劉 霞,李照珍,公亞婷,姚佳彤,公衍玲

(青島科技大學 化工學院,山東 青島266042)

薔薇科植物山楂(Cr ataegus pinnatifidaBge.),又叫山里紅,是一種廣泛分布于我國北部地區(qū)且歷史悠久的植物。早在公元前7世紀就開始食用其鮮果,后逐漸發(fā)現(xiàn)其藥用價值,本草綱目記載,山楂干果最早被用于治療胸痛、疝氣、消化不良、產(chǎn)后血瘀和便血等[1]?，F(xiàn)代研究表明,山楂對心血管、消化和內(nèi)分泌系統(tǒng)、致病微生物以及腫瘤和免疫系統(tǒng)等均有作用[2],特別是近年來,山楂在抗糖尿病和肥胖、降脂和減輕動脈硬化等方面的活性,使其在代謝綜合征的治療中具有良好的應(yīng)用前景[3]。山楂的果實、葉和籽或核均可作為藥用部位,其中的活性成分是發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。迄今為止,從山楂植物中共鑒定出超過150種化學成分,包括黃酮類、三萜類、甾體類、木脂素、有機酸和含氮化合物[2,4]。其中,黃酮類成分與山楂的多種藥理活性密切相關(guān)[5-7]。

作為藥食同源的植物,山楂在保健食品和化妝品中的應(yīng)用也在不斷開發(fā)中。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn),山楂核提取物具有抑制酪氨酸酶的活性,提示其可應(yīng)用于美白化妝品中。目前關(guān)于山楂藥用部位的成分與活性的系統(tǒng)研究較少,因此,本研究擬制備山楂不同藥用部位提取物,檢測其體外美白與抗氧化活性,以期為山楂的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

山楂果,購自山東省平邑縣金蘭專業(yè)種植合作社,經(jīng)鑒定為薔薇科植物山楂(Cr ataegus pinnatifidaBge.)的干燥果實;山楂葉,購自廣西玉林國安中藥材批發(fā)行,經(jīng)鑒定為薔薇科植物山楂(Cr ataegus pinnatifidaBge.)的干燥葉;山楂核,由山東省蒙陰縣罐頭廠提供,經(jīng)鑒定為薔薇科植物山楂(Cr ataegus pinnatifidaBge.)的果核。L-多巴、酪氨酸酶,美國Sig ma公司產(chǎn)品;其他試劑均為市售分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,RE-52型,上海亞榮生化儀器廠;真空干燥箱,DZF-6020型,山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司;紫外可見分光光度計,UV-1801型,北京瑞利分析儀器有限公司;酶標儀,Spectra Max M2型,上海美谷分子儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂不同部位提取物的制備

1.2.1.1 山楂果、葉、核水提取物的制備

取一定量的山楂果、葉、核,粉碎,加入10倍量水進行煎煮2次,每次分別為1.5和1 h,過濾后2次濾液合并,濃縮至稠膏,真空干燥,備用。

1.2.1.2 山楂果、葉、核醇提取物的制備

取一定量的山楂果、葉、核,粉碎,加入10倍量70%乙醇進行回流提取2次,每次分別為1.5和1 h,過濾后2次濾液合并,回收乙醇至無醇味,濃縮至稠膏,真空干燥,備用。

1.2.2 總黃酮含量測定

根據(jù)文獻[8]方法,采用顯色法測定提取物中總黃酮含量。以蘆丁標準品為對照品,測定510 n m處的吸光度,根據(jù)吸光度與濃度的相關(guān)關(guān)系繪制標準曲線和回歸方程。同法測定提取物溶液的吸光度,按回歸方程得出提取物中總黃酮濃度,計算總黃酮得率。

1.2.3 活性測定用提取物溶液的制備

分別稱取上述山楂果、山楂葉和山楂核的水提取物或醇提取物,溶于蒸餾水中,制備成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·mL－1的溶液,以備活性檢測用。

1.2.4 酪氨酸酶抑制率的測定

參考文獻[9]方法,取48孔酶標板,每孔加PBS緩沖液或山楂不同部位提取物溶液,再加入1 000U·mL－1的酪氨酸酶溶液30μL,37℃孵育10 min,加入0.15%L-多巴溶液500μL,37℃孵育5 min,反應(yīng)完成后立即用酶標儀在490 n m測定吸光度,每次試驗重復3次,取平均值。計算酪氨酸酶抑制率。

1.2.5 超氧陰離子自由基清除率的測定

根據(jù)文獻[10]方法,采用鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子自由基的清除率。在一定條件下,鄰苯三酚能夠自氧化產(chǎn)生·O－2加入一定量的山楂不同部位提取物溶液可對·O－2產(chǎn)生不同發(fā)抑制作用,進而導致光吸收值的變化。取0.05 mmol·L－1Tris-HCl緩沖液(p H 8.2)5 mL于試管中,分別加入1 mL山楂不同部位提取物溶液,置于25℃水浴20 min,再加3 mmol·L－1鄰苯三酚溶液0.4 mL,空白對照組以相同體積的Tris-HCl緩沖液代替樣品,搖勻,置于25℃水浴反應(yīng)4 min。立即用10 mmol·L－1HCl溶液0.5 mL終止反應(yīng)。在320 n m測定吸光度。每次試驗重復3次,取平均值。

1.2.6 羥自由基清除率的測定

根據(jù)文獻[11]方法,取48孔酶標板,于板孔中加入50μL樣液(山楂不同部位提取物溶液),再分別加入50μL 5 mmol·L－1FeSO4溶液、50μL 5 mmol·L－1水楊酸溶液,混勻后靜置10 min,再加入50μL 5 mmol·L－1H2O2溶液,混勻,靜置30 min,在波長510 nm處測定其吸光度(A i),并測定用蒸餾水代替H2O2時的吸光度(A j),空白對照組(以蒸餾水代替待測液)的吸光度(A c)。計算羥自由基清除率。每次試驗重復3次,取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 山楂不同部位提取物總黃酮含量的比較

山楂不同部位提取物的總黃酮含量見圖1。由圖1可以看出,山楂不同部位提取物中,醇提物的總黃酮含量均高于相應(yīng)的水提物。其中,山楂葉醇提取物中總黃酮含量最高可達64.7%,山楂果醇提取物次之,而山楂核的水提物含量則低至20.3%。結(jié)果表明:山楂葉是山楂總黃酮的重要來源,且醇提取法相較水提取法能更好地將總黃酮提取出來。目前的研究已從山楂中分離鑒定出60多種黃酮類化合物,其主要苷元包括芹菜素、牡荊素、木犀草素、山奈酚類、槲皮素類和二氫黃酮類等[12-14]。以水為溶液進行提取,主要是一些極性較大的苷類,而山楂黃酮類化合物含有豐富的苷元,一定濃度的乙醇溶液更適宜山楂中黃酮類成分的溶出。因此,在實際應(yīng)用時可根據(jù)需要選擇適宜濃度的乙醇作為溶劑提取山楂不同部位的總黃酮,以更大程度地提取山楂中的總黃酮。

2.2 山楂不同部位提取物對酪氨酸酶抑制率的比較

山楂不同部位提取物對酪氨酸酶的抑制作用見圖2。由圖2可以看出,山楂不同部位提取物對酪氨酸酶均有一定的抑制作用,水提取物的作用明顯優(yōu)于醇提取物。其中,山楂葉和山楂果的水提取物對酪氨酸酶的抑制作用較強,且隨著劑量增加,抑制率顯著提高,至0.5 g·mL－1時,其抑制率分別為70.8%和62.3%。其次是山楂葉醇提取物,山楂核醇提取物的作用最弱低至22.4%。有研究發(fā)現(xiàn),山楂蜂花粉具有一定的酪氨酸酶抑制活性[15],但山楂提取物抑制酪氨酸酶的作用鮮有報道。本工作研究了山楂不同部位提取物對酪氨酸酶的抑制活性,結(jié)合其中總黃酮含量的差別,初步推測,山楂提取物對酪氨酸酶的抑制作用除與黃酮含量有關(guān)外,還可能與其中的水溶性成分如多酚、有機酸等有關(guān)。在美白化妝品的制備中,可考慮添加山楂葉或山楂果的水提取物,以增加其美白效果。

圖2 山楂不同提取物對酪氨酸酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of different extracts of Cr ataegus pinnatifida on tyr osinase

2.3 山楂不同部位提取物對超氧陰離子自由基清除率的比較

山楂不同部位提取物對超氧陰離子自由基的清除作用見圖3。由圖3可以看出,山楂不同部位提取物均可清除超氧陰離子自由基。其中,山楂葉提取物作用最強,其水提取物和醇提取物的抑制率分別為70.2%、67.3%;而山楂果和山楂核,則是醇提取物略高于水提取物,其中,山楂果醇提取物和山楂果水提取物對超氧陰離子自由基的清除率分別為47.3%和30.6%;而對超氧陰離子自由基的清除率分別為45.5%和35.2%。體內(nèi)累積過多的超氧陰離子自由基與很多慢性疾病包括心血管、新陳代謝、消化、內(nèi)分泌、呼吸等以及人體衰老和癌癥發(fā)生等有關(guān)[16]。以上結(jié)果提示,山楂是良好的超氧陰離子自由基清除劑,可用于制備美白抗衰老化妝品。山楂葉作用最強,提示這一清除作用可能與其總黃酮含量有關(guān)[17-18]。

圖3 山楂不同提取物對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of different extracts of Cr ataegus pinnatifida on superoxide anion free radicals

2.4 山楂不同部位提取物對羥自由基清除率的比較

山楂不同部位提取物清除羥自由基的作用見圖4。由圖4可以看出,山楂不同部位提取物均中清除羥自由基。其中,山楂葉提取物作用最強,其水提取物和醇提取物作用無明顯差異;在0.5 g·mL－1時其清除率分別為78.3%和89.1%;山楂果和山楂核的清除作用相對較弱,其醇提取物均略高于水提取物,山楂果醇提取物和山楂果水提取物的清除率分別為41.8%和27.9%,而山楂核醇提取物和山楂核水提取物則分別為37.5%、18.4%。羥自由基是目前已知的自由基中,進攻性最強、危害最大的一種,可破壞DNA結(jié)構(gòu),導致DNA出現(xiàn)永久性損傷,從而誘發(fā)衰老和多種疾病[19]。本研究結(jié)果提示,山楂是良好的羥自由基清除劑,可用于制備美白抗衰老化妝品。山楂葉作用最強,可能與其總黃酮含量有關(guān)[17]。

圖4 山楂不同提取物對羥自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of different extracts of Cr ataegus pinnatifida on hydr oxyl radical

3 結(jié) 論

比較了山楂不同部位提取物中總黃酮含量,檢測了其體外美白和抗氧化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),山楂醇提取物總黃酮含量普遍高于水提取物,以山楂葉為最高可達64.7%。各提取物均有不同程度的酪氨酸酶抑制、超氧陰離子自由基和羥自由基清除作用。其中,山楂葉和山楂果的水提取物抑制酪氨酸酶的作用較強,在0.5 g·mL－1可分別為70.8%、62.3%。而這兩種提取物的總黃酮的含量并非最高,可初步推測,山楂水提取物對酪氨酸酶的抑制作用除與黃酮含量有關(guān)外,還可能與其中的水溶性成分如酚、有機酸等有關(guān)。山楂葉水提取物和醇提取物對自由基的清除能力最強,在0.5 g·mL－1時,山楂葉水提取物和山楂葉醇提取物對超氧陰離子自由基基的清除率分別為70.2%和67.3%,而對羥自由基的清除率分別為78.3%和89.1%。提示山楂葉提取物作為抗氧化劑具有良好的開發(fā)前景。本研究為山楂提取物應(yīng)用于美白抗衰老化妝品提供參考,在實際應(yīng)用時可根據(jù)需要選擇山楂不同部位與方法進行提取。關(guān)于山楂提取物的活性和成分的關(guān)系,有待對提取物進一步精制分離并進行成分分析和活性篩選,為其開發(fā)利用提供更有價值的參考。