程 斌，王新宇，孫 鈺，張家泰，董淑英，

（1．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室，黑龍江 哈爾濱 150081；2．上海健康醫(yī)學(xué)院，上海 201318)

鄰苯二甲酸酯(phthalates，PAEs)是一組多元化合物，是具有內(nèi)分泌破壞特性的工業(yè)化學(xué)物，屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors，EDCs)的一種。常見的兩種PAEs類型是鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)和鄰苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate，DBP)。DEHP和DBP在飲用水、空氣和血液中均有較高的檢出率。Chen等檢測室內(nèi)場所PM中6種PAEs，發(fā)現(xiàn)其主要成分為DEHP和DBP，占PAEs總量的76.3%～97.7%。DEHP和DBP具有抗雄激素效應(yīng)，在低濃度下模擬雌激素對健康產(chǎn)生影響。有流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DEHP和DBP的暴露與乳腺癌的風(fēng)險相關(guān)。其中高水平的DBP暴露導(dǎo)致雌激素受體陽性乳腺癌發(fā)病率增加約兩倍。劉明奇等的病例對照研究結(jié)果顯示DEHP和DBP的暴露可能會增加乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險。但目前針對DEHP和DBP誘導(dǎo)MCF-7增殖的機(jī)制還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究。

二甲雙胍(metformin)是公認(rèn)治療2型糖尿病的一線藥物。近年來，研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以通過調(diào)控信號通路和改善血糖等途徑發(fā)揮細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、改善腫瘤微環(huán)境以及抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。Collins等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過降低雌激素受體的表達(dá)以及調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路減弱雌激素的促癌細(xì)胞增殖作用。流行病學(xué)研究表明，服用二甲雙胍可顯著降低糖尿病患者的癌癥發(fā)病率和死亡率，尤其是在乳腺癌中有顯著作用。目前，許多研究關(guān)注于DEHP和DBP的毒性作用以及二甲雙胍的抗癌作用，但尚無實驗將二甲雙胍作為保護(hù)劑抑制DEHP和DBP的毒性作用。因此，本研究以乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對象，初步探討二甲雙胍對DEHP和DBP誘導(dǎo)的MCF-7增殖和遷移的抑制作用，為二甲雙胍作為乳腺癌保護(hù)劑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

乳腺癌MCF-7細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院惠贈，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)、二甲雙胍購于美國Sigma公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于德國BioFrox公司；鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)購于東京化成工業(yè)株式會社；鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)購于北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；LY294002(PI3K抑制劑)和0.25%胰酶購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；優(yōu)級胎牛血清購于澳大利亞NQBB；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板(96/24/6)購于美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種到5 mL含10%的胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)瓶中(25 cm)，置37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.2.2 MTT實驗

收集細(xì)胞，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，鋪板調(diào)整細(xì)胞密度至1 000～10 000個/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。培養(yǎng)箱中孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，根據(jù)預(yù)實驗，分別選用二甲雙胍(2.5、5、10、20 mg/mL)，DEHP(20、40、100、200、400μg/mL)，DBP(0.14、0.28、0.7、1.4、2.8、14、28μg/L)。設(shè)DEHP、DEHP+二甲雙胍、DEHP+LY294002，DBP、DBP+二甲雙胍、DBP+LY294002共6組，作用于MCF-7細(xì)胞48 h。倒置顯微鏡下觀察。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20μL(即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的吸光度

D

(490)值。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取3次的平均值。

1.2.3 劃痕-損傷修復(fù)實驗

取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，常規(guī)消化、計數(shù)，接種6孔板，每孔接種細(xì)胞數(shù)為l×10/mL，37℃，CO體積分?jǐn)?shù)為5%條件下培養(yǎng)至80%～90%匯合時，用100μL槍頭末端在6孔培養(yǎng)板中央劃痕，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞碎片，更換培養(yǎng)基，孵箱中培養(yǎng)，以DMSO作為對照組，DEHP、DEHP+二甲雙胍、DEHP+LY294002，DBP、DBP+二甲雙胍、DBP+LY294002作為實驗組，分別在劃痕后0、24、48和72 h觀察劃痕愈合情況。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞體外遷移實驗

取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，常規(guī)消化，用DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。24孔板每孔用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液定容至600μL，每個實驗組設(shè)3個平行樣，并放入Transwell小室。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10個/mL，小室內(nèi)加入100μg/mL的DEHP、0.7μg/L的DBP和20 mg/mL的二甲雙胍，分組情況同1.2.3，補充無血清培養(yǎng)基至200μL，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室，將濾膜上層細(xì)胞用棉簽?zāi)ㄈ?，濾膜用4%多聚甲醛固定15 min，然后結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗凈，風(fēng)干鏡檢，400倍光鏡下選擇膜上、下、左、右、中5個不同視野觀察并計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，求平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DEHP和DBP誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞的增殖及二甲雙胍的抑制作用

2.1.1 細(xì)胞增殖實驗

DEHP在200μg/mL，DBP在1.4μg/L時對乳腺癌的增殖效果最強，均出現(xiàn)低濃度促進(jìn)乳腺癌增殖作用強于高濃度的現(xiàn)象，見圖1A和圖1B。二甲雙胍在最大濃度20 mg/mL時對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用最強(圖1C)，因此選用二甲雙胍20 mg/mL作為最佳抑制濃度。根據(jù)圖中的增殖曲線，選擇DEHP 20～200 μg/mL，DBP 0.14～1.4 μg/L時 在DEHP、DBP中分別加入20 mg/mL二甲雙胍，如圖1D和E所示，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以抑制DEHP、DBP所誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的增殖，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)。選用LY294002(PI3K/AKT通路阻斷劑)分別加入到DBP和DEHP中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖減弱，其結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)。

圖1 MTT實驗結(jié)果

2.1.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

各組細(xì)胞的生長情況見圖2，20～200μg/mL DEHP和0.14～1.4μg/L DBP單獨作用于細(xì)胞48 h，細(xì)胞增長迅速，細(xì)胞數(shù)量增加，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)。在DEHP+二甲雙胍、DBP+二甲雙胍實驗組中，細(xì)胞數(shù)量并無明顯增加，細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞周圍有細(xì)胞碎片生成，與DEHP和DBP單獨作用時相比，細(xì)胞數(shù)量減少(

P

＜0.05)。

2.2 DEHP和DBP誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞的遷移及二甲雙胍的抑制作用

2.2.1 劃痕-損傷修復(fù)實驗

在增殖實驗過程中，DEHP和DBP分別在100μg/mL和0.7μg/L時，二甲雙胍的抑制效果最好，因此選用DEHP 100μg/mL，DBP 0.7μg/L做細(xì)胞遷移實驗，結(jié)果見圖3。與溶劑對照組相比，DEHP和DBP單獨染毒組的劃痕愈合率較高。為了驗證DEHP和DBP是否通過PI3K/AKT信號通路誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的遷移，在DEHP和DBP中分別加入LY294002，與DEHP和DBP的單獨染毒組相比，DEHP+LY294002、DBP+LY294002實驗組的劃痕愈合率較低，且隨著時間的推移，其劃痕愈合率的差距明顯，72 h時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)。在DEHP、DBP中分別加入20 mg/mL二甲雙胍，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以抑制DEHP、DBP所誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的遷移，72 h時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)。

圖2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及分析

圖3 劃痕-修復(fù)愈合率分析

2.2.2 Transwell遷移實驗

與溶劑對照組相比，DEHP和DBP可以明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移，遷移的細(xì)胞量明顯增加(圖4)。在DEHP+二甲雙胍、DBP+二甲雙胍實驗組中，遷移的細(xì)胞量明顯減少，DEHP+LY294002、DBP+LY294002實驗組中MCF-7細(xì)胞遷移的細(xì)胞量也明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05，圖5)。

3 討論

圖4 MCF-7細(xì)胞的Transwell遷移實驗結(jié)果(×400)

圖5 Transwell遷移實驗的統(tǒng)計分析

DEHP和DBP屬于脂溶性有機(jī)物，長期暴露于高濃度DEHP和DBP可以在體內(nèi)長期蓄積，對人體產(chǎn)生持久危害。目前，研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸酯大量存在于環(huán)境中，Zhang等進(jìn)行大氣樣品的檢測發(fā)現(xiàn)PM中DEHP和DBP的平均濃度分別為136和43.8 ng/m。Luo等對21個國家的瓶裝水進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)DEHP檢出率分別高達(dá)61.7%，濃度范圍為393～1 499 mg/kg；DBP的檢出率為67.6%，其濃度范圍為21～73 mg/kg，根據(jù)歐盟“關(guān)于食品接觸塑料制品的規(guī)定”，DEHP和DBP分別不得超過1.5和0.5 mg/kg，以此判斷21個國家瓶裝水中DEHP和DBP的濃度超過了安全標(biāo)準(zhǔn)。王宇希等對哈爾濱市居民血液檢測中發(fā)現(xiàn)，DEHP和DBP的檢出率分別為86.19%和19.82%，其含量分別為19.29和68.73 ng/mL；孫卓如等對哈爾濱市新生兒臍帶血檢測發(fā)現(xiàn)，DEHP和DBP的檢出率分別為99.2%和100%，其含量分別為11.3和24.43 ng/mL，這兩項研究表明，DEHP和DBP在人體血液內(nèi)有較高水平。Fu等研究發(fā)現(xiàn)，尿液中DEHP代謝物與乳腺癌的發(fā)病率高度相關(guān)，Thomas等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度暴露于DBP后，乳腺癌發(fā)病率增加約2倍。這兩項研究表明，DEHP、DBP與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。

本研究采用MTT實驗，結(jié)果顯示DEHP和DBP在低濃度可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖，高濃度促進(jìn)乳腺癌增殖效應(yīng)弱于低濃度，總體出現(xiàn)“倒U”形劑量-效應(yīng)曲線，該結(jié)果與Chen等研究的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線相符，這可能是由于DEHP和DBP在高濃度時產(chǎn)生細(xì)胞毒性，促進(jìn)乳腺癌增殖作用減弱，最終出現(xiàn)該效應(yīng)曲線。本研究在DEHP和DBP中分別加入LY294002(PI3K/AKT信號通路阻斷劑)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與DEHP和DBP單獨染毒組相比，細(xì)胞增殖明顯減弱。Chen等研究顯示低濃度的鄰苯二甲酸酯(DEHP、DBP、BBP)通過PI3K/AKT信號通路使其相關(guān)蛋白P-PI3K、PAKT、PCNA表達(dá)增加，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖。推測DEHP和DBP誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖可能與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

細(xì)胞遷移試驗中，細(xì)胞劃痕和Transwell遷移實驗表現(xiàn)出具有較好的一致性，與溶劑對照組相比，DEHP和DBP均能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移，DEHP和DBP加入LY294002后，DEHP和DBP誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移作用減弱。Hsieh等研究發(fā)現(xiàn)，AKT磷酸化導(dǎo)致Vimentin蛋白表達(dá)增加是DEHP和DBP誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲的重要原因，因此推斷PI3K/AKT信號通路在DEHP和DBP誘導(dǎo)乳腺癌遷移、侵襲方面起重要作用。

大量研究表明二甲雙胍可以抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移。本研究中，二甲雙胍可以明顯抑制MCF-7細(xì)胞增殖，且細(xì)胞活性隨二甲雙胍濃度增加而逐漸下降。將二甲雙胍分別加入DEHP和DBP中，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以抑制DEHP和DBP誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度DEHP和DBP可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖和遷移，二甲雙胍可以作為保護(hù)劑抑制其增殖和遷移，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。