃～85℃的溫度區(qū)間里，羅漢參淀粉的持水性超過玉米淀粉，這是因?yàn)榈矸酆^程大量吸水的緣故。最終在85℃的條件下，玉米淀粉的持水性在900%左右，而羅漢參淀粉的持水性超過1 400%。

2.4 微觀結(jié)構(gòu)

羅漢參淀粉顆粒形態(tài)見圖4。

圖4 羅漢參淀粉顆粒形態(tài)Fig.4 Morphology of Luohanshen starch granule

淀粉植物來源不同，顆粒大小和形貌也會(huì)相異，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)有單粒、復(fù)粒，淀粉顆粒與淀粉來源在形貌上具有相似性[15]。電鏡圖片顯示羅漢參淀粉的顆粒形狀為橢圓形，與羅漢參的外形相似，淀粉顆粒大小約為3 μm～8 μm。1 000倍的電鏡圖顯示羅漢參淀粉顆粒呈不規(guī)律的團(tuán)聚狀態(tài)。

2.5 羅漢參淀粉體內(nèi)降血糖活性

喂養(yǎng)4周后實(shí)驗(yàn)各組小鼠的血糖值變化如圖5。

圖5 各組小鼠的血糖值的變化Fig.5 The column diagram of blood glucose value changes in each group

從圖5可以看出，在第0周，陽性對(duì)照組、模型對(duì)照組、羅漢參淀粉組的小鼠血糖均值在11 mmol/L左右，空白對(duì)照組試驗(yàn)小鼠的平均血糖值為8 mmol/L，陽性對(duì)照組、模型對(duì)照組、羅漢參淀粉組的小鼠血糖值與空白對(duì)照小鼠的血糖值差異極顯著（p＜0.01）。4周之后，測(cè)定的血糖值顯示，陽性對(duì)照組和羅漢參淀粉組的小鼠血糖值較第0周的血糖值出現(xiàn)明顯下降，而模型對(duì)照組和空白對(duì)照組的小鼠血糖值均略有上升。另外，第4周陽性對(duì)照組和羅漢參淀粉組的血糖值與模型對(duì)照組的血糖值差異極顯著（p＜0.01），且均低于模型對(duì)照組小鼠血糖值，說明羅漢參淀粉有助于控制小鼠血糖值。

在喂養(yǎng)4周之后，實(shí)驗(yàn)各組小鼠的肝糖原的組間比較如圖6。

圖6 4周后各組小鼠肝糖原含量比較Fig.6 The column diagram of liver glycogen content in each group after four weeks

II型糖尿病患者的一個(gè)特點(diǎn)是肝葡萄糖輸出量持續(xù)增加，以及胰島素抵制作用，所以肝糖原含量與糖尿病有著密切的聯(lián)系，肝臟組織中的肝糖原含量的變化可有效反映出機(jī)體對(duì)于胰島素含量的敏感程度[16]。從圖6中可以看到，模型對(duì)照組的模型小鼠的肝糖原含量與空白對(duì)照組的正常小鼠的肝糖原含量具有顯著差異（p＜0.05）。模型小鼠的胰島素的分泌受到了藥物的干擾，肝糖原含量的波動(dòng)正是胰島素含量變化的表征。然而飼養(yǎng)含羅漢參淀粉的飼料，使得羅漢參淀粉組的小鼠的肝糖原含量在4周后與空白對(duì)照組的小鼠肝糖原含量基本一致（p>0.05）。

3 結(jié)論

經(jīng)與玉米淀粉進(jìn)行對(duì)比研究，羅漢參淀粉在抗性淀粉含量、透明度、膨潤度、糊化溫度、降溫階段穩(wěn)定性、持水性等指標(biāo)均高于玉米淀粉，具有較好的加工特性；以高血糖模型小鼠為評(píng)價(jià)模型，血糖值和肝糖原含量為指標(biāo)，討論羅漢參抗性淀粉對(duì)高血糖模型小鼠的降血糖作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在喂養(yǎng)羅漢參淀粉4周后，高血糖模型小鼠的血糖值得到明顯降低，且肝糖原含量與正常小鼠的肝糖原保持一致。由此可以推斷，在日常飲食中加入羅漢參淀粉，可以有效改善高血糖病人的血糖值和肝糖原含量等指標(biāo)，所以羅漢參淀粉是高血糖人群良好的碳水化合物來源。