虞欣璐，于 兵，#，王 辰，張紅霞，朱海英，*

(1．海軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室，上海 200433；2．解放軍960醫(yī)院檢驗科，山東 濟南 250031)

譜系重編程(lineage reprogramming)是指不經(jīng)過中間的多能性狀態(tài)而直接通過轉分化將一種成熟的體細胞轉變成其他類型的體細胞或者成體干細胞。近年來，利用譜系重編程技術，研究者已經(jīng)可以將成纖維細胞轉分化為心肌細胞、感光細胞，將神經(jīng)膠質(zhì)祖細胞轉分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元，將人膽囊細胞轉分化為產(chǎn)生胰島素的β樣細胞。2014年，海軍軍醫(yī)大學細胞生物學教研室胡以平教授團隊在小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast cells，MEF)中過表達肝臟器官發(fā)生相關的兩個轉錄因子，肝細胞核因子1β(hepatocyte nuclear factor 1-β，Hnf1β)和叉頭框a3(forkhead box A3，F(xiàn)oxa3)，配合適當?shù)恼T導培養(yǎng)液，經(jīng)過15～20 d，可以將其重編程為誘導性肝干細胞iHepSCs(induced hepatic stem cells)。他們的研究證明iHepSCs具有雙向分化能力，細胞移植后可修復受損肝組織且不具有成瘤能力，具有潛在的臨床應用前景，但該過程所涉及的分子機制還不清楚。例如，重編程過程中的關鍵基因是如何被激活的，細胞的表觀遺傳特性又發(fā)生了哪些變化，哪些因子的激活和持續(xù)表達是重編程的關鍵因素等問題均需進一步闡明，才能為今后將該技術體系應用于人的成纖維細胞轉分化研究提供更多的參考。

有研究表明四環(huán)素控制的誘導型表達載體在重編程分子機制研究方面發(fā)揮了重要作用。2008年，Brambrink等和Stadtfeld等就利用這個體系揭示了MEF去分化成為誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)重編程的時間進程，鑒定了每個階段的關鍵基因，為研究重編程機制提供了重要的研究資料。受該研究的啟發(fā)，我們認為確認譜系重編程的時間進程、確定關鍵基因的激活次序及作用是闡明MEF轉分化為iHepSCs過程中所涉及分子機制的必須和重要前提。

在本研究中利用pLVX-TetOne-Vector慢病毒載體分別構建了四環(huán)素控制的誘導型表達載體TetOHnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry。pLVX-TetOne-Vector慢病毒載體是集調(diào)控與應答功能于一體的四環(huán)素誘導載體，可以通過在培養(yǎng)液中加入四環(huán)素或撤掉四環(huán)素來實現(xiàn)目的基因表達開/關的人為控制。通過對獲得的轉分化細胞iHepSCs-Dox生物學特性的鑒定，我們成功建立了四環(huán)素控制的MEF細胞轉分化為肝干細胞的誘導體系，同時我們利用該體系檢測到在細胞轉分化過程中，細胞內(nèi)源性

Hnf1

β和

Foxa3

并沒有被激活，由此提出外源基因的持續(xù)表達是iHepSCs-Dox細胞干性維持的必要條件，這為深入研究譜系重編程機制提供了便利。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM購自HyClone公司；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA、ITS、PBS，雙 抗(Pen/Strep，100×)、β-巰 基 乙 醇(2-mercaptoethanol)購自Gibco公司；尼克酰胺(nicotinamide，NA)、慶大霉素(gentamycin)、地塞米松(dexamethasone，Dex)、多西環(huán)素(doxycycline)購自Sigma公司；肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、維生素C(vitamin C)購自Polysciences公司；

Eco

RⅠ及

Bam

HⅠ限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；T4連接酶(T4 Ligase)、RNAiso Plus、RNA逆轉錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit)、定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)均購自TaKaRa公司；Vigofect轉染試劑購自Vigorous公司；Cell Cycle Staining Kit購自聯(lián)科生物公司。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡，Nikon公司生產(chǎn)；普通PCR儀，Eppendorf公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀，Applied Biosystems公司生產(chǎn)；流式細胞儀，Beckman coulter公司生產(chǎn)。

1.3 細胞

MEF來源于野生型C57BL/6J小鼠，iHepSCs由胡以平教授惠贈。

1.4 實驗方法

1.4.1 TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry載體構建和鑒定

Hnf1

β和

Foxa3

基因片段由本實驗室克隆獲得。將兩個基因片段克隆到pLenti-CMVEGFP-3FLAG-PGK-Puro表達載體上，構建pCMVHnf1β-EGFP和pCMV-Foxa3-mCherry載體(和元公司合成)，這兩個質(zhì)粒上，

Hnf1β

基因與增強型綠色熒光蛋白EGFP之間，

Foxa3

基因與紅色熒光蛋白mCherry之間均由2A序列間隔，使目的基因與熒光蛋白非融合共表達。通過限制性內(nèi)切酶

Eco

RⅠ和

Bam

HⅠ酶切回收獲得pCMV-Hnf1β-EGFP和pCMV-Foxa3-mCherry載體質(zhì)粒中2 400 bp的Hnf1β-2A-EGFP片段和1 848 bp的Foxa3-2A-mCherry片段，然后通過T4連接酶將其分別克隆到pLVX-TetO-Vector載體的

Eco

RⅠ、

Bam

HⅠ位點(雙酶切后得到8 253 bp的載體片段)上，然后將連接產(chǎn)物轉化Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細胞，鋪板，培養(yǎng)后挑取單克隆菌落進行擴增并提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取后用

Eco

RⅠ/

Bam

HⅠ雙酶切鑒定，片段大小與預期結果一致，分別命名為TetO-Hnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry。測序結果證實載體片段和目的基因片段進行了正確的連接。

1.4.2 慢病毒包裝、收集與感染細胞

MEF和293FT細胞用DMEM高糖培養(yǎng)基(添加10%FBS，不含抗生素)，在5%二氧化碳培養(yǎng)箱，95%濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

將293FT細胞培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿70%～80%面積時利用Vigofect進行質(zhì)粒轉染，按試劑說明書將總的20 μg質(zhì)粒DNA(目的基因質(zhì)粒10μg、病毒包裝質(zhì)粒psPAX2 6μg、包膜質(zhì)粒pMD2.G 4μg)與8μL Vigofect轉染試劑混勻后逐滴加入293FT細胞培養(yǎng)皿中，在轉染48 h時收取含慢病毒的上清液，用0.45 μm濾器過濾后，分裝凍存于-80℃冰箱中。

MEF細胞感染前1 d，按1×10個/孔接種于0.02%明膠包被過的6孔板。MEF細胞接種后24 h，每孔各加入1 mL病毒液進行感染，同時加入3.5μg/mL polybrene以促進感染，感染6 h后棄去病毒液，PBS清洗3次后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后以同樣病毒量重復感染1次。

1.4.3 最適Doxycycline誘導濃度的確定

用含TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry的病毒上清分別感染293FT細胞，之后再以終濃度為0、1、10、100、500、1 000 ng/mL的Dox來啟動外源基因的表達，比較不同Dox濃度和不同誘導時間的熒光表達差異。在Dox誘導24 h后更換不含Dox的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，分別取樣，用qPCR檢測轉錄因子Hnf1β和Foxa3的表達情況。

1.4.4 iHepSCs-Dox細胞系的建立

參照Yu等建立MEF誘導轉分化的方法獲得iHepSCs-Dox細胞。用含TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry的病毒上清感染MEF，在加入Dox誘導24～48 h后進行流式分選，富集熒光(綠色和紅色)雙陽性細胞，之后更換HepSCs培養(yǎng)液SCM-A繼續(xù)培養(yǎng)。SCM-A的成分包含DMEM/F12、胎牛血清(FBS，10%)、雙抗(1×)、ITS(1×)、HGF(10 ng/mL)、EGF(10 ng/mL)、Dex(1×10mol/L)、NA(10 mmol/L)、β-巰基乙醇(0.1 mmol/L)，慶大霉素(50μg/mL)。誘導期間隔天更換一次培養(yǎng)基，第20天可觀察到較多的上皮樣集落出現(xiàn)。在顯微鏡下刮除成纖維細胞，使上皮樣細胞獲得生長優(yōu)勢，進而擴大培養(yǎng)獲得iHepSCs-Dox細胞。

1.4.5 體外誘導iHep SCs-Dox向肝細胞分化

將誘導后的iHepSCs-Dox接種到預先鋪過基質(zhì)膠的平板中，改用肝向誘導培養(yǎng)基(HDM)進行誘導分化，HDM成分包含DMEM/F12、10%FBS、Oncostatin M(20 ng/mL)，雙抗(1×)、L-Ascorbic acid(0.1 mmol/L)、EGF(20 ng/mL)、Dex(1×10mol/L)、NA(10 mmol/L)。

1.4.6 實時熒光定量PCR

采用TaKaRa公司的RNAiso Plus裂解液提取293FT細胞總RNA，并反轉錄成cDNA。反轉錄完成后將cDNA溶液稀釋5倍，按qPCR試劑說明配制反應體系進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測，反應完成后對原始數(shù)據(jù)根據(jù)-ΔΔ

C

進行分析。所用引物見表1。

1.4.7 反轉錄PCR檢測

采用RNAiso Plus裂解液提取MEF、iHepSCs、iHepSCs-Dox細胞總RNA，利用PrimeScriptRT Reagent Kit進行逆轉錄，獲得cDNA。然后將cDNA溶液稀釋至20%按PCR試劑說明配制反應體系，進行反轉錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)擴增，之后用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。電泳結束后利用紫外成像系統(tǒng)拍攝膠圖。所用引物見表2。

表1 qPCR引物信息

表2 反轉錄PCR引物信息

1.4.8 堿性磷酸酶染色

按照碧云天公司的BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說明書進行。細胞用PBS清洗后加入4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)，室溫固定10 min，PBS清洗后加入BCIP/NBT染色工作液染色至預期深淺，去除染色液，ddHO清洗1～2次終止反應后用掃描儀獲取染色圖像。

1.4.9 克隆形成率檢測

將處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制備單細胞懸液，按每孔500個細胞接種至6孔板，每組設3個復孔，連續(xù)培養(yǎng)5 d后，用4%PFA室溫固定15 min，棄去固定液，用結晶紫染液染色10～30 min，流水沖去染液，自然干燥，掃描儀掃描后統(tǒng)計克隆數(shù)，克隆形成率=平均克隆數(shù)/接種的單個細胞數(shù)×100%。

1.4.10 細胞周期檢測

本實驗周期檢測采用Cell Cycle Staining Kit，其原理為碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料與DNA結合，利用流式細胞儀檢測細胞中DNA熒光強度變化來判斷細胞所處周期。首先利用胰酶消化制備單細胞懸液，離心收集細胞(細胞數(shù)約為2×10～1×10個)。去上清后再次用PBS懸浮細胞，離心后棄上清。在收集的細胞中加入1 mL的試劑A和10μL的試劑B，渦旋混勻5～10 s。室溫孵育30 min后上機分析。實驗步驟參照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學方法

組間比較采用

t

檢驗。利用GraphPad Prism 5軟件繪圖。以

P

＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四環(huán)素誘導型慢病毒載體的構建與鑒定

圖1A結果顯示將質(zhì)粒pCMV-Hnf1β-EGFP、pCMV-Foxa3-mCherry、pLVX-TetO-Vector利用

Eco

RⅠ和

Bam

HⅠ進行酶切后，得到2 400 bp的Hnf1β-2A-EGFP、1 848 bp的Foxa3-2A-mCherry、8 253 bp的pLVX-TetOne載體片段用于后續(xù)的質(zhì)粒構建。圖1B和1C結果顯示新構建的質(zhì)粒TetO-Hnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry用

Eco

RⅠ/

Bam

HⅠ雙酶切后得到的片段大小與預期結果一致。

圖1 四環(huán)素誘導型慢病毒表達載體的構建

2.2 四環(huán)素誘導型載體表達檢測及最適Dox誘導濃度的確定

為了保證我們所構建的四環(huán)素控制的表達載體能有效而快速地啟動或關閉外源基因的表達，首先要對誘導條件進行優(yōu)化。目前的研究認為四環(huán)素控制系統(tǒng)常以終濃度為1～2μg/mL的Dox進行誘導，我們在這個濃度范圍內(nèi)進行濃度和時間梯度實驗，以確定最適的誘導條件。另外，由于293FT細胞相比MEF細胞更容易感染病毒顆粒，我們利用293FT細胞中對該載體表達的有效性及最適誘導濃度進行了確定。實驗結果見圖2A和圖2B。比較不同濃度Dox誘導結果，可以看出，使用1和10 ng/mL的Dox誘導，在24 h內(nèi)均未觀察到紅色或綠色熒光出現(xiàn)，而使用100、500和1 000 ng/mL濃度誘導15 h，即可觀察到細胞熒光出現(xiàn)，而且隨著時間延長至24 h，熒光強度也明顯增強，但是3個濃度下，熒光強度在兩個時間點上均無明顯差異。比較撤去Dox后細胞中熒光表達情況，發(fā)現(xiàn)各Dox濃度下，綠色和紅色熒光在撤去Dox之后熒光強度都逐漸減弱，但是綠色熒光在48 h強度有明顯衰退，相比而言，紅色熒光衰退速度與Dox的濃度呈負相關，但100 ng/mL誘導的紅色熒光在48 h也有明顯衰退，1 000 ng/mL誘導96 h才呈現(xiàn)明顯衰退。在撤去Dox 5 d之后，不論最初以何種濃度誘導，均不再觀察到綠色熒光的表達，而紅色熒光的表達亦很微弱，此外，圖2C和2D的qPCR檢測結果表明，Dox誘導24 h與撤去Dox 48 h的細胞中外源雙因子Hnf1β和Foxa3的基因表達水平與熒光蛋白表達具有一致性。因此，我們認為，TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry載體上外源基因的表達，只需終濃度為100 ng/mL的Dox即可快速啟動，而且在撤去Dox后能快速關閉，所以我們選擇100 ng/mL作為Dox啟動外源基因表達的最適濃度。

圖2 不同Dox誘導濃度下外源因子的表達水平

2.3 利用四環(huán)素誘導型表達載體和干細胞培養(yǎng)基建立iHepSCs-Dox細胞系

結合前期誘導MEF細胞轉分化的實驗體系，我們建立了如圖3所示的基于TetO-Hnf1β-EGFP與TetOFoxa3-mCherry表達載體的誘導實驗流程，成功獲得了如圖4所示的由MEF細胞轉分化而來的上皮樣細胞克隆。

如圖4所示，在誘導培養(yǎng)20 d時觀察到上皮樣細胞集落的形成，該上皮細胞核質(zhì)比較大，具有干細胞的典型特征。通過刮除細胞克隆周圍的成纖維樣細胞，使上皮樣細胞獲得生長優(yōu)勢。隨著誘導時間的延長，上皮樣細胞增殖速度加快，并形成細胞克隆。之后挑取克隆，并擴大培養(yǎng)，最終建立克隆化細胞系，命名為iHepSCs-Dox。

圖3 MEF轉分化為iHepSCs-Dox細胞誘導實驗流程

圖4 TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry病毒感染MEF 20 d時產(chǎn)生上皮樣集落

2.4 iHep SCs-Dox細胞的形態(tài)和生長特性

在對挑取的克隆進行擴大培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，所誘導的細胞在形態(tài)和生長特性方面與iHepSCs非常相似，如圖5A顯示，在低密度培養(yǎng)時，細胞呈現(xiàn)三角形或多邊形，且細胞間有長突起相連；而在高密度培養(yǎng)的情況下，細胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣形態(tài)。

另外，iHepSCs-Dox與iHepSCs在增殖能力方面存在差異。圖5B結晶紫染色結果顯示，iHepSCs-Dox的克隆形成能力低于iHepSCs，iHepSCs-Dox克隆形成率為8%，iHepSCs-Dox克隆形成率為23%，說明前者自我更新能力(單個細胞增殖能力)低于后者；CCK-8實驗結果顯示iHepSCs-Dox增殖速率(群體細胞增殖能力)也低于iHepSCs(圖5C)。細胞周期檢測結果顯示，與iHepSCs相比，iHepSCs-Dox G1期細胞數(shù)要高于iHepSCs，而其G2期及S期細胞數(shù)明顯少于iHepSCs(圖5D)，該結果表明細胞增殖速率存在差異。

圖5 iHepSCs-Dox細胞的體外生長特征

2.5 iHepSCs-Dox細胞的干性特征鑒定

RT-PCR檢測MEF、iHepSCs、iHepSCs-Dox細胞基因表達水平，如圖6A顯示，iHepSCs-Dox與iHepSCs一樣，表達膽管細胞標志CK19、肝膽共同標志CK18以及肝干細胞標志Dlk1、Sox9、EpCAM。

堿性磷酸酶在多能干細胞中染色結果呈陽性，被認為是干細胞的特性之一。如圖6B所示，iHepSCs、iHepSCs-Dox細胞呈現(xiàn)堿性磷酸酶染色陽性，而MEF為陰性。

在Dox存在的情況下，利用HDM誘導培養(yǎng)液對iHepSCs-Dox進行肝向誘導第8天時，可觀察到如7E所示的典型肝細胞樣集落形成，這與iHepSCs的誘導分化情況一致。

根據(jù)以上結果，我們認為雖然iHepSCs-Dox細胞與iHepSCs在增殖能力方面存在差異，但是在干性特征方面相似度很大，具備肝干細胞的特性。

圖6 iHepSCs-Dox細胞的鑒定

2.6 iHepSCs-Dox細胞的干性維持依賴于外源因子的表達

在對iHepSCs-Dox細胞進行初步鑒定，確定了iHepSCs-Dox的干細胞性質(zhì)之后，我們分別收集了撤去培養(yǎng)液中的Dox之后在第10和第20天的細胞，RTPCR檢測其基因表達情況。如圖7A所示，在撤去Dox第10天之后，與持續(xù)Dox誘導的iHepSCs-Dox細胞相比，CK18、EpCAM的表達有所下調(diào)；在撤去Dox第20天時，甚至檢測不到肝膽共同標志CK18的表達；而Sox9的表達水平在撤去Dox之后卻有了明顯的上升。不僅如此，細胞的自我更新能力和增殖速率也呈現(xiàn)明顯降低。如圖7B顯示，克隆形成率實驗中，在6孔板中接種起始500個細胞，撤去Dox 10 d的iHepSCs-Dox在接種后第5天不能形成克隆，而作為對照的持續(xù)Dox誘導的iHepSCs-Dox卻能正常形成克??；圖7C中CCk-8實驗顯示iHepSCs-Dox撤去Dox 10 d后生長速率明顯低于iHepSCs-Dox。同樣，圖7D的細胞周期檢測結果顯示，與iHepSCs-Dox相比，iHepSCs-Dox撤去Dox 10 d后，G1期細胞數(shù)明顯高于iHepSCs-Dox，而其G2期及S期細胞數(shù)明顯少于iHepSC-Dox。還有一個值得注意的現(xiàn)象是在iHepSCs-Dox誘導分化為肝細胞的實驗中，如圖7E所示，在添加了Dox誘導培養(yǎng)液的作用下，在第8天即觀察到了肝細胞樣克隆的出現(xiàn)；而在不含有Dox的誘導培養(yǎng)液中，如圖7F所示，我們不僅沒有觀察到肝細胞樣克隆的出現(xiàn)，還發(fā)現(xiàn)其由上皮樣細胞向成纖維細胞形態(tài)變化。再者，我們檢測了iHepSCs-Dox細胞中在撤去Dox第10天后內(nèi)源基因的表達情況，圖7G的RT-PCR結果顯示iHepSCs-Dox細胞的內(nèi)源性

Hnf1

β和

Foxa3

均無表達。這提示我們建立的iHepSCs-Dox細胞干性維持相關特征性基因的表達水平，需要外源基因

Hnf1

β和

Foxa3

的表達才能得以保證。這種情況也為我們分析重編程相關的受Hnf1β和Foxa3調(diào)控的基因網(wǎng)絡提供了便利。

3 討論

圖7 iHepSCs-Dox細胞的干性維持依賴于外源因子的表達

本研究構建了四環(huán)素誘導型的Hnf1β和Foxa3轉錄因子慢病毒表達載體，感染MEF后利用Dox來啟動外源雙因子的表達，經(jīng)純化和擴增獲得了由MEF轉分化形成的iHepSCs-Dox細胞系，并從細胞形態(tài)、基因表達及干細胞特性等方面證明了該細胞系與iHepSCs細胞系的相似性，說明我們成功建立了四環(huán)素控制的MEF細胞轉分化為iHepSCs的誘導體系。

如前所述，四環(huán)素控制的誘導型表達載體在研究重編程機制方面得到廣泛的應用。在本研究中，我們利用的pLVX-TetOne載體，因為包含四環(huán)素誘導所需的表達和應答元件，所以慢病毒載體本身骨架比較長，限制了插入基因的片段長度，因此我們將

Hnf1β

和

Foxa3

基因分別插入到兩個載體上，但用不同的熒光報告基因作指示，這樣就可以篩選單熒光表達陽性和雙熒光表達陽性的細胞，為研究

Hnf1

β和

Foxa3

基因在重編程表達中的作用提供了方便。但是這也帶來了另一個問題，因為表達載體的總長度約11 kb，加之MEF細胞本身又不易感染病毒顆粒，所以造成感染效率較低。為了提高轉染效率，我們在實驗中使用了轉染效率更高的轉染試劑以及產(chǎn)毒效率更高的293FT細胞來進行病毒的包裝，最后獲得的雙陽性細胞比例達到10%。在后續(xù)的實驗中我們將會采用超速離心的方法對病毒進行濃縮以提高病毒滴度，期望能進一步提高感染效率。我們利用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)源

Hnf1β

和

Foxa3

表達并沒有被激活，這就為利用Dox的撤除關閉雙因子表達的方式來研究轉分化相關的受Hnf1β和Foxa3調(diào)控的基因網(wǎng)絡提供了便利。研究表明，Hnf1β是一個具有POU同源域的轉錄因子，F(xiàn)oxa3是forkhead轉錄因子家族一員，它們在肝臟發(fā)育進程中具有關鍵作用，有研究證明在小鼠肝臟中過表達Hnf1β能加速細胞增殖，促進肝臟再生，而Wangensteen等的研究表明，過表達Foxa3亦能促進肝臟再生。從這兩個轉錄因子的功能考慮，在內(nèi)源性雙因子未被激活表達的情況下，通過Dox來控制兩個外源轉錄因子的表達，同時結合干細胞表型的改變，就能比較容易找到與iHepSCs干細胞特性維持相關的基因。本實驗中，我們也的確檢測到了幾個成體肝干細胞干性相關基因表達隨著雙因子表達的關閉而發(fā)生了表達水平的變化。比如我們檢測到iHepSCs中，在關閉兩個轉錄因子表達后，CK18、EpCAM的表達都有所下調(diào)；在撤去Dox第20天時，甚至檢測不到肝膽共同標志CK18的表達；而Sox9的表達水平在撤去Dox之后卻有了明顯的上升。以上現(xiàn)象一方面說明了我們所使用的雙因子的確具有使MEF細胞重編程進而轉分化的能力，另一方面該結果也提示了細胞轉分化機制的復雜性。關于多能性重編程的研究指出，MEF細胞轉分化為iPSCs細胞的過程中內(nèi)源性

OCT4

基因的表達在某一個時間點是被激活的，而且這可以作為細胞多能性建立的標志，即使這時關閉外源OCT4的表達，細胞仍然能夠重編程成功并獲得iPS細胞，但Takumi等利用OCT4、KLF4、SOX2、L-MYC和NANOG這5個轉錄因子將人成纖維細胞轉分化為神經(jīng)干細胞的實驗中，發(fā)現(xiàn)誘導完成后內(nèi)源性的OCT4和NANOG仍然未被激活，撤去培養(yǎng)液中的Dox后，細胞所呈現(xiàn)的神經(jīng)干細胞樣形態(tài)會逐漸丟失并且出現(xiàn)分化，這種現(xiàn)象與我們的實驗結果類似。這些差別提示成纖維細胞向不同分化等級的干細胞轉分化或去分化的過程中所涉及的分子機制存在較大差異，值得進一步深入研究，要獲得穩(wěn)定表型的成體干細胞可能需要對轉分化的誘導條件進行進一步優(yōu)化。