杜雨馨 劉依宗 閻飛躍 沈吟

1武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心 430060；2武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院 430060

視網(wǎng)膜退行性疾病包括視網(wǎng)膜色素變性、Leber先天性黑矇、年齡相關(guān)性黃斑變性等，均伴隨光感受器功能障礙和喪失，最終導(dǎo)致視力障礙和盲[1]。在疾病早期階段，視網(wǎng)膜內(nèi)尚有相當(dāng)數(shù)量的光感受器細(xì)胞存在，將其作為靶細(xì)胞進(jìn)行基因治療和基因編輯是非常有前景的治療方法。在光感受器細(xì)胞已大量喪失的疾病晚期階段，以恢復(fù)視網(wǎng)膜光敏性為目的的替代策略正處于探索階段，包括光遺傳工具、光敏開(kāi)關(guān)、視網(wǎng)膜假體和光感受器移植[2-4]，其中光感受器移植是一種很有前途的再生策略，影響其治療效果的一個(gè)重要因素為供體細(xì)胞的來(lái)源[5]。視網(wǎng)膜變性疾病的細(xì)胞治療中首選活性強(qiáng)、有絲分裂后的原代光感受器細(xì)胞，即光感受器前體細(xì)胞[6-9]。移植后光感受器前體細(xì)胞較成熟的光感受器細(xì)胞有更高的存活率，在視網(wǎng)膜下間隙可有效成熟，對(duì)晚期視網(wǎng)膜變性的功能修復(fù)有一定效果[10-12]。以往研究利用2D培養(yǎng)系統(tǒng)從胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)中獲得可移植的光感受器，但其效率低，僅有不足20%的細(xì)胞表達(dá)光感受器特異性標(biāo)志物[13]。3D培養(yǎng)是指在體外培養(yǎng)時(shí)為細(xì)胞提供一個(gè)接近體內(nèi)微環(huán)境的培養(yǎng)技術(shù)。近年來(lái)其在體外生物科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了體外類(lèi)器官的培養(yǎng)。2011年，Eiraku等[14]在體外培養(yǎng)光感受器方面取得了重大突破，首次通過(guò)3D培養(yǎng)技術(shù)將小鼠ESCs誘導(dǎo)分化為視杯。目前已有許多從人ESCs和iPSCs產(chǎn)生神經(jīng)視網(wǎng)膜類(lèi)器官的3D培養(yǎng)方案[15-17]。隨著培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，理論上可以實(shí)現(xiàn)從ESCs及iPSCs產(chǎn)生無(wú)限數(shù)量的可移植光感受器，光感受器移植用于臨床的基本前提已經(jīng)確立[18]。然而篩選出合適的光感受器前體細(xì)胞尚需抗原-抗體反應(yīng)步驟，影響了細(xì)胞活性，且?guī)Э贵w的細(xì)胞可能對(duì)移植效果有影響。成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR關(guān)聯(lián)(CRISPR associated，Cas)基因是一種原核生物的免疫系統(tǒng)，其可準(zhǔn)確識(shí)別外源DNA，利用Cas蛋白將DNA雙鏈切斷，因此成為第3代基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)[19]。利用CRISPR/Cas技術(shù)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行基因編輯可實(shí)現(xiàn)所需細(xì)胞系的構(gòu)建[20]。Crx是一種同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，為光感受器前體細(xì)胞的分子標(biāo)志物，可用于篩選適合移植的光感受器前體細(xì)胞。TdTomato是一種信號(hào)非常強(qiáng)的紅色熒光蛋白，對(duì)細(xì)胞和小鼠無(wú)明顯毒性，是理想的細(xì)胞成像工具。本研究中擬通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)構(gòu)建Crx-iCreERT2熒光報(bào)告人ESCs系，其3D培養(yǎng)得到的視網(wǎng)膜類(lèi)器官中表達(dá)的tdTomato熒光可指示光感受器前體細(xì)胞，為光感受器移植療法提供供體來(lái)源及細(xì)胞篩選、為人類(lèi)視網(wǎng)膜發(fā)育和疾病發(fā)生的相關(guān)研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源 H9人ESCs系(美國(guó)WiCell公司)。

1.1.2主要試劑及儀器 mTeSR1培養(yǎng)基(85850，美國(guó)Stem Cell公司)；0.5 mol/L EDTA(174621)、PBS(干粉)(G0002)，(武漢賽維爾生物科技有限公司)；基質(zhì)膠(356237，美國(guó)BD Biosciences公司)；培養(yǎng)皿(CLS430165，美國(guó)Corning公司)；細(xì)菌培養(yǎng)皿(BS-90-D，中國(guó)Biosharp公司)；3D細(xì)胞培養(yǎng)96孔板(MS-9096VZ，日本Sumitomo Bakelite公司)；杜氏磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS)(c14190500bt)、DMEM/F12+GlutaMAX(10565-018)、N2添加劑(17502-048)、MEM非必需氨基酸溶液(MEM non-essential amino acids，MEM NEAA)(11140-050)、穩(wěn)定型胰蛋白酶替代酶(12563-011)、丙酮酸鈉(11360-070)、G-MEM培養(yǎng)基(1710-035)、青鏈霉素雙抗(15140-122)、血清替代物(10828-028)(美國(guó)Gibco公司)；SMO拮抗劑(HY-12848/CS-4176，美國(guó)MedChemExpress公司)；Y-27632 HCl(S1049，美國(guó)Selleck公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(04-001-1A-AUS，以色列Biological Industries公司)；2-巰基乙醇(M-3148)、脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)(D5025)、視黃酸(R2625)(美國(guó)Sigma公司)；兔抗人SOX2一抗(AF2018)(美國(guó)R&D Systems公司)；兔抗人NANOG一抗(4903S)、小鼠抗人SSEA4一抗(4755S)(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；兔抗人OCT4(abs106544)(上海愛(ài)必信生物科技有限公司)；兔抗小鼠BRN3A一抗(ab245230)(英國(guó)Abcam公司)；兔抗大鼠CALBINDIN一抗(cb38)(瑞士SWANT公司)；Wnt信號(hào)抑制劑Ⅰ(681669)(Wnt Antagonist Ⅰ，IWR-1-endo)、山羊抗人CHAT一抗(AB144P)、兔抗人RECOVERIN一抗(ab5585)(美國(guó)Millipore公司)；兔抗人PKCα一抗(sc-208)(美國(guó)Santa Cruz公司)；驢抗兔IgG Alexa Flour-488(711-545-152)、驢抗山羊IgG Alexa Flour-488(705-545-147)、驢抗綿羊IgG Alexa Flour-488(713-545-147)、驢抗小鼠IgG Alexa Flour-594(715-585-151)(美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司)；DAPI(D1306，美國(guó)Life Technologies公司)；抗熒光淬滅封片劑(G1401，武漢谷歌生物科技有限公司)；多聚甲醛(80096618，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；牛血清白蛋白(4240GR100，德國(guó)Biofroxx公司)；TRI試劑(93289，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。離心機(jī)(5424R，德國(guó)Eppendorf公司)；倒置熒光顯微鏡(IX73，日本Olympus公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM880，德國(guó)Zeiss公司)；培養(yǎng)箱(CLM-170B-8-NF)、生物安全柜(AC2-4S1)(新加坡Esco公司)；水浴鍋(DK-S22，上海精宏公司)；冰凍切片機(jī)(CM1950，德國(guó)Leica公司)；流式細(xì)胞分析儀(LSRFortessa X-20 Cell Analyzer，美國(guó)BD Biosciences公司)。

1.2 方法

1.2.1CRISPR/Cas9介導(dǎo)Crx-iCreERT2 H9紅色熒光報(bào)告細(xì)胞系構(gòu)建 對(duì)H9細(xì)胞系靶位點(diǎn)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)其是否與Genebank和Ensembl所給序列一致，擴(kuò)增引物信息見(jiàn)表1。在hES-ZLM-001基因Exon4和3’非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)之間終止密碼子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2，利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備hES-ZLM-001敲進(jìn)H9細(xì)胞系(圖1)。基于sgRNA的設(shè)計(jì)原則，在靶位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)多條sgRNA。基于CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行sgRNA活性檢測(cè)。綜合考慮活性、特異性等因素選擇符合要求的sgRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)酶切鑒定和測(cè)序，確認(rèn)打靶載體構(gòu)建完成。將打靶載體電轉(zhuǎn)H9細(xì)胞系后，進(jìn)行藥物篩選、陽(yáng)性克隆富集。在野生型基因序列中設(shè)計(jì)引物hES-ZLM-001-L-GT-F、hES-ZLM-001-L-GT-F3和hES-ZLM-001-R-GT-R，在外源序列中設(shè)計(jì)引物hES-ZLM-001-L-GT-R、hES-ZLM-001-R-GT-F和Puro-GT-F(表1)。使用hES-ZLM-001-L-GT-F3/hES-ZLM-001-L-GT-R、hES-ZLM-001-R-GT-F/hES-ZLM-001-R-GT-R和hES-ZLM-001-L-GT-F/Puro-GT-F這3對(duì)引物擴(kuò)增突變型等位基因，使用hES-ZLM-001-L-GT-F3/hES-ZLM-001-R-GT-R引物同時(shí)擴(kuò)增野生型和突變等位基因。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果和測(cè)序峰圖判斷具體基因型：純合/雜合/野生型，最終得到去抗性敲進(jìn)陽(yáng)性細(xì)胞克隆。

圖1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)Crx-iCreERT2 H9紅色熒光報(bào)告細(xì)胞系構(gòu)建流程圖 在hES-ZLM-001基因的Exon4和3’非翻譯區(qū)之間終止密碼子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2

表1 hES-ZLM-001基因的PCR引物信息

1.2.2流式細(xì)胞分析法驗(yàn)證細(xì)胞系干性 分別向H9細(xì)胞系及1-A07細(xì)胞系的培養(yǎng)皿內(nèi)加入EDTA消化液，孵育6～8 min，低速(1 200 r/min)離心5 min去上清，用DPBS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，保證每個(gè)離心管內(nèi)細(xì)胞數(shù)為1×107～5×107，低速離心5 min去上清，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛4 ℃固定1 h，低速離心5 min去上清，PBS清洗后低速離心5 min去上清；用體積分?jǐn)?shù)4%牛血清白蛋白和2% TRI在4 ℃封閉過(guò)夜，低速離心5 min去上清；分別向含H9細(xì)胞懸液(陽(yáng)性對(duì)照)及1-A07細(xì)胞懸液的離心管中加入OCT4(1∶ 500)一抗，另一管H9細(xì)胞懸液(陰性對(duì)照)不加一抗，4 ℃孵育24 h，低速離心5 min去上清，PBS清洗后低速離心5 min去上清；向各個(gè)離心管內(nèi)加相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗(1∶ 500)，4 ℃避光孵育過(guò)夜，低速離心5 min去上清，PBS清洗后低速離心5 min去上清。用PBS重懸細(xì)胞，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后將其轉(zhuǎn)移至流式管中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察OCT4陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.2.3免疫熒光染色法驗(yàn)證細(xì)胞系干性 將24 mm×24 mm蓋玻片置于濃硫酸中過(guò)夜，次日用自來(lái)水沖洗后放入無(wú)水乙醇中浸泡6 h，沖洗后高壓消毒并烘干；將蓋玻片放入質(zhì)量濃度0.1 mg/ml多聚賴(lài)氨酸溶液中浸泡5 min，晾干備用。向ESCs的培養(yǎng)皿內(nèi)加入EDTA消化液，孵育6～8 min，1 200 r/min離心5 min去上清，用mTeSR1培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，密度約為3.5×105個(gè)/ml；將處理好的玻片放入6孔板內(nèi)，將細(xì)胞懸液逐滴滴到玻片上，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)，吸去培養(yǎng)基，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗；用0.5% TRI室溫通透20 min，PBS漂洗；用10%牛血清白蛋白和0.5% TRI在4 ℃條件下封閉30 min，吸去封閉液；加入SOX2(1∶ 1 000)、NANOG(1∶ 200)、SSEA4(1∶ 500)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗；加相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗(1∶ 500)，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗；加DAPI溶液(1∶ 100)，避光染核5 min，PBS漂洗后使用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中各分子標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.2.4細(xì)胞系核型分析 取構(gòu)建成功的細(xì)胞系，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、密度，待細(xì)胞融合面積占整個(gè)培養(yǎng)皿70%～80%時(shí)，于含0.2 μg/ml秋水仙素的mTeSR1培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)2 h。向培養(yǎng)皿內(nèi)加入EDTA消化液孵育6～8 min，1 200 r/min離心5 min去上清，用mTeSR1培養(yǎng)基重懸并輕輕吹散均勻。經(jīng)低滲處理、預(yù)固定、固定后，吸取細(xì)胞懸液，滴至預(yù)冷的載玻片，室溫下干燥。滴加Giemsa工作液，孵育20～30 min，自來(lái)水沖洗終止染色并烘干，使用封片劑封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核，使用Chromosome Analysis Suite(ChAS)Software進(jìn)行細(xì)胞核型分析。

1.2.5細(xì)胞系3D培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜類(lèi)器官 將構(gòu)建的細(xì)胞系培養(yǎng)于含mTeSR1培養(yǎng)基的基質(zhì)膠包被培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)傳代或誘導(dǎo)分化。參照文獻(xiàn)[21]的方法誘導(dǎo)分化人ESCs，將人ESCs酶解成單細(xì)胞，用含Y-27632的Medium Ⅰ培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于3D細(xì)胞培養(yǎng)96孔板中，細(xì)胞接種密度為9×103個(gè)/孔，每孔100 μl，當(dāng)天記錄為分化第0天；分化第2天，向每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%基質(zhì)膠；分化第6天，用不含Y-27632的Medium Ⅰ培養(yǎng)基更換孔內(nèi)一半原培養(yǎng)基；分化第12天，將每孔內(nèi)的擬胚體轉(zhuǎn)移到細(xì)菌培養(yǎng)皿中，使用含1%基質(zhì)膠的Medium Ⅱ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；分化第18天，將擬胚體切割成4～5小塊后，轉(zhuǎn)移到新的細(xì)菌培養(yǎng)皿中，使用含視黃酸的Medium Ⅲ培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，之后每7 d換液1次。分化第100天時(shí)，開(kāi)始使用不含視黃酸的Medium Ⅲ培養(yǎng)基。培養(yǎng)至分化第30天開(kāi)始，每隔15 d取樣進(jìn)行1次檢測(cè)，直至分化第180天，Medium Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ培養(yǎng)基分別對(duì)應(yīng)圖中D0～D12、D12～D18、D18以后所用培養(yǎng)基(圖2)。

圖2 干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化流程 d：干細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)；D：干細(xì)胞分化天數(shù)

1.2.6免疫熒光染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜類(lèi)器官中各類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞蛋白的表達(dá) 培養(yǎng)至分化第30天開(kāi)始，每隔15 d進(jìn)行1次收樣，直至分化第180天。取培養(yǎng)的視網(wǎng)膜類(lèi)器官，用4%多聚甲醛在4 ℃固定1 h，進(jìn)行OCT包埋，行14 μm厚冰凍切片；取切片用4%牛血清白蛋白和0.5% TRI試劑封閉1 h，滴加神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物BRN3A(1∶ 200)、水平細(xì)胞標(biāo)志物CALBINDIN(1∶ 500)、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞標(biāo)志物CHAT(1∶ 200)、光感受器細(xì)胞標(biāo)志物RECOVERIN(1∶ 500)、雙極細(xì)胞標(biāo)志物PKCα(1∶ 500)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗；滴加相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗；滴加DAPI溶液，室溫下避光染核5 min，PBS漂洗后抗熒光淬滅封片劑封片。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察樣本各標(biāo)志物的表達(dá)情況，以此來(lái)判斷視網(wǎng)膜類(lèi)器官中是否存在相應(yīng)種類(lèi)的細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 Crx-iCreERT2 H9紅色熒光報(bào)告細(xì)胞系打靶載體的構(gòu)建

經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，hES-ZLM-001基因擴(kuò)增產(chǎn)物序列與Genebank DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)和Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中所提供序列一致。在靶位點(diǎn)區(qū)域共設(shè)計(jì)16條sgRNA，其中sgRNA1～8為5’端引物，sgRNA9～16為3’端引物。基于CRISPR/Cas9技術(shù)的活性檢測(cè)結(jié)果顯示，5’端引物sgRNA1、sgRNA2、sgRNA8活性較高，3’端引物sgRNA11、sgRNA12、sgRNA13活性較高(圖3)。最終選擇sgRNA8和sgRNA12作為sgRNA。打靶載體分別經(jīng)限制內(nèi)切酶EcoRI+ScaI、BamHI+HindIII和BgIII處理后，相應(yīng)獲得3、4和4個(gè)酶切產(chǎn)物，產(chǎn)物的長(zhǎng)度和測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)產(chǎn)物一致，確認(rèn)打靶載體構(gòu)建完成(圖4)。

圖3 sgRNA引物活性檢測(cè) A：5’端sgRNA引物活性檢測(cè) sgRNA1、sgRNA2和sgRNA8活性較高 B：3’端sgRNA引物活性檢測(cè) sgRNA11、sgRNA12和sgRNA13活性較高 圖4 打靶載體酶切驗(yàn)證 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示不同限制內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物均與目標(biāo)產(chǎn)物相一致 CK：陰性對(duì)照；1：限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI+ScaI(目標(biāo)產(chǎn)物為6 494 bp+5 308 bp+934 bp)；2：限制性?xún)?nèi)切酶BamHI+HindIII(目標(biāo)產(chǎn)物為5 227 bp+4 445 bp+1 867 bp+1 197 bp)；3：限制性?xún)?nèi)切酶BgIII(目標(biāo)產(chǎn)物為5 579 bp+4 124 bp+1 871 bp+1 162 bp)；M：DNA標(biāo)志物

2.2 Crx-iCreERT2 H9紅色熒光報(bào)告細(xì)胞系基因型篩選及干性鑒定

對(duì)待篩選的細(xì)胞系克隆進(jìn)行PCR測(cè)序，根據(jù)測(cè)序來(lái)判斷細(xì)胞系具體基因型，綜合考慮PCR結(jié)果及細(xì)胞株?duì)顟B(tài)后，最終得到4個(gè)去抗性敲進(jìn)陽(yáng)性克隆(表2)，分別為1-C06、1-B06、1-C07和1-A07(圖5)。通過(guò)流式分析確認(rèn)1-A07細(xì)胞系干性良好(圖6)。免疫熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示1-A07細(xì)胞系中ESC分子標(biāo)志物SOX2、NANOG和SSEA4均呈陽(yáng)性表達(dá)(圖7)。核型分析表明，1-A07細(xì)胞系核型無(wú)異常，為46，XX(圖8)。結(jié)果顯示，外源性tdTomato-P2A-iCreERT2段重組位置正確，且該干細(xì)胞系正常表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物，核型分析結(jié)果無(wú)異常，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 4個(gè)去抗性敲進(jìn)陽(yáng)性克隆信息

圖5 各細(xì)胞克隆不同引物擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖 對(duì)12個(gè)待篩選的克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，綜合考慮PCR結(jié)果及細(xì)胞株?duì)顟B(tài)后，最終得到4個(gè)去抗性敲進(jìn)陽(yáng)性克隆，分別標(biāo)記為1-A07、1-B06、1-C06和1-C07 A：hES-ZLM-001-L-GT-F3/hES-ZLM-001-L-GT-R引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 B：hES-ZLM-001-R-GT-F/hES-ZLM-001-R-GT-R引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 C：hES-ZLM-001-L-GT-F3/hES-ZLM-001-R-GT-R引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 D：hES-ZLM-001-L-GT-F/Puro-GT-F引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 +：陽(yáng)性對(duì)照；WT：H9野生型細(xì)胞系對(duì)照；H2O：空白對(duì)照 圖6 各細(xì)胞系流式細(xì)胞分析 A：陰性對(duì)照(H9細(xì)胞系無(wú)抗體)的流式分析結(jié)果 OCT4陽(yáng)性細(xì)胞占0.241% B：1-A07細(xì)胞系的流式分析結(jié)果 OCT4陽(yáng)性細(xì)胞占98.7%，表明1-A07細(xì)胞系干性良好 C：陽(yáng)性對(duì)照(H9細(xì)胞系抗體染色)的流式分析結(jié)果 OCT4陽(yáng)性細(xì)胞占99.6%，表明H9細(xì)胞系干性良好

圖7 細(xì)胞爬片免疫熒光染色(標(biāo)尺=100 μm) A、C：細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI,Alexa Fluor-405) B：SOX2染色陽(yáng)性，呈綠色熒光(Alexa Fluor-488) D：NANOG染色陽(yáng)性，呈綠色熒光(Alexa Fluor-488) E：SSEA4染色陽(yáng)性，呈紅色熒光(Alexa Fluor-594)

圖8 1-A07細(xì)胞系核型分析 1-A07細(xì)胞系的核型分析結(jié)果為46 XX，染色體數(shù)量和形態(tài)無(wú)異常 圖9 光學(xué)顯微鏡下觀察Crx-iCreERT2 H9紅色熒光報(bào)告細(xì)胞系的體外自發(fā)分化(×100，標(biāo)尺=200 μm) A：ESCs細(xì)胞培養(yǎng)后4 d，細(xì)胞互相連接連成片，細(xì)胞之間呈致密連接，不同細(xì)胞團(tuán)片之間尚留有部分空間 B：分化第2天，細(xì)胞聚集成一球狀，球狀細(xì)胞團(tuán)位于孔中央底部，周?chē)胁糠稚⒃诩?xì)胞 C：分化第6天，細(xì)胞聚集成一致密球狀，較之前體積增大，周?chē)⒃诩?xì)胞基本消失，邊緣處較其他部分略微透明 D：分化第12天，球狀擬胚體體積較之前進(jìn)一步增大，邊緣處出現(xiàn)突起的半透明小囊泡結(jié)構(gòu) E：分化第18天，切割后的擬胚體 F：分化第21天，被切割后的小囊泡逐漸形成視杯，且視杯體積逐漸增大 G：分化第30天，視網(wǎng)膜類(lèi)器官基本形成，較透亮，呈淡黃色，并逐漸增大 H、I：分化第45天和第60天，視網(wǎng)膜類(lèi)器官逐漸增大 J：分化第75天，視網(wǎng)膜類(lèi)器官中央厚，邊緣稍薄 K、L：分化第150天和第165天，視網(wǎng)膜類(lèi)器官形態(tài)、體積均無(wú)明顯變化

2.3 Crx-iCreERT2 H9紅色熒光報(bào)告細(xì)胞系體外自發(fā)分化為視網(wǎng)膜類(lèi)器官

分化第2天，細(xì)胞聚集成一球狀，周?chē)胁糠稚⒃诩?xì)胞；分化第6天，細(xì)胞聚集成一致密球狀，較之前體積增大，周?chē)⒃诩?xì)胞基本消失，細(xì)胞團(tuán)邊緣處較其他部分略透明；分化第12天，可觀察到球狀擬胚體體積較之前進(jìn)一步增大，邊緣處出現(xiàn)突起的半透明小囊泡結(jié)構(gòu)；擬胚體被切割后小囊泡逐漸形成視杯，且視杯體積逐漸增大；分化第30天，視網(wǎng)膜類(lèi)器官形成，較透亮，呈淡黃色，并逐漸增大；分化后第75天，視網(wǎng)膜類(lèi)器官中央厚，邊緣稍薄，并逐漸增大、增厚；分化第150天，視網(wǎng)膜類(lèi)器官形態(tài)、體積無(wú)明顯變化(圖9)。

2.4 不同發(fā)育階段視網(wǎng)膜類(lèi)器官tdTomato熒光表達(dá)

TdTomato熒光表達(dá)標(biāo)記的為表達(dá)Crx的光感受器前體細(xì)胞。分化第30天，在視網(wǎng)膜類(lèi)器官內(nèi)側(cè)開(kāi)始出現(xiàn)少量tdTomato熒光表達(dá)；分化第45天，熒光表達(dá)多集中在中深層；分化第60天和第75天，熒光表達(dá)主要集中在中深層，部分開(kāi)始出現(xiàn)在頂層；分化第90天，熒光表達(dá)主要集中在頂層；分化第150天，熒光表達(dá)達(dá)峰值，隨后熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化(圖10)。

圖10 不同發(fā)育階段視網(wǎng)膜類(lèi)器官tdTomato熒光表達(dá)情況(標(biāo)尺=50 μm) A：分化第30天，在類(lèi)器官深層開(kāi)始出現(xiàn)少量tdTomato熒光表達(dá) B：分化第45天，中深層有tdTomato熒光表達(dá) C：分化第60天，在類(lèi)器官頂層出現(xiàn)少量tdTomato熒光表達(dá) D～I(xiàn)：分化第75、90、105、120、135和150天，類(lèi)器官tdTomato熒光逐漸增強(qiáng) J：分化第165天，類(lèi)器官tdTomato熒光無(wú)明顯變化 K：分化第60天，類(lèi)器官冰凍切片tdTomato熒光表達(dá)主要分布于中深層，少量分布于頂層 L：分化第90天，類(lèi)器官tdTomato熒光表達(dá)主要分布于頂層 M～N：分化第120和150天，類(lèi)器官冰凍切片tdTomato熒光表達(dá)逐漸增強(qiáng) O：分化第180天類(lèi)器官冰凍切片tdTomato熒光表達(dá)與分化第150天時(shí)無(wú)明顯變化

2.5 視網(wǎng)膜類(lèi)器官中各標(biāo)志蛋白表達(dá)情況

分化第30天，在類(lèi)器官深層已出現(xiàn)較多BRN3A性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，為視網(wǎng)膜類(lèi)器官中最早出現(xiàn)的神經(jīng)細(xì)胞類(lèi)型，同時(shí)在視網(wǎng)膜類(lèi)器官中深層開(kāi)始零星出現(xiàn)CALBINDIN陽(yáng)性水平細(xì)胞，以及CHAT陽(yáng)性無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞；分化第45天，在視網(wǎng)膜類(lèi)器官最頂層開(kāi)始零星出現(xiàn)RECOVERIN陽(yáng)性光感受器細(xì)胞；分化第90天，在視網(wǎng)膜類(lèi)器官中深層出現(xiàn)少量PKCα陽(yáng)性雙極細(xì)胞(圖11)。

圖11 免疫熒光染色觀察視網(wǎng)膜類(lèi)器官中各細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)(FITC，標(biāo)尺=50 μm) A：分化第30天，在視網(wǎng)膜類(lèi)器官深層有大量BRN3A陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 B：分化第30天，在視網(wǎng)膜類(lèi)器官深層開(kāi)始零星出現(xiàn)CALBINDIN陽(yáng)性水平細(xì)胞 C：分化第30天，在視網(wǎng)膜類(lèi)器官中深層開(kāi)始零星出現(xiàn)CHAT陽(yáng)性無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞 D：分化第45天，在視網(wǎng)膜類(lèi)器官最頂層及中深層零星出現(xiàn)RECOVERIN陽(yáng)性光感受器細(xì)胞 E：分化第120天，RECOVERIN陽(yáng)性光感受器細(xì)胞數(shù)量較分化第45天增多，仍為少量零星分布 F：分化第90天在視網(wǎng)膜類(lèi)器官中深層零星出現(xiàn)PKCα陽(yáng)性雙極細(xì)胞

3 討論

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)順利構(gòu)建了Crx-iCreERT2 H9紅色熒光報(bào)告細(xì)胞系，且該細(xì)胞系核型分析結(jié)果無(wú)異常，具有干性特征，可體外自發(fā)分化為視網(wǎng)膜類(lèi)器官。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜類(lèi)器官中神經(jīng)細(xì)胞蛋白的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，該視網(wǎng)膜類(lèi)器官細(xì)胞類(lèi)型同人類(lèi)正常視網(wǎng)膜一致，即含有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、光感受器細(xì)胞和雙極細(xì)胞；并且各類(lèi)細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間順序與人胚胎視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程相符，即最先出現(xiàn)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，隨后水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、光感受器細(xì)胞相繼出現(xiàn)，雙極細(xì)胞最晚出現(xiàn)；視網(wǎng)膜類(lèi)器官同人類(lèi)正常視網(wǎng)膜中各類(lèi)細(xì)胞的空間排布也基本一致，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞位于最深層，水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、雙極細(xì)胞位于中深層，光感受器細(xì)胞位于頂層。通過(guò)本法獲得的視網(wǎng)膜類(lèi)器官遵循一定的發(fā)育時(shí)間和空間順序，接近于正常的人類(lèi)視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程[22-23]。

視網(wǎng)膜類(lèi)器官中的光感受器細(xì)胞大部分位于頂層，然而，與人類(lèi)正常視網(wǎng)膜中光感受器細(xì)胞空間分布不一致的是，視網(wǎng)膜類(lèi)器官的中深層有部分RECOVERIN陽(yáng)性光感受器細(xì)胞散在分布。與之對(duì)應(yīng)的，分化第60天時(shí)Crx陽(yáng)性光感受器前體細(xì)胞大部分位于中深層，之后在中深層逐漸減少，在頂層分布逐漸增多；至分化第90天時(shí)，Crx陽(yáng)性光感受器前體細(xì)胞大部分位于頂層，少部分位于中深層。視網(wǎng)膜類(lèi)器官分化早期出現(xiàn)在中深層的光感受器前體細(xì)胞性質(zhì)尚不清楚。目前沒(méi)有報(bào)道描述人胎兒視網(wǎng)膜中光感受器前體的異位現(xiàn)象[24]。光感受器前體的這種異位現(xiàn)象也許同樣存在于人胎兒視網(wǎng)膜中，由于變化細(xì)微而被忽略。出現(xiàn)在中深層的光感受器細(xì)胞是否具有與頂層的光感受器細(xì)胞一樣的成熟度和亞型目前尚不清楚，有待后續(xù)進(jìn)行研究。

大多數(shù)類(lèi)型的視網(wǎng)膜變性主要損害光感受器細(xì)胞，利用視網(wǎng)膜類(lèi)器官作為供體來(lái)源補(bǔ)足缺失的光感受器細(xì)胞具有一定的可行性。利用流式細(xì)胞分選技術(shù)從視網(wǎng)膜類(lèi)器官中篩選出Crx陽(yáng)性光感受器前體細(xì)胞，有針對(duì)性地進(jìn)行移植；由于分化后30～90 d時(shí)tdTomato熒光表達(dá)逐漸增多，因此選擇分化90 d以后的視網(wǎng)膜類(lèi)器官作為供體較合適。已有研究將供體神經(jīng)視網(wǎng)膜整體移植到視網(wǎng)膜變性的嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型中，供體視網(wǎng)膜內(nèi)的光感受器細(xì)胞通過(guò)宿主的視覺(jué)通路連接到宿主神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，且宿主的視覺(jué)活動(dòng)有一定地恢復(fù)[25]。

體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜類(lèi)器官有一個(gè)共性的問(wèn)題——不均一性，即由同一株細(xì)胞系誘導(dǎo)分化而來(lái)的類(lèi)器官，同一批分化的類(lèi)器官，乃至同一培養(yǎng)容器中的類(lèi)器官，其大小、成熟程度可能存在差異。本研究中的視網(wǎng)膜類(lèi)器官同樣存在發(fā)育大小和成熟度的不均一，因此我們通過(guò)比較其體積大小和tdTomato熒光表達(dá)情況，選用其中發(fā)育最成熟的視網(wǎng)膜類(lèi)器官用于后續(xù)研究。目前有研究者使用機(jī)器人和生物反應(yīng)器來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化工作并擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，這些方法已經(jīng)被用于腦類(lèi)器官的生成和視網(wǎng)膜類(lèi)器官的生成[26-27]。

本研究中建立的Crx-iCreERT2 H9紅色熒光報(bào)告細(xì)胞系及其3D培養(yǎng)視網(wǎng)膜類(lèi)器官技術(shù)是一種強(qiáng)大的工具，可以幫助實(shí)現(xiàn)人類(lèi)視網(wǎng)膜發(fā)育和疾病產(chǎn)生的相關(guān)研究，并促進(jìn)致盲疾病治療方法的開(kāi)發(fā)。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突