熱陽古·阿布拉，席茹潔，王琪

喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室（喀什 844000）

石榴（Pnnica granatumL.）為石榴屬（PunicaL.）植物，落葉灌木或小喬木，是一種集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益、觀賞價(jià)值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹[1]。新疆是我國(guó)石榴產(chǎn)地之一，新疆石榴主要產(chǎn)于南疆的喀什、和田等地區(qū)，主要品種有甜石榴、酸石榴、甜酸石榴等?？κ驳貐^(qū)夏季氣候條件對(duì)石榴的生長(zhǎng)發(fā)育有利，使得喀什石榴果實(shí)大而皮薄、營(yíng)養(yǎng)豐富、耐貯藏[2]，具備開發(fā)前景。

石榴汁液中富含有機(jī)酸、氨基酸、糖類、脂類、生物堿、酚類和黃酮類化合物[3-5]。有機(jī)酸類可以軟化血管、延緩血管硬化，具有防老抗衰、抗菌、抗氧化等作用[6]。石榴有機(jī)酸組分以檸檬酸、蘋果酸、草酸為主，且含有少量抗壞血酸及酒石酸[7]。有機(jī)酸類成分測(cè)定分析方法主要包括指示劑法、電位滴定法、高效液相色譜法等，電位滴定法作為一種簡(jiǎn)單、高效、快速的檢測(cè)方法，已被廣泛應(yīng)用[8]。吳曉紅等[9]用電位滴定法測(cè)定柑橘類水果總有機(jī)酸的含量時(shí)報(bào)道，該方法不僅可操作性強(qiáng)，而且既可以排除滴定過程中終點(diǎn)顏色變化判斷誤差和不均勻搖動(dòng)誤差，也可以排除由于酸度計(jì)校正不準(zhǔn)確帶來的誤差，適合于其他種類水果總有機(jī)酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定。國(guó)內(nèi)對(duì)石榴有效成分研究主要集中在黃酮類、多酚類及揮發(fā)油類[10]，石榴總有機(jī)酸類成分生理活性研究有關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道極少。采用電位滴定法測(cè)定3個(gè)品種喀什石榴果實(shí)汁液中總有機(jī)酸含量，并以總還原力和DPPH自由基、羥自由基的清除能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)各品種喀什石榴總有機(jī)酸的抗氧化活性，對(duì)尋找新型天然抗氧化劑、發(fā)現(xiàn)石榴新的藥理活性、資源開發(fā)及良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

喀什酸石榴、喀什甜酸石榴、喀什甜石榴（均產(chǎn)于新疆喀什市伯什克然木鄉(xiāng)）。

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、鐵氰化鉀、無水乙醇、三氯化鐵、乙酸乙酯、三氯乙酸、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、濃鹽酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、抗壞血酸（VC）等（均為國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004N電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；Spectrumlab22可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；HC.TP11B.5架盤藥物天平（北京醫(yī)用天平廠）；78-1磁力加熱攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；TDL-5-A型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SSW-600-2S電熱恒溫水槽（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；RE-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 總有機(jī)酸的提取

稱取不同品種喀什石榴，去皮、除隔膜，去籽粒榨汁過濾得到石榴汁。在石榴汁中加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 11.5左右，滴加0.1 mol/L鹽酸溶液，加入飽和碳酸鈉溶液至溶液微堿性，用乙酸乙酯反復(fù)萃取至溶液沒有顏色，收集堿水液，用鹽酸酸化到溶液pH 2左右，再以乙酸乙酯反復(fù)萃取至無色[11]。合并所用的乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，蒸干后得到總有機(jī)酸，用乙醇進(jìn)行溶解，并定容于250 mL容量瓶中，備用。

1.3.2 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取3 mL 6.7 g/L的蘋果酸-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液與27 mL蒸餾水于燒杯中，將燒杯放在滴定臺(tái)上，插入電極，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.047 mol/L NaOH溶液滴定。滴定過程中記錄氫氧化鈉的體積和相應(yīng)的電位變化值。以電位變化量（ΔE）和體積變化量（ΔV）的比值為縱坐標(biāo)，電位變化前后所用去的氫氧化鈉溶液的體積平均值V為橫坐標(biāo)作圖，曲線的極大值對(duì)應(yīng)的NaOH溶液體積就是滴定終點(diǎn)，消耗的NaOH的體積為8.49 mL（圖1），由（V堿=C酸V酸/C堿）計(jì)算消耗堿量為8.50 mL與理論值相吻合[12]，曲線顯示滴定終點(diǎn)非常明顯，得到NaOH溶液消耗體積。

圖1 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定ΔE/ΔV—V曲線

1.3.3 總有機(jī)酸含量測(cè)定

精確量取3 mL各品種喀什石榴提取溶液于燒杯中，加入27 mL蒸餾水，同樣將燒杯放置在滴定臺(tái)上滴定，相同的方法制作滴定曲線，圖中最大值所對(duì)應(yīng)的體積V就是滴定終點(diǎn)時(shí)的所消耗氫氧化鈉體積，記錄其數(shù)值，重復(fù)操作5次。

1.3.4 總有機(jī)酸還原力測(cè)定

將石榴總有機(jī)酸溶液配制成0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的溶液，分別取2 mL溶液，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），再加入2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合后在50 ℃水浴中反應(yīng)20 min。取出后在混合物后加入2 mL 10%三氯乙酸，分別從中取出2 mL混合物，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵于試管中，反應(yīng)10 min后，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。按同樣方法以VC作陽性對(duì)照，臨用前用蒸餾水配制[13]。每組數(shù)據(jù)測(cè)定3次，求平均值，將其制表、繪圖。

1.3.5 總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基清除活性測(cè)定

精密配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，并將石榴總有機(jī)酸溶液配制成0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的溶液，待用?？瞻捉M：取2 mL乙醇和2 mL DPPH溶液，振搖后靜置30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度d0。對(duì)照組：取2 mL乙醇和2 mL待測(cè)樣品溶液，測(cè)定其吸光度d1。樣品組：取2 mL待測(cè)樣品溶液，加入2 mL DPPH溶液，按上述方法測(cè)定吸光度d2。按同樣方法以VC作陽性對(duì)照，臨用前用蒸餾水配制。計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除率[14]。試驗(yàn)的每組數(shù)據(jù)測(cè)定3次，求平均值，將其制表、繪圖。

1.3.6 總有機(jī)酸對(duì)OH自由基清除能力測(cè)定

取2 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲于試管中，依次加入2 mL PBS（pH 7.40）、1 mL蒸餾水，充分混勻后，加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵，混勻，加1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.12%的H2O2，于37 ℃水浴90 min，在536 nm處測(cè)定其吸光度Ap；用蒸餾水代替H2O2，測(cè)定其吸光度Ab；用石榴總有機(jī)酸溶液代替1 mL蒸餾水，測(cè)定其吸光度As。按同樣方法以VC作陽性對(duì)照，臨用前用蒸餾水配制。計(jì)算樣品對(duì)羥自由基的清除率[15]。每組數(shù)據(jù)測(cè)定3次，求平均值，將其制表、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 總有機(jī)酸含量測(cè)定與計(jì)算

根據(jù)各品種喀什石榴總有機(jī)酸提取液滴定得到的ΔE/ΔV—V關(guān)系曲線（圖2～4），確定所消耗氫氧化鈉體積VNaOH，其代入式（3）計(jì)算各品種喀什石榴果實(shí)中總有機(jī)酸含量[16]。求得酸石榴、甜酸石榴、甜石榴中總有機(jī)酸含量平均為2.19%，1.66%和1.10%。

式中：CNaOH為氫氧化鈉濃度，mol/L；V為滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉體積，mL；V0為空白消耗氫氧化鈉體積，mL；Mr為蘋果酸相對(duì)分子質(zhì)量，Mr=134；m為所用石榴果實(shí)質(zhì)量，g；30為稀釋倍數(shù)。

圖2 酸石榴總有機(jī)酸滴定ΔE/ΔV—V曲線

圖3 甜酸石榴總有機(jī)酸滴定ΔE/ΔV—V曲線

圖4 甜石榴總有機(jī)酸滴定ΔE/ΔV—V曲線

2.2 不同品種喀什石榴總有機(jī)酸還原力測(cè)定

圖5 VC與不同品種喀什石榴總有機(jī)酸總還原力

吸光度越大表示總還原力越強(qiáng)[17]。由圖5可知，各品種喀什石榴總有機(jī)酸具有一定總還原力，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)石榴總有機(jī)酸吸光度分別達(dá)到0.945，0.709和0.752，其中甜石榴總有機(jī)酸的還原力最強(qiáng)。結(jié)果表明，各品種喀什石榴總有機(jī)酸的還原力隨著樣品濃度的增加而增強(qiáng)，且呈顯著量效關(guān)系。

2.3 不同品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基清除活性測(cè)定

由圖6可知，各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基具有明顯的清除作用，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基的清除率分別達(dá)到91.93%，84.20%和78.45%。運(yùn)用SPSS Statistics 17.0軟件計(jì)算得出各品種石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為酸石榴0.22 mg/mL、甜酸石榴0.18 mg/mL、甜石榴0.31 mg/mL，表明各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的抑制作用。在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基的清除作用隨著樣品濃度增加而增強(qiáng)，且呈顯著量效關(guān)系。

圖6 VC與不同品種喀什石榴對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.4 3個(gè)品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)OH自由基清除能力測(cè)定

由圖7可知，各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)OH自由基有明顯清除作用，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)石榴總有機(jī)酸對(duì)OH自由基的清除率分別達(dá)到69.96%，64.86%和53.04%。運(yùn)用SPSS Statistics 17.0軟件計(jì)算得出各品種石榴總有機(jī)酸對(duì)·OH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為酸石榴0.52 mg/mL、甜酸石榴0.34 mg/mL、甜石榴1.00 mg/mL，表明各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)OH自由基具有較強(qiáng)的抑制作用，其中甜酸石榴總有機(jī)酸對(duì)OH自由基的抑制能力比陽性對(duì)照VC還強(qiáng)。在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)OH自由基的清除作用隨著樣品濃度增加而增強(qiáng)，且呈顯著量效關(guān)系。

圖7 VC與不同品種喀什石榴對(duì)OH自由基的清除作用

3 討論

一種水果往往有多個(gè)品種，不同品種的果實(shí)品質(zhì)和有效成分不盡相同[11]。對(duì)石榴的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的研究較多，但不同品種石榴總有機(jī)酸含量測(cè)定及其生物活性方面的研究尚不多見。現(xiàn)代藥理試驗(yàn)研究證明，有機(jī)酸類成分具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化、抗血栓、抗艾滋病毒等廣泛的生物活性，具有研究和開發(fā)潛力[16-17]。水果中總有機(jī)酸含量的測(cè)定最常用的方法是酸堿滴定法，但是由于水果的提取液常常具有較深的顏色，指示劑的選擇受到限制，同時(shí)滴定終點(diǎn)指示不明顯[9]。試驗(yàn)采用電位滴定法，利用電位的變化確定滴定終點(diǎn)，簡(jiǎn)便靈敏，重現(xiàn)性及穩(wěn)定性均良好。結(jié)果表明，喀什酸石榴總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.19%、甜酸石榴總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.66%、甜石榴總有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.10%。張琳等[18]報(bào)道石榴主要有機(jī)酸組分為檸檬酸、蘋果酸、草酸，除此之外還含有乙酸、富馬酸、抗壞血酸、酒石酸等，其中乙酸在酸石榴中含量較高，酒石酸在甜石榴中含量較高。此次試驗(yàn)結(jié)果與上述研究有共同點(diǎn)，不同品種石榴果實(shí)中有機(jī)酸含量及組分有所不同，這可能是影響石榴風(fēng)味特征的主要因素之一。

氧化作用是炎癥反應(yīng)和血管形成過程中的一個(gè)非特異性的代謝過程，它在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[19]，而抗氧化就是任何以低濃度存在就能有效抑制自由基的氧化反應(yīng)的活性。據(jù)研究報(bào)道，石榴有明顯的抗氧化活性，抗菌抗病毒作用，并對(duì)血管疾病、糖尿病及癌癥的治療有效[20-21]，初步推測(cè)其作用可能與石榴中有機(jī)酸有關(guān)。試驗(yàn)通過總還原力的測(cè)定，并就DPPH、OH自由基的清除試驗(yàn)初步探討3個(gè)品種石榴總有機(jī)酸的抗氧化效果。結(jié)果測(cè)得不同品種喀什石榴總有機(jī)酸具有一定的總還原力，接近同濃度VC總還原力，且具有一定的濃度依賴性，其中甜石榴還原力最強(qiáng)，酸石榴為次，甜酸石榴最弱；在測(cè)試濃度0.2～1.00 mg/mL下，各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基有明顯的清除能力，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基的清除率分別達(dá)到91.93%，84.20%和78.45%。根據(jù)IC50值可知，甜酸石榴總有機(jī)酸對(duì)DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，酸石榴為次，甜石榴最弱。在質(zhì)量濃度0.2～1.00 mg/mL條件下，各品種喀什石榴總有機(jī)酸對(duì)OH自由基清除能力比VC還強(qiáng)。根據(jù)IC50值可知，甜酸石榴總有機(jī)酸對(duì)OH自由基清除能力最強(qiáng)，酸石榴為次，甜石榴最弱?？梢?，不同品種喀什石榴果實(shí)中總有機(jī)酸含量較高并具有較好抗氧化活性。

4 結(jié)論

喀什地區(qū)石榴資源豐富，而喀什石榴具有顯著的品牌優(yōu)勢(shì)和區(qū)位優(yōu)勢(shì)，開發(fā)潛力巨大，其食用價(jià)值、藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值備受關(guān)注。結(jié)果表明，喀什石榴果實(shí)中總有機(jī)酸含量較高并具有良好的抗氧化能力，為進(jìn)一步將喀什石榴總有機(jī)酸開發(fā)成天然抗氧化劑提供理論依據(jù)，并對(duì)喀什石榴在保健、醫(yī)藥方向的發(fā)展具有重要意義。