劉青云，康陳萍，肖倩倩，郝衛(wèi)東

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系/食品安全毒理學(xué)研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191)

稀土元素是元素周期表中IIIB族的釔和鑭系元素的總稱，鈰是稀土元素中豐度最高、應(yīng)用最為廣泛的元素。我國是稀土資源大國，儲量、生產(chǎn)和出口均列全球之首，隨著開采及使用的增加，鈰元素等稀土的職業(yè)暴露、環(huán)境暴露、醫(yī)源性暴露隨之加大。監(jiān)測調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山東礦區(qū)、江西輕稀土礦和江西重稀土礦區(qū)礦工頭發(fā)中稀土含量超對照組6～16倍。稀土礦區(qū)小學(xué)生尿液中檢出的稀土元素含量明顯高于非礦區(qū)學(xué)生。同時礦區(qū)內(nèi)自然生活環(huán)境稀土元素暴露嚴(yán)重，空氣、生活飲用水以及土壤中鈰的質(zhì)量分?jǐn)?shù)中位數(shù)分別為0.164μg/m、0.164μg/L和75.413 mg/kg，均顯著高于對照區(qū)。研究表明礦區(qū)周圍市售水果、蔬菜、糧食、茶葉、肉類、鮮凍水產(chǎn)品中均含有稀土元素，其中以茶葉中所含稀土元素最高。在2017年一項調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，江西某地的茶葉中稀土元素的含量平均值3.06 mg/kg，檢出率100%、超標(biāo)率達(dá)到了49.6%，其中鈰元素含量最高達(dá)到了0.85 mg/kg，占稀土總量的31%。稀土元素長期攝入會在相關(guān)器官蓄積引起神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等全身性、多系統(tǒng)的健康損害。其中生殖發(fā)育系統(tǒng)對化學(xué)物的毒性作用非常敏感，稀土元素可透過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，因此鈰元素等稀土的安全性問題及胚胎發(fā)育毒性引起了社會極大關(guān)注。早期資料報道，稀土元素可以造成死胎率、畸胎率升高，引起胎兒生長發(fā)育遲緩及器官的不可逆損傷。但目前單一稀土元素鈰的胚胎發(fā)育毒理學(xué)資料尚不夠完整。

隨著動物福利3R(replace，redcuce，refine)原則的推進(jìn)以及大量新化合物的出現(xiàn)，毒理學(xué)替代方法受到廣泛重視。體外替代實驗具有簡便、經(jīng)濟(jì)、周期短、劑量-反應(yīng)關(guān)系易測等優(yōu)勢，已普遍應(yīng)用于發(fā)育毒性的篩選和致畸機(jī)制的研究?，F(xiàn)已有3種體外模型，即全胚胎培養(yǎng)試驗(whole embryo culture test，WEC)、微團(tuán)檢測試驗(micromass test，MM)和胚胎干細(xì)胞試驗(embryonic stem cell test，EST)于2003年正式通過歐洲替代方法驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)驗證，并作為發(fā)育毒性的篩選方法。本研究擬補充稀土元素鈰的胚胎發(fā)育毒理學(xué)資料，參考ECVAM植入后全胚胎培養(yǎng)模型和微團(tuán)培養(yǎng)模型，評價硝酸鈰的胚胎發(fā)育毒性，為進(jìn)一步開展體內(nèi)實驗研究及合理制定人群稀土接觸的健康指導(dǎo)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細(xì)胞

SD大鼠(雄性280～300 g，雌性220～240 g)，北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(合格證號11804700015381)。大鼠在晝/夜循環(huán)12/12 h，溫度20～24℃，濕度50%～60%的封閉環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，每日18:00將SD大鼠按雌、雄2∶1比例合籠，次日7:00進(jìn)行陰道涂片，鏡下查見精子視為受孕成功，當(dāng)天定為孕第0天(GD0)。動物實驗方案經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會實驗動物福利倫理分會審查批準(zhǔn)。

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞BALB/c 3T3細(xì)胞系，由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心贈送。

1.2 主要試劑與儀器

硝酸鈰(純度大于99.999%)、Ham"s F-12培養(yǎng)基、臺盼藍(lán)、中性紅、阿利新藍(lán)均購于美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素購于美國Thermo公司(Gibco系列)；胰蛋白酶(1∶250)購于美國BD公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(tetrazolium bromide，MTT)、鹽酸胍、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉購于美國Amresco公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于美國Santa Cruz公司；胎牛血清購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

主要儀器包括：體視顯微鏡(OLYMPUS公司SZX2-ILLT型)，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱(Gold-SIM公司Hp11型雜交箱改裝)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司HERA cell型)，酶標(biāo)儀(Omega公司FLUOstar Omega型)，低溫離心機(jī)(Heraeus公司Biofuge Stratos型)，顯微鏡和顯微鏡成像設(shè)備(Nikon公司TE2000-S型顯微鏡和Motic公司2000型成像設(shè)備)。

1.3 植入后全胚胎培養(yǎng)試驗

1.3.1 全胚胎培養(yǎng)

根據(jù)實際受孕情況，每次取1～3只受孕9.5 d(GD9.5)的SD大鼠進(jìn)行實驗，在無菌環(huán)境下暴露腹腔取出子宮，剪開子宮分離蛻膜團(tuán)，將胚胎從蛻膜團(tuán)中剖開，在體視顯微鏡下剝除Reichert"s膜，選擇含3～5個初始體節(jié)、外形充盈的胚胎，將胚胎隨機(jī)分為4組，每組放入2～3只胚胎。試驗共取用8只孕鼠，每個劑量組至少7只胚胎。將4 mL預(yù)溫的大鼠即刻離心血清及相應(yīng)濃度的硝酸鈰加入50 mL培養(yǎng)瓶中，于37℃、40 r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，在模型允許的范圍內(nèi)，將胚胎畸形率達(dá)100%時的受試物濃度作為最高濃度，對胚胎生長無明顯作用時的濃度作為最低濃度，按一定的濃度梯度進(jìn)行稀釋，硝酸鈰最終染毒濃度分別為0.00、0.50、0.75和1.00 mmol/L。分別于開始培養(yǎng)前(10%O，5%CO，85%N)、培養(yǎng)至第16小時(20%O，5%CO，75%N)、第26小時(40%O，5%CO，55%N)進(jìn)行3次充氣，每次充氣時間2.5 min。胚胎培養(yǎng)48 h后，選擇仍有心跳及血液循環(huán)的胚胎，測定其卵黃囊直徑(yolk sac diameter，YSD)、頂 臀 長(crown-rump length，CRL)、頭長(head length，HL)、體節(jié)數(shù)等生長發(fā)育指標(biāo)，根據(jù)Brown"s評分法對胚胎卵黃囊、尿囊、體屈、心、腦、視聽嗅系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等器官的形態(tài)學(xué)發(fā)育情況進(jìn)行評分(total morphological score，TMS)并記錄特定畸形。計算50%的胚胎出現(xiàn)畸形的濃度(IC)、對總體形態(tài)學(xué)評分未見異常效應(yīng)的最高濃度(IC)、最大比率出現(xiàn)畸形的最低濃度(IC)。

1.3.2 BALB/c 3T3細(xì)胞增殖活性檢測

取細(xì)胞濃度為5×10個/mL的BALB/c 3T3細(xì)胞懸液，以100μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)2 h待細(xì)胞貼壁后加入硝酸鈰染毒液(0.00、0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mmol/L)。第3天更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第6天用MTT法檢測BALB/c 3T3細(xì)胞增殖活性，并計算50%的BALB/c 3T3細(xì)胞生長受抑制的受試物濃度(IC)。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，試驗平行重復(fù)3次。

1.3.3 發(fā)育毒性預(yù)測

利用ECVAM全胚胎培養(yǎng)預(yù)測模型(prediction model，PM)PM1和PM2對胚胎發(fā)育毒性進(jìn)行評價。PM1判別式如下：

判別式I 18.08×lg(IC)-11.56×lg(IC)-10.19

判別式II 21.55×lg(IC)-15.31×lg(IC)-10.65

判別式III 8.70×lg(IC)-8.53×lg(IC)-2.53

PM2判別式如下：

判別式I 0.21×[(IC-IC)/IC]×100＋15.37×log(IC)-23.58

判別式II 0.27×[(IC-IC)/IC]×100＋17.71×log(IC)-32.37

判別式III 0.093×[(IC-IC)/IC]×100＋4.21×log(IC)-4.23

若判別式I的值高于判別式II和判別式III，判定化合物為無胚胎發(fā)育毒性；若判別式II的值高于判別式I和判別式III，判定化合物為弱胚胎發(fā)育毒性；若判別式III的值高于判別式I和判別式II，判定化合物為強(qiáng)胚胎發(fā)育毒性。

1.4 微團(tuán)培養(yǎng)試驗

1.4.1 微團(tuán)培養(yǎng)

取1只孕13 d(GD13)孕鼠，無菌條件下取出子宮，剝離胚胎，撕脫蛻膜和Reichert"s膜，選擇體節(jié)數(shù)為40～45的胚胎分離肢芽。將肢芽用PBS清洗3遍后加入0.25%胰蛋白酶消化10 min。加入Ham"s F-12完全培養(yǎng)液終止消化并清洗3次后，重懸吹打至單細(xì)胞懸液，200目細(xì)胞篩過濾后計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整肢芽細(xì)胞濃度為2×10個/mL，以5μL/孔點種于96孔培養(yǎng)板每孔中央，培養(yǎng)箱中孵育2～3 h，待細(xì)胞貼壁后每孔加入200μL含相應(yīng)濃度硝酸鈰的完全培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d。將該模型適用的最高檢測濃度1 000μg/mL(相當(dāng)于硝酸鈰3.00 mmol/L)作為本研究受試物的最高濃度，并按照一定的梯度進(jìn)行稀釋。硝酸鈰終濃度為0.00、0.03、0.06、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00 mmol/L。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，試驗平行重復(fù)3次。

1.4.2 微團(tuán)細(xì)胞增殖分化檢測

細(xì)胞培養(yǎng)第5天，棄培養(yǎng)液加入200μL 0.005%中性紅染液，37℃孵育3 h。棄中性紅，生理鹽水清洗3次后加入甲醛鈣200 μL，1 min后去除甲醛鈣，加入200μL酸性乙醇搖床提取60 min，于酶標(biāo)儀540 nm進(jìn)行比色測量吸光度值。計算50%細(xì)胞增殖活性被抑制時的濃度(IC)。

微團(tuán)細(xì)胞用生理鹽水清洗3次，洗去96孔板內(nèi)的中性紅，加入200μL 1%阿利新藍(lán)染色液常溫過夜。去阿利新藍(lán)液，生理鹽水清洗3次后，計數(shù)微團(tuán)數(shù)量，6 mol/L的鹽酸胍提取2 h后于酶標(biāo)儀620 nm進(jìn)行比色測量吸光度值。計算50%細(xì)胞分化及集落形成受抑制時的濃度(ID)。

1.4.3 胚胎毒性預(yù)測

ECVAM微團(tuán)培養(yǎng)試驗的胚胎毒性預(yù)測模型包括3個判別式，判別標(biāo)準(zhǔn)同1.3.3。

判別式I 6.65×lg(ID)-9.49

判別式II 6.16×lg(ID)-8.29

判別式III 1.31×lg(ID)-1.42

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)方差齊性時，用單因素方差分析(one way ANOVA)并用LSD及Dunnett-

t

法進(jìn)行兩兩比較。若方差不齊，用Dunnett"s

C

和Games-Howell進(jìn)行多重比較。用Linearby-Linear Association法進(jìn)行劑量相關(guān)趨勢性檢驗。雙側(cè)檢驗以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。IC及ID用GraphPad Prism 7擬合計算。

2 結(jié)果

2.1 利用全胚胎培養(yǎng)模型評價硝酸鈰的發(fā)育毒性

2.1.1 硝酸鈰對胚胎生長的影響

0.75 mmol/L及以上濃度硝酸鈰染毒組的胚胎卵黃囊直徑、頂臀長均較對照組明顯減小，1 mmol/L硝酸鈰染毒顯著減少胚胎頭長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05，圖1)。提示較高濃度硝酸鈰可導(dǎo)致大鼠胚胎生長遲緩。

圖1 硝酸鈰對胚胎生長的影響

在體視顯微鏡下觀察，可見對照組胚胎卵黃囊血管豐富、形態(tài)清晰，胚胎形態(tài)發(fā)育正常；0.75 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎卵黃囊直徑相對較小，卵黃囊表面血管稍欠充盈，頭長與頂臀長減?。?.00 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎卵黃囊直徑進(jìn)一步減小，頭長與頂臀長明顯減小，部分胚胎體屈不足、背中線不規(guī)則，抑制了胚胎的生長(圖2)。

圖2 硝酸鈰對胚胎形態(tài)發(fā)育的影響

2.1.2 硝酸鈰對胚胎發(fā)育的影響

0.00、0.50、0.75、1.00 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎總體形態(tài)學(xué)評分(圖3)分別為50.82、49.83、47.38和46.50。其中0.75 mmol/L及以上硝酸鈰染毒組的胚胎總體形態(tài)學(xué)評分和體節(jié)數(shù)均較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)，提示較高濃度硝酸鈰可導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩。

根據(jù)Brown"s評分法對胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)評分，結(jié)果如表1所示。0.75 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎出現(xiàn)了后腦和后肢芽發(fā)育畸形，主要表現(xiàn)為前神經(jīng)孔未閉合、后肢芽缺失。1.00 mmol/L硝酸鈰染毒組胚胎卵黃囊血管、中腦和后肢芽均出現(xiàn)發(fā)育畸形，提示較高濃度的硝酸鈰可能對大鼠胚胎的血管發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

圖3 硝酸鈰對胚胎總體形態(tài)學(xué)評分和體節(jié)數(shù)的影響

表1 硝酸鈰對大鼠胚胎各器官系統(tǒng)形態(tài)學(xué)評分的影響(±s)

2.1.3 全胚胎培養(yǎng)模型對硝酸鈰發(fā)育毒性的評價

經(jīng)BALB/c 3T3細(xì)胞增殖活性檢測實驗測得硝酸鈰對BALB/c 3T3細(xì)胞的IC為1.52 mmol/L(495.52 μg/mL)。同時經(jīng)GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行對數(shù)曲線擬合，計算出全胚胎培養(yǎng)模型中硝酸鈰的IC為0.72 mmol/L(235.70μg/mL)，IC為0.50 mmol/L(163.06μg/mL)，IC為1.00 mmol/L(326.12μg/mL)。將評價指標(biāo)代入ECVAM全胚胎培養(yǎng)預(yù)測模型1(PM1)，判別式I的值大于判別式II和判別式III，評價硝酸鈰為無胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物；代入ECVAM全胚胎培養(yǎng)預(yù)測模型2(PM2)，判別式II的值大于判別式I和判別式III(表2)，評價硝酸鈰為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。

2.2 利用微團(tuán)培養(yǎng)模型評價硝酸鈰的發(fā)育毒性

2.2.1 硝酸鈰對肢芽細(xì)胞增殖和分化的影響

在同期實驗中以5-氟尿嘧啶作為陽性對照對微團(tuán)培養(yǎng)模型進(jìn)行驗證，經(jīng)判定5-氟尿嘧啶為強(qiáng)發(fā)育毒性物質(zhì)，符合模型建立標(biāo)準(zhǔn)，證實微團(tuán)培養(yǎng)模型建立成功。在本研究中0.50 mmol/L及以上濃度的硝酸鈰可顯著降低大鼠肢芽細(xì)胞增殖能力，0.25 mmol/L硝酸鈰可降低肢芽細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的能力，1.00 mmol/L及以上濃度的硝酸鈰可抑制微團(tuán)形成數(shù)目(圖4)。

表2 全胚胎培養(yǎng)模型硝酸鈰的判別公式計算結(jié)果

與對照組相比，1.00 mmol/L硝酸鈰組大鼠胚胎肢芽微團(tuán)形成數(shù)目明顯降低，隨硝酸鈰劑量升高，大鼠胚胎肢芽微團(tuán)數(shù)目逐漸減少，單個微團(tuán)體積逐漸變小，軟骨細(xì)胞阿利新藍(lán)著色度逐漸降低，至2.00 mmol/L組已無微團(tuán)形成(圖5)。

圖4 硝酸鈰對肢芽細(xì)胞增殖和分化的影響

圖5 硝酸鈰對肢芽微團(tuán)分化的影響

2.2.2 微團(tuán)培養(yǎng)模型對硝酸鈰發(fā)育毒性的評價

經(jīng)計算硝酸鈰對肢芽細(xì)胞增殖的IC為1.23 mmol/L(400.65μg/mL)。硝酸鈰對肢芽細(xì)胞分化的ID為0.76 mmol/L(247.76μg/mL)，代入微團(tuán)培養(yǎng)模型的發(fā)育毒性預(yù)測判別式，評價硝酸鈰為弱發(fā)育毒性化學(xué)物。

3 討論

近30年來全球?qū)ο⊥恋男枨罅恳悦磕?.7%～8.6%的速度增加。鈰在眾稀土元素中豐度最高，在地殼中的含量約0.004 6%，由于其特殊的理化性質(zhì)和良好的生物活性，鈰在很多領(lǐng)域大量應(yīng)用。鈰元素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致在人群中長期暴露蓄積，且鈰能通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，毒性作用不僅影響母體本身，還影響其后代。因此鈰元素對于人體健康的影響尤其對胚胎的發(fā)育毒性需要引起特別重視。但目前關(guān)于鈰元素發(fā)育毒性的研究報道還不夠全面，主要存在以下幾點不足：①稀土元素發(fā)育毒性資料集中于早期，而早期評價方法技術(shù)有限、規(guī)范性不夠；②目前的研究多集中于混合稀土元素的毒性研究，缺乏對單一稀土元素鈰的深入探索；③在重視實驗動物福利及3R原則的時代背景下，應(yīng)進(jìn)一步通過毒理學(xué)替代方法，綜合體內(nèi)實驗和體外實驗對鈰元素進(jìn)行全面生殖發(fā)育毒性評價。

本研究參考ECVAM植入后全胚胎培養(yǎng)模型和微團(tuán)培養(yǎng)模型，評價硝酸鈰的胚胎發(fā)育毒性。全胚胎培養(yǎng)試驗是以體外胚胎替代整體動物，模擬胚胎發(fā)育早期(GD9.5～GD11.5)對受試物的暴露過程，主要用于研究化學(xué)物質(zhì)對器官的早期生長發(fā)育影響和胚胎毒性。微團(tuán)培養(yǎng)試驗是通過經(jīng)受試物暴露的胚胎肢芽原代細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，對肢芽細(xì)胞增殖能力及向軟骨細(xì)胞分化能力進(jìn)行評價，進(jìn)而預(yù)測胚胎發(fā)育中、晚期(GD13～GD18)潛在發(fā)育毒性。ECVAM的驗證結(jié)果顯示，全胚胎培養(yǎng)模型PM1和PM2對化學(xué)物發(fā)育毒性預(yù)測的總體準(zhǔn)確性分別為68%和80%，微團(tuán)培養(yǎng)模型預(yù)測的總體準(zhǔn)確性為70%。

本研究中，全胚胎培養(yǎng)模型預(yù)測模型PM1判定硝酸鈰為無胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物，PM2判定硝酸鈰為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。根據(jù)ECVAM的驗證結(jié)果，PM1只考慮分化和發(fā)育的參數(shù)，而PM2納入了3T3細(xì)胞毒性測試的數(shù)據(jù)以評價化學(xué)物母體毒性，PM2對于無、弱、強(qiáng)胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物的準(zhǔn)確性分別為70%、76%、100%，均高于PM1(56%、75%、79%)，對于化學(xué)物發(fā)育毒性的預(yù)測結(jié)果更為全面準(zhǔn)確。因此本研究全胚胎培養(yǎng)模型可判定硝酸鈰為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。根據(jù)微團(tuán)培養(yǎng)的預(yù)測模型判別式，判定硝酸鈰為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物，經(jīng)ECVAM驗證微團(tuán)試驗對弱胚胎毒性化學(xué)物的預(yù)測符合率為71%。綜合全胚胎培養(yǎng)模型和微團(tuán)培養(yǎng)模型的判定結(jié)果，可認(rèn)為硝酸鈰具有潛在的胚胎發(fā)育毒性，為弱發(fā)育毒性化學(xué)物。

本次實驗中發(fā)現(xiàn)硝酸鈰對大鼠胚胎生長發(fā)育產(chǎn)生影響，全胚胎培養(yǎng)模型中，0.75 mmol/L以上濃度的硝酸鈰染毒導(dǎo)致胚胎卵黃囊直徑、頂臀長、頭長均明顯減小，具有明顯的生長遲滯效應(yīng)，表明了高濃度硝酸鈰可導(dǎo)致胚胎生長遲緩。近幾年流行病學(xué)調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)稀土元素鈰與新生兒出生結(jié)局相關(guān)。黃敏在隊列研究中發(fā)現(xiàn)孕婦孕晚期尿中稀土元素鈰的濃度與新生兒出生體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，與新生兒發(fā)生小于胎齡兒的風(fēng)險呈正相關(guān)。同時在一項前瞻性出生隊列研究中，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前鈰的暴露與新生兒促甲狀腺激素水平呈負(fù)相關(guān)。在動物實驗中也報道了ICR小鼠孕16、17 d尾靜脈染毒納米和微米氧化鈰(30 mg/kg)會影響胎鼠生長發(fā)育，導(dǎo)致胎鼠體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量下降。同時，本研究中發(fā)現(xiàn)1.00 mmol/L硝酸鈰染毒可顯著影響胚胎卵黃囊血管的發(fā)育。臟層卵黃囊是胚胎早期造血循環(huán)、營養(yǎng)獲得的重要器官，在絨毛膜尿囊胎盤形成前，胚胎卵黃囊血管形成于卵黃囊間充質(zhì)層，是母體營養(yǎng)物質(zhì)流向胎兒循環(huán)的直接途徑。本實驗中硝酸鈰對胚胎卵黃囊血管的發(fā)育抑制可能是造成大鼠胚胎生長遲緩的原因之一，其具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

在本次全胚胎培養(yǎng)模型中，對胚胎各器官系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評分發(fā)現(xiàn)，0.75 mmol/L硝酸鈰染毒可導(dǎo)致胚胎后腦發(fā)育畸形，1.00 mmol/L染毒組則出現(xiàn)中腦發(fā)育畸形。腦的發(fā)育起源分為前腦、中腦、后腦三個區(qū)域，中腦在腦干的最前方，和視覺、聽覺、運動及溫度調(diào)控等有關(guān)。后腦由腦橋、延髓，以及小腦組成，且神經(jīng)管發(fā)育是從后腦開始閉合。提示硝酸鈰對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有一定影響。Wei等的病例對照研究中發(fā)現(xiàn)孕婦血清中鈰的濃度與胎兒神經(jīng)管畸形風(fēng)險增加呈正相關(guān)。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)SD大鼠在孕第7～16天灌胃硝酸鑭(60 mg/kg)，顯著降低了仔鼠握力及后肢力量，影響Morris水迷宮測試中的記憶和空間學(xué)習(xí)能力，同時增加了熱板實驗中的疼痛反應(yīng)潛伏期。體外實驗也證實氧化鈰納米顆?？梢砸种迫嗽瓷窠?jīng)干細(xì)胞(hNPC)和鼠源神經(jīng)干細(xì)胞(C17.2)的分化，顯著性減少神經(jīng)元特異性β3-微管蛋白表達(dá)，改變神經(jīng)元生長錐結(jié)構(gòu)。結(jié)合本次實驗鈰對中腦和后腦的毒性作用表明高劑量的稀土元素對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。

此外稀土元素對胚胎骨骼系統(tǒng)發(fā)育也存在影響。早期研究發(fā)現(xiàn)，混合稀土于大鼠妊娠第6～15天染毒，導(dǎo)致高劑量組(1 428 mg/kg)胎鼠上枕骨、胸骨、前后爪骨發(fā)育級別明顯降低，顱骨后囟和矢狀縫寬度顯著增寬。人群研究也發(fā)現(xiàn)礦區(qū)居民稀土元素暴露積累，由于競爭性結(jié)合導(dǎo)致鐵和鈣含量降低，導(dǎo)致骨骼代謝紊亂，骨密度降低。對于單一稀土元素鈰的研究報道發(fā)現(xiàn)，鈰對骨骼系統(tǒng)發(fā)育具有雙向作用，即低劑量鈰促進(jìn)骨骼生長發(fā)育，高劑量鈰抑制成骨細(xì)胞分化礦化。動物實驗中發(fā)現(xiàn)雄性昆明小鼠60 d硝酸亞鈰(60 mg/kg)染毒造成胎仔骨骼畸形率上升。本研究微團(tuán)培養(yǎng)模型中，0.50 mmol/L濃度硝酸鈰抑制大鼠肢芽細(xì)胞增殖，0.25 mmol/L硝酸鈰可顯著降低肢芽細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞的能力，硝酸鈰可能導(dǎo)致大鼠胚胎肢芽細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞過程受阻。同時在全胚胎培養(yǎng)模型中0.75 mmol/L硝酸鈰染毒組出現(xiàn)了后肢芽發(fā)育畸形。肢芽是四肢發(fā)生初期階段身體兩側(cè)的芽狀突起，其內(nèi)部中胚層可分化為軟骨、骨骼、肌肉等。結(jié)合兩個模型中硝酸鈰對胚胎肢芽分化的抑制效應(yīng)，提示高濃度鈰可抑制胚胎的骨骼系統(tǒng)發(fā)育。

在本研究組同期試驗研究中發(fā)現(xiàn)，全胚胎培養(yǎng)模型硝酸鑭對胚胎生長的無可見有害作用水平(no-observed-adverse-effect level，NOAEL)為0.12 mmol/L，經(jīng)預(yù)測模型評價為弱胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。在微團(tuán)培養(yǎng)模型硝酸鑭對肢芽細(xì)胞增殖活性的NOAEL為1.00 mmol/L，對肢芽細(xì)胞分化能力的NOAEL為0.25 mmol/L，被評價為無胚胎發(fā)育毒性化學(xué)物。而在本次實驗中，硝酸鈰對胚胎生長的NOAEL為0.50 mmol/L，對肢芽細(xì)胞增殖活性及肢芽細(xì)胞分化能力的NOAEL分別為0.25 mmol/L、0.12 mmol/L。上述結(jié)果表明，在全胚胎培養(yǎng)模型中硝酸鈰的毒性弱于硝酸鑭，在微團(tuán)培養(yǎng)模型中硝酸鈰表現(xiàn)出更強(qiáng)抑制作用，提示胚胎發(fā)育早期，胚胎對硝酸鑭更敏感，而發(fā)育中、晚期的胚胎對硝酸鈰易感。Oral等在稀土元素對海洋生物發(fā)育毒性的研究中也發(fā)現(xiàn)，鈰與鑭相比較，對海膽的胚胎毒性、遺傳毒性更敏感。由此，不同稀土元素發(fā)育毒性的差異及健康效應(yīng)仍需進(jìn)行全面評價。

本研究采用全胚胎培養(yǎng)模型與微團(tuán)培養(yǎng)模型模擬胚胎發(fā)育過程，初步認(rèn)為硝酸鈰在胚胎發(fā)育早期及中、晚期均具有潛在的胚胎發(fā)育毒性，對大鼠胚胎的生長、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響，經(jīng)判定為弱發(fā)育毒性化學(xué)物。盡管胚胎毒性體外替代試驗已在毒物篩查和機(jī)制研究中廣泛應(yīng)用，但仍存在一定局限性，體外細(xì)胞、組織、器官以及胚胎的代謝能力有限，體內(nèi)外毒代動力學(xué)參數(shù)不完全一致，不能完全代表哺乳動物發(fā)育全過程。另外胚胎毒性體外替代試驗?zāi)壳皟H用于受試物是否具有胚胎發(fā)育毒性的判斷，尚未和實際暴露劑量進(jìn)行聯(lián)系。因此對硝酸稀土的發(fā)育毒性及其接觸風(fēng)險還需要結(jié)合體內(nèi)實驗進(jìn)一步確證。