李果 陳穎 嚴宏 周希瑗

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科 眼科學(xué)重慶市重點實驗室 400010；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科 400016；3西安市人民醫(yī)院(西安市第四醫(yī)院) 陜西省眼科醫(yī)院 西北工業(yè)大學(xué)附屬西安市第四醫(yī)院 710004

晶狀體是由晶狀體囊和晶狀體纖維構(gòu)成的雙凸透鏡狀透明無血管組織。晶狀體囊為一層透明的薄膜，其控制著營養(yǎng)物質(zhì)進入及代謝產(chǎn)物排出。當(dāng)晶狀體內(nèi)的蛋白發(fā)生變性和凝聚，晶狀體就逐漸變混濁，形成白內(nèi)障。晶狀體混濁主要與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。已有的研究表明，在白內(nèi)障形成過程中晶狀體內(nèi)蛋白可能通過晶狀體囊膜滲漏到房水或者玻璃體液中[1]，但是對這些滲漏蛋白質(zhì)的具體成分還缺乏全面的了解。為了明確白內(nèi)障晶狀體滲漏蛋白質(zhì)的成分，預(yù)測其對眼內(nèi)其他組織可能的影響，本研究采用基于無標記液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法和多重微珠免疫分析系統(tǒng)分析過氧化氫誘導(dǎo)體外培養(yǎng)小鼠晶狀體上清液中的蛋白質(zhì)組成及其生物信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠42只，體質(zhì)量16～23 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[動物合格證編號：SYXK(渝)2018-0003]。將這些小鼠置于(24±1)℃、60%濕度下，進行12 h/12 h的光暗循環(huán)。本實驗均遵循ARVO聲明。本研究方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(批文號：2019-173)。

1.1.2主要試劑及儀器 M-199培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；體積分數(shù)3%過氧化氫溶液(美國Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司)；Bio-Plex Pro試劑盒Ⅲ(美國Bio-Rad公司)；Milliple Map TGF-β-3 Plex試劑盒、Ziptip C18柱(美國Millipore公司)；Nano-RPLC液相色譜儀、Q Exactive Plus質(zhì)譜儀、酶標儀、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1晶狀體培養(yǎng)及白內(nèi)障模型建立 取42只小鼠以頸椎脫臼法處死，立即摘除雙眼眼球，無菌條件下洗凈血跡，剔除肌肉筋膜。浸沒在M-199培養(yǎng)基中，解剖顯微鏡下于后極部剪開鞏膜，取出晶狀體，操作過程中避免損傷晶狀體囊膜。首先將分離的晶狀體放入M-199培養(yǎng)基中，在體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)8 h；借助網(wǎng)格圖鑒別后丟棄混濁的晶狀體并補充相應(yīng)數(shù)量晶狀體；任意選取28個晶狀體合并作為一個樣本，共3個樣本；將各樣本轉(zhuǎn)移到24孔板中，加入含有2 mmol/L過氧化氫的M-199培養(yǎng)基400 μl中培養(yǎng)晶狀體24 h；丟棄培養(yǎng)基，更換為正常M-199培養(yǎng)基400 μl繼續(xù)培養(yǎng)24 h；在解剖顯微鏡下仔細觀察每個晶狀體，評估囊膜的完整性；使用網(wǎng)格圖再次檢查晶狀體透明度。收集晶狀體混濁且囊膜完整無破損的培養(yǎng)孔上清液，1 000×g離心5 min，收集上清液于-70 ℃條件下保存?zhèn)溆?。以正常M-199培養(yǎng)基作為空白對照組。實驗步驟重復(fù)3次。

1.2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳測定樣本中蛋白質(zhì)量分布 采用BCA蛋白定量試劑盒測定培養(yǎng)上清液中蛋白含量；取含15 μg蛋白上清液上樣進行十二?；前匪岚封c-聚丙烯酰胺凝膠(質(zhì)量分數(shù)10%凝膠)電泳。在80 V恒壓下電泳60 min，然后120 V電泳至結(jié)束。采用膠體考馬斯亮藍染色試劑盒對凝膠進行染色并拍照。

1.2.3無標記定量分析法鑒定蛋白質(zhì) 取上清液樣品，采用BCA法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。添加丙酮沉淀蛋白質(zhì)，-20 ℃孵育過夜；4 ℃條件下12 000×g離心10 min后收集沉淀，用預(yù)冷混合液(V乙醇∶V丙酮∶V乙酸=50∶ 50∶ 0.1)洗滌沉淀2次，在12 000×g、4 ℃條件下離心15 min，收集沉淀，用6 mol/L鹽酸胍、300 mmol/L四乙基溴化銨溶解沉淀物。取100 μg蛋白質(zhì)沉淀，加入碳酸氫銨稀釋的胰蛋白酶，37 ℃條件下培養(yǎng)過夜；收集肽段并離心濃縮干燥；應(yīng)用Ziptip C18柱除去肽段中的鹽。用上樣緩沖液(V乙腈∶V水∶V甲酸=2∶ 98∶ 0.1)溶解樣品并進行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析。采用Nano-RPLCEasy-nLC 1000系統(tǒng)進行液相色譜分析，使用Q Exactive Plus納米電噴霧電離質(zhì)譜儀對肽樣品進行質(zhì)譜分析。以數(shù)據(jù)依賴模式運行質(zhì)譜儀,一級質(zhì)譜掃描范圍為350～1 600 m/z。在70 000的分辨率下檢測完整的肽，然后以17 500的分辨率選擇肽進行二級質(zhì)譜分析。

使用MaxQuant計算蛋白質(zhì)組學(xué)平臺1.5.8.3版(www.maxquant.org)及其內(nèi)置的Andromeda肽和蛋白質(zhì)識別搜索引擎進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，采用無標記定量(label-free quantification，LFQ)和基于強度的絕對定量(iBAQ)算法進行蛋白定量。在Swissprot Mus musculus數(shù)據(jù)庫中使用標準設(shè)置(肽質(zhì)量公差為±20 ppm，片段相對分子質(zhì)量公差為±0.5)比對質(zhì)譜數(shù)據(jù)。肽鑒定錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)設(shè)置為0.01，蛋白質(zhì)鑒定FDR設(shè)為0.05，氨基酸殘基≥7個。定量分析中只包括屬于蛋白質(zhì)的“unique plus razor peptides”。使用METASCAPE數(shù)據(jù)庫對鑒定的蛋白進行GO分析(http://metascape.org/gp/index.htmlmain/step1)。對鑒定的高豐度蛋白進行生物信息檢索，根據(jù)相關(guān)的生物學(xué)過程、分子功能和亞細胞定位對它們進行分類。

1.2.4多重系統(tǒng)分析白內(nèi)障晶狀體上清培養(yǎng)液中細胞因子質(zhì)量濃度 使用Bio Plex Magpix多重閱讀器分析白內(nèi)障晶狀體上清培養(yǎng)液中細胞因子質(zhì)量濃度，利用該系統(tǒng)可同時檢測和定量單個25～50 μl樣品中的多種低豐度細胞因子。使用多重磁珠免疫分析系統(tǒng)對細胞因子進行量化分析。檢測細胞因子包括白細胞介素(interleukin，IL)-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17A、嗜酸性粒細胞趨化因子、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、干擾素(interferon，IFN)-γ、趨化因子配體1(chemokine C-X-C motif ligand 1，CXCL1)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、調(diào)節(jié)激活正常T細胞表達和分泌細胞因子(regulate the expression and secretion of cytokines in activated normal T cells，RANTES)、巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)1α、MIP1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1、TGF-β2和TGF-β3。所有分析程序均按照說明書進行：用熒光標記的磁性微球與特異性捕獲抗體偶聯(lián)，并與待測樣品混合；加入生物素化檢測抗體和鏈霉親和素-R-藻紅蛋白。應(yīng)用Luminex-Magpix系統(tǒng)對混合物進行分析，利用該儀器的2種激光分別識別微球類型和量化結(jié)合抗原的數(shù)量。同時在每個測試板上平行測試標準濃度，生成標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣本中各細胞因子濃度。

2 結(jié)果

2.1 晶狀體白內(nèi)障模型建立

2 mmol/L過氧化氫處理后24 h晶狀體全部變混濁，在顯微鏡下觀察可見3個樣本中晶狀體囊膜均完整(圖1)。

圖1 小鼠晶狀體的顯微鏡下圖像(×15) A：剛從眼球中取出的晶狀體透明且囊膜無破損 B：過氧化氫處理后的晶狀體混濁且囊膜無破損

2.2 白內(nèi)障模型培養(yǎng)上清液蛋白圖譜分析

3個樣本的平均蛋白質(zhì)量濃度為(3.73±0.59)μg/μl。膠體考馬斯亮藍染色顯示樣本中蛋白條帶主要位于相對分子質(zhì)量35 000以下(圖2)。

圖2 晶狀體培養(yǎng)上清液聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(考馬斯亮藍染色) 過氧化氫處理24 h，晶狀體培養(yǎng)上清液中出現(xiàn)大量蛋白，蛋白條帶主要位于相對分子質(zhì)量35 000以下 圖3 3個樣本鑒定蛋白的異同分析

2.3 體外白內(nèi)障模型培養(yǎng)上清液中蛋白鑒定及生物信息學(xué)分析

共發(fā)現(xiàn)3 909個已鑒定的肽與3 713個獨特的肽序列相對應(yīng)，從而鑒定出675種蛋白。發(fā)現(xiàn)共521種蛋白同時存在于3個樣本中，82種蛋白同時存在于其中2個樣本中，72種蛋白只存在于其中1個樣本中(圖3)。本研究發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)高豐度蛋白為晶狀體蛋白，占所有蛋白的(86.1±0.8)%。

基于生物學(xué)過程的分類顯示，47種蛋白參與細胞-細胞黏附過程，占6.53%；44種蛋白與細胞轉(zhuǎn)化相關(guān)，占6.11%；43種蛋白與氧化還原有關(guān)，占5.97%；40種蛋白與抑制細胞凋亡有關(guān)，占5.56%；36種蛋白與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)，占5%；33種蛋白與凋亡過程有關(guān)，占4.58%；32種蛋白與細胞黏附有關(guān)，占4.44%；31種蛋白與代謝過程有關(guān)，占4.31%；30種蛋白與蛋白質(zhì)酶解有關(guān)，占4.17%；29種蛋白與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)，占4.03%(圖4A)；其余蛋白與翻譯啟動、mRNA的合成以及核小體的組裝等生物過程有關(guān)?；诜肿庸δ艿姆诸愶@示，258種蛋白具有蛋白質(zhì)結(jié)合功能，占35.83%;136種蛋白具有多聚RNA結(jié)合功能，占18.89%；128種蛋白具有核苷酸結(jié)合功能，占17.78%；79種蛋白具有與鈣黏蛋白結(jié)合參與細胞間黏附功能，占10.97%；70種蛋白具有水解酶活性，占10.56%；66種蛋白具有RNA結(jié)合功能，占9.17%；40種蛋白具有氧化還原酶活性，占5.56%；33種蛋白具有催化活性，占4.58%；27種蛋白具有翻譯起始因子活性，占3.75%；26種蛋白具有GTPase活性，占3.61%(圖4B)；其余蛋白具有肌動蛋白結(jié)合、酶結(jié)合以及蛋白激酶結(jié)合等分子功能。根據(jù)亞細胞定位對蛋白進行分類發(fā)現(xiàn)，492種蛋白分布在細胞質(zhì)，占68.33%；391種蛋白分布在外泌體，占54.31%；331種蛋白分布在細胞核，占45.97%；175種蛋白分布在質(zhì)膜，占24.31%；97種蛋白分布在胞外間隙，占13.47%(圖4C)。

圖4 體外白內(nèi)障模型培養(yǎng)上清液中蛋白生物信息學(xué)分析 A:蛋白主要參與的生物學(xué)過程 B:蛋白主要參與的分子功能 C：蛋白的主要亞細胞定位

2.4 體外白內(nèi)障模型培養(yǎng)上清液中不同細胞因子質(zhì)量濃度

采用基于抗體的多重微珠免疫分析方法檢測低豐度細胞因子，共檢測26種細胞因子，其中9種細胞因子均達檢測限(表1)，17種細胞因子在3個樣本中均未被檢測到。對照組未檢測到細胞因子。

表1 體外白內(nèi)障模型培養(yǎng)上清液中各細胞因子質(zhì)量濃度

3 討論

本研究采用晶狀體體外培養(yǎng)的方式，以過氧化氫誘導(dǎo)形成白內(nèi)障模型。目前，以過氧化氫誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的晶狀體形成白內(nèi)障的方法已十分成熟[2]。不同的研究采用了不同濃度(0.2、0.5、1、2 mmol/L)的過氧化氫誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的晶狀體形成白內(nèi)障模型。本實驗研究使用少量(400 μl)的培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)量眾多的(28個)晶狀體，故采用了常用濃度中的高限2 mmol/L過氧化氫培養(yǎng)晶狀體。

本研究通過液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出完整白內(nèi)障晶狀體體外過氧化氫處理后培養(yǎng)上清液中675種蛋白，其中相對分子質(zhì)量35 000以下的晶狀體蛋白占總蛋白豐度的(86.1±0.8)%。晶狀體蛋白是晶狀體內(nèi)的主要成分，包括α-、β-和γ-晶狀體蛋白3類，在維持晶狀體纖維細胞的結(jié)構(gòu)、折射率以及光學(xué)特性中發(fā)揮重要作用。已有研究在白內(nèi)障患者房水中檢測到一些晶狀體蛋白，包括β-晶狀體蛋白S、β-晶狀體蛋白B2、γ-晶狀體蛋白D等[3-4]。在白內(nèi)障患眼的玻璃體液中也證實存在晶狀體蛋白[5]。本研究證實白內(nèi)障晶狀體在體外培養(yǎng)的環(huán)境中同樣滲漏以晶狀體蛋白為主的蛋白質(zhì)，同時本結(jié)果顯示有更多種類的晶狀體蛋白能從白內(nèi)障晶狀體中漏出。

目前，大量的研究報道了晶狀體蛋白的生物學(xué)活性[6-7]。有研究顯示，大鼠視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷后，視網(wǎng)膜中α-、β-和γ-晶狀體蛋白轉(zhuǎn)錄表達增加[8]。在視網(wǎng)膜光損傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變和年齡相關(guān)性黃斑變性等視網(wǎng)膜疾病中也發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中晶狀體蛋白質(zhì)表達水平升高[9-10]。在應(yīng)激條件下，α-晶狀體蛋白能夠通過抑制非晶狀體組織中的caspases從而抑制細胞凋亡[11]。此外，由α-晶狀體蛋白衍生的小分子肽在包裹具有伴侶功能的活性部位時具有類似抗聚集和抗凋亡特性[12]。β-晶狀體蛋白B2在應(yīng)激條件下可促進視網(wǎng)膜色素上皮細胞的增生并提高細胞活力[13]。給予青光眼實驗動物模型玻璃體腔內(nèi)注射β-晶狀體蛋白B2可以減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞丟失，緩解視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的減少并保護視神經(jīng)[14]。此外，β-和γ-晶狀體蛋白能促進視網(wǎng)膜軸突再生[15-16]?；谝陨涎芯浚茰y白內(nèi)障患者晶狀體蛋白會從晶狀體滲漏到前房和玻璃體腔，保護除晶狀體以外的眼組織免受應(yīng)激性損傷，促進受損神經(jīng)元的修復(fù)。

此外，本研究還檢測到其他659種蛋白質(zhì)，其中生物學(xué)過程中占比第三的一組蛋白能通過氧化還原酶的分子功能介導(dǎo)還原反應(yīng)，從而抑制降低體內(nèi)氧化應(yīng)激程度。這些結(jié)果提示，白內(nèi)障晶狀體可能是眼內(nèi)具有抗氧化、細胞保護作用的蛋白質(zhì)儲存庫。在白內(nèi)障患者體內(nèi)，這些蛋白質(zhì)不斷地從晶狀體中漏出，其可能對其他組織有一定的作用，仍需進一步研究。

臨床研究顯示,白內(nèi)障手術(shù)后糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)和玻璃體后脫離(posterior vitreous detachment，PVD)相關(guān)的視網(wǎng)膜脫離風(fēng)險增加[17-18]，但其確切的機制尚不明確。已有研究表明，氧化應(yīng)激是DME和PVD相關(guān)視網(wǎng)膜脫離的重要因素[19]。推測白內(nèi)障手術(shù)后，晶狀體不再繼續(xù)滲漏抗氧化和保護細胞的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致玻璃體及視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激加劇，從而增加DME和視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生風(fēng)險。

但是，當(dāng)大量晶狀體蛋白滲漏到前房和玻璃體腔時，也可能誘發(fā)葡萄膜炎。例如，過熟期白內(nèi)障的晶狀體皮質(zhì)液化后形成的大量晶狀體蛋白漏出到晶狀體囊膜外；白內(nèi)障手術(shù)殘留的皮質(zhì)也會誘發(fā)單核細胞浸潤并吞噬處理這些蛋白質(zhì)，形成晶狀體源性葡萄膜炎[20]。

另外，根據(jù)亞細胞定位對蛋白質(zhì)進行分類，發(fā)現(xiàn)高達54.31%的蛋白質(zhì)是通過外泌體分泌的。外泌體為脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)體類似，使得蛋白質(zhì)大分子更容易透過晶狀體囊膜[21-22]。

本研究結(jié)果顯示，體外白內(nèi)障模型上清培養(yǎng)液中可檢測到MCP-1和TGF-β2等細胞因子。TGF-β2在眼內(nèi)作用明確，其屬于TGF-β超家族的成員，具有調(diào)節(jié)細胞生長、分化以及凋亡等功能;同時它作為一種房水免疫抑制因子，在眼的免疫調(diào)控機制中起到非常重要的作用。這2種細胞因子在白內(nèi)障患者的房水和玻璃體液中也處于較高水平[23-24]，表明白內(nèi)障晶狀體是眼內(nèi)液中部分細胞因子的來源之一。

本研究證實體外培養(yǎng)的白內(nèi)障晶狀體能向外滲漏晶狀體蛋白、其他具有抗氧化功能的蛋白質(zhì)以及一些活性細胞因子，推測白內(nèi)障晶狀體可能通過向外滲漏蛋白質(zhì)，從而影響眼內(nèi)其他組織的功能。然而，究竟人眼內(nèi)是否能夠觀察到這種影響，以及這種影響最終表現(xiàn)為保護或是損傷作用，仍需要進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝感謝重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科實驗室 眼科學(xué)重慶市重點實驗室提供的實驗平臺及設(shè)備