代永聯(lián) 郝小靜 衣服德 白光燁 檀學進 馮永勝

摘? 要：從青島地區(qū)某雞場污水中分離出一株具有裂解特性的雞源宋內(nèi)志賀菌噬菌體，暫編號為PG2-01。經(jīng)透射電鏡觀察，該噬菌體為肌尾噬菌體，頭部直徑約70 nm，呈立體對稱二十面體。試驗測定，該噬菌體裂變能力強，潛伏時間短，能在較長時間內(nèi)維持較強的裂解能力，能夠適應(yīng)的酸堿度、溫度范圍較廣。預(yù)防試驗中，90%以上的雛雞能得到有效預(yù)防，這對該噬菌體的研究有深遠的實踐意義及很高的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：宋內(nèi)志賀菌;噬菌體;分離;裂解性;生物學特性

中圖分類號：S858.31 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2021）02-0082-05

動物和人類都能感染志賀菌，感染后會出現(xiàn)腹瀉等一系列癥狀，通常人們將志賀菌劃分為4個群，A群痢疾志賀菌、B群福氏志賀菌、C群鮑氏志賀菌和D群宋內(nèi)志賀菌[1]。宋內(nèi)志賀菌是導(dǎo)致禽類細菌性痢疾的主要病原菌之一，目前主要使用抗菌藥物防治禽類宋內(nèi)志賀菌性痢疾，但由于細菌耐藥性的產(chǎn)生，多數(shù)抗菌藥物的防治效果差。大量使用抗生素，一方面會由于細菌耐藥性增強、藥物副作用大對畜禽健康造成危害，另一方面畜禽產(chǎn)品的藥物殘留會直接影響人類的食品安全。噬菌體廣泛存在于自然環(huán)境中，具有較強的特異性，可在特定細菌內(nèi)增殖，裂解細菌，達到殺滅和清除細菌的目的。噬菌體在耐藥性細菌防治上具有很好的效果，無副作用，無藥物殘留，安全綠色，利于畜禽健康養(yǎng)殖。開展家禽宋內(nèi)志賀菌性痢疾噬菌體的研究，對相關(guān)疾病的預(yù)防和治療具有很大的應(yīng)用價值。

1? 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和噬菌體來源

宋內(nèi)志賀菌菌種從發(fā)病雞分離純化取得，由上海派森諾基因科技有限公司經(jīng)16S rDNA 測序鑒定;噬菌體分離自青島某雞場污水。

1.1.2 試劑

SM懸浮液;營養(yǎng)瓊脂（NA）半固體、固體、液體培養(yǎng)基;營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基;磷鎢酸（pH 6.7，濃度2%）;氯化鈉等試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離

取30 mL污水加入100 mL滅菌NB培養(yǎng)基，加入0.6 mL對數(shù)期宋內(nèi)志賀菌菌液，36 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，取出靜置60 min，12 000 r/min離心10 min，用0.22 um濾膜過濾上清液，取得噬菌體原液。取0.2 mL噬菌體原液與? ? ? ? 0.2 mL對數(shù)期宋內(nèi)志賀菌菌液均勻混合，室溫靜置15 min，使細菌表面均勻吸附噬菌體，與7 mL 56 ℃的NA半固體培養(yǎng)基均勻混合，迅速倒入NA固體培養(yǎng)基上制成雙層平板，凝固后將平板倒置，36 ℃培養(yǎng)16 h，觀察噬菌斑。

1.2.2 噬菌體純化

挑取中間透亮、直徑約2 mm的單個噬菌斑，移入1 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃水浴30 min，使噬菌體充分逸出，然后按“1.2.1 噬菌體分離”介紹的方法離心過濾，與0.2 mL對數(shù)期宋內(nèi)志賀菌菌液等量混合均勻，移入? 2 mL液體NA培養(yǎng)基中。依次純化5次，獲得高純度的噬菌體。

1.2.3 噬菌體觀察

在專用銅網(wǎng)上滴加效價為1×109 PFU/mL的噬菌體20 uL，室溫放置20 min，用濾紙吸除多余的液體，1.5%磷鎢酸負染15 min～ 20 min，吸除多余染色液并自然干燥，透射電鏡下觀察噬菌體形態(tài)。

1.2.4 噬菌體生物學特性觀察及效價測定

用無菌生理鹽水將0.2 mL純化的噬菌體按10-1～10-9濃度梯度稀釋，每個濃度分別取? ?0.2 mL，加入0.2 mL菌液混合均勻，按“1.2.1 噬菌體分離”介紹的方法鋪NA雙層板，每個濃度的噬菌體做3個平行，觀察噬菌斑情況。取濃度適當、噬菌斑數(shù)量在30～300個之間的平板進行計數(shù)，以3個平行板的噬菌斑計平均數(shù)，計算噬菌體效價（PFU/mL=稀釋倍數(shù)×平均板數(shù)×5）。

1.2.5 測定噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

取宋內(nèi)志賀菌對數(shù)期菌懸液，按照0.001∶1、0.01∶1、0.1∶1、1∶1、10∶1、100∶1等比例加入噬菌體充分混合，靜置15 min，36 ℃培養(yǎng)15 h，按“1.2.1 噬菌體分離”介紹的方法離心過濾，采用雙層平板法，測定其最佳感染復(fù)數(shù)。

1.2.6 噬菌體一步式生長曲線測定

取對數(shù)期宋內(nèi)志賀菌，根據(jù)感染復(fù)數(shù)加入噬菌體，36 ℃培養(yǎng)15 h，11 000 r/min離心1 min，棄上清，洗滌2次，36 ℃預(yù)熱NB培養(yǎng)基，重懸沉淀，培養(yǎng)，測定其效價，參照杜崇濤[2]推薦的方法評價，繪制一步式生長曲線，計算發(fā)生裂解的具體規(guī)模。

1.2.7 噬菌體對溫度和pH的敏感性測定

在50 mL NB中接種一個宋內(nèi)氏志賀菌菌落，170 r/min培養(yǎng)12 h進入對數(shù)生長期，分別取0.5 mL至50 mL液體NA培養(yǎng)基中，于36 ℃、170 r/min培養(yǎng)15 h至對數(shù)生長前期，標記后各取0.3 mL置于96孔板中，用酶標儀測量OD600值，作為前期OD600值。

參照高苗等[3]介紹的方法對噬菌體溶液進行如下處理：（1）取7份1 mL噬菌體原液，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃水浴鍋加熱30 min;（2）取7份1 mL噬菌體原液，加入pH范圍在4～10的30 ℃液體NA培養(yǎng)基中，在36 ℃的水中溫熱8 min;每次取0.3 mL測量OD600值，此處的OD600值稱為后期OD600值，前期OD600值和后期OD600值之間的差稱為OD600差。上述測試重復(fù)3次，獲得平均值。

1.2.8 噬菌體預(yù)防試驗

將60羽15日齡雛雞隨機分為3組，每組20羽。第1組為空白對照組，接種生理鹽水0.3 mL;第2組為感染對照組，接種0.3 mL效價為1.05×107 CFU/mL的宋內(nèi)志賀菌;第3組為試驗組，每羽雞肌內(nèi)注射0.3 mL效價為1.05×109 PFU/mL的噬菌體;24 h后各組用1.05×107 CFU/mL的宋內(nèi)志賀菌攻毒，每羽雞接種0.3 mL，記錄各組雛雞死亡情況。

2? 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離與純化

噬菌體PG2-01是通過雙層平板法將雞場污水和宋內(nèi)志賀菌共同培養(yǎng)，并選擇中間透亮的最大噬菌斑，經(jīng)反復(fù)純化獲得邊緣光滑的圓形透明噬菌斑，其直徑為1 mm～2 mm，詳細情況參見圖1和圖2。

2.2 噬菌體的電鏡觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PG2-01噬菌體頭部為二十面體立體對稱結(jié)構(gòu)，直徑約為70 nm，有一可伸縮的尾鞘（圖3）。按照國際病毒分類委員會的分類規(guī)則，PG2-01屬于有尾噬菌體目。

2.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測定

完成宋內(nèi)志賀菌和噬菌體混合培養(yǎng)后采用雙層平板法對其效價進行測定（表1），當感染復(fù)數(shù)為0.01時，其效價為2.85×109 PFU/mL，是6個配比中最高的，因此0.01是PG2-01感染宋內(nèi)志賀菌的最佳感染復(fù)數(shù)。

2.4 繪制噬菌體PG2-01一步生長曲線

按照圖4顯示的生長曲線發(fā)現(xiàn)，在整個感染過程中，PG2-01的裂解量大約為186，潛伏時間約為20 min，暴發(fā)時長大約為40 min，隨后進入穩(wěn)定期。

2.5 噬菌體PG2-01敏感性測定

2.5.1 噬菌體PG2-01對溫度的耐受力

溫度范圍處在30 ℃～60 ℃的菌液， OD600值的前后差值處于0以下，即加入經(jīng)過純化的噬菌體后，PG2-01將宋內(nèi)志賀菌裂解并造成其死亡，間接表示噬菌體在溫度為30 ℃～ 60 ℃的環(huán)境中活性最高，30 ℃～40 ℃的環(huán)境中菌液濃度最小，表明在30 ℃～40 ℃環(huán)境中的PG2-01噬菌體擁有最高的自身活性以及最強的裂解能力。當處理溫度達到70 ℃后菌液OD600值在后期培養(yǎng)過程中明顯升高，說明噬菌體在溫度為70 ℃的環(huán)境中喪失自身活性（圖5）。

2.5.2 噬菌體PG2-01對酸堿的耐受能力

pH為5～8時，菌液OD600差值都在0以下，這表示此時PG2-01的殺菌能力最強，當pH為4、9和10時，差值回到0以上，說明PG2-01的殺菌能力在該pH范圍有所降低，pH低于4或高于9的環(huán)境不適合PG2-01殺菌和繁殖（圖6）。

2.6 噬菌體PG2-01對宋內(nèi)志賀菌感染的預(yù)防效果

由表2可知，感染之前預(yù)防性肌內(nèi)注射噬菌體可有效預(yù)防雛雞的感染，成活率比空白對照組的提高20%，對雛雞的保護率可以達到90%，而感染對照組的成活率僅有30%，與空白對照組的相比降低了40%。

3? 結(jié)論

PG2-01噬菌體能分解殺滅宋內(nèi)志賀菌，具有生物特異性強、繁殖快、耐力好、環(huán)境適應(yīng)性強、安全有效、成本低廉等優(yōu)點，對雞有很強的保護作用，發(fā)展前景非常廣闊，具有很強的應(yīng)用價值。

4? 討論

志賀菌會導(dǎo)致雞發(fā)生以腹瀉為主要癥狀的傳染病。不同日齡、品種的雞都可感染志賀菌，成年雞的死亡率和發(fā)病率低于雛雞的[4]。近年來，雞志賀菌的多重耐藥性呈明顯增高的趨勢，宋內(nèi)志賀菌的感染比例也呈現(xiàn)增高趨勢，因此研究無抗藥性的志賀菌噬菌體勢在必行。作者對該噬菌體的環(huán)境耐受能力進行了研究，結(jié)果顯示其耐受能力較強，在較寬的pH及溫度范圍內(nèi)都表現(xiàn)出極強的噬菌能力。預(yù)防性試驗發(fā)現(xiàn)，噬菌體PG2-01對雛雞具有較高的保護率，可以有效提高雛雞的成活率。

參考文獻

[1] 王建.我國宋內(nèi)氏志賀菌流行特征、耐藥性及變異研究[D].北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，2016.

[2] 杜崇濤，大腸桿菌O157噬菌體的分離鑒定及其初步應(yīng)用[D].吉林：吉林大學，2008.

[3] 高苗，楊金廣，劉旭，等.一株裂解性青枯雷爾氏菌噬菌體的分離及生物學特性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學院，2015（7）：1330-1338.

[4] 王碩，雞源多重耐藥志賀菌病的流行病學調(diào)查[D].吉林：吉林農(nóng)業(yè)大學，2018.