王希桐,楊慶昊,王宇航,張霞玲,吳 涵,王孟琦,周貴忠

(青島科技大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院,山東 青島266042)

現(xiàn)如今,隨著人口的增長和經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,人們的需水量急劇上升,加之現(xiàn)代工業(yè)逐步發(fā)展,水資源短缺和水污染也變成了世界性難題。造紙、紡織、畜牧等行業(yè)會(huì)產(chǎn)生高鹽度且含有大量纖維素的工業(yè)廢水[1]。這些廢水含有大量無機(jī)鹽和有機(jī)物,具有色度高、可生化性差的特點(diǎn)[2-3]。纖維素作為一種天然高分子有機(jī)物,大量存在于水體中會(huì)造成水體富營養(yǎng)化,引起水生植物劇烈生長,溶解氧降低,進(jìn)而水體呈厭氧狀態(tài)散發(fā)惡臭。因此,尋找一種高效處理含纖維素的高鹽度工業(yè)廢水的方法意義重大[4]。

目前,針對此類廢水一般采用混凝法、電化學(xué)方法、鹽析法、萃取法、吸附法、吹脫和汽提法、微波誘導(dǎo)催化法等,但是混凝法、電化學(xué)方法、鹽析法沉淀后形成的淤泥不易妥善處理,萃取法、吸附法消耗大量化學(xué)藥劑,吹脫和汽提法耗能嚴(yán)重,微波誘導(dǎo)催化法還需進(jìn)行后續(xù)生化處理,所以難以在實(shí)際生產(chǎn)中運(yùn)用[3-6]。生物處理是目前處理此類廢水最常用的方法,它具有應(yīng)用范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn),效果較好[6]。許多研究表明,采用生物法處理廢水的關(guān)鍵是要馴化出耐受某特定環(huán)境的微生物,以實(shí)現(xiàn)對有機(jī)物的良好降解[7-9]。

對于纖維素的降解主要依靠于纖維素酶,纖維素酶是降解纖維素的一組酶的總稱,作用于纖維素以及纖維素衍生物,將纖維素分解成寡糖或單糖。在自然界中存在大量細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物扮演者“分解者”的角色,一部分具有降解纖維素的能力,而且少數(shù)植物和昆蟲也能產(chǎn)生纖維素酶,所以纖維素酶的來源和分布范圍很廣泛[10]。

海洋被譽(yù)為“微生物寶庫”,有著豐富的生物資源。海洋微生物經(jīng)過數(shù)億年的轉(zhuǎn)化已經(jīng)完全適應(yīng)了天然高鹽環(huán)境,從海洋樣品中篩選出的菌株耐鹽度即為當(dāng)?shù)睾Ｋ}度。海草本身含有纖維素,從新鮮海草表面和腐爛的海草中大概率存有能降解纖維素的菌株。從海水、海草、海泥中取樣,進(jìn)一步馴化與篩選,便可得到耐鹽型產(chǎn)纖維素酶菌株。因此,本研究對從青島棧橋景區(qū)取得的海洋樣品中的微生物進(jìn)行馴化研究,以期篩選出高效降解纖維素的耐鹽性菌株并應(yīng)用于含纖維素高鹽度廢水的處理中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)海沙與海泥:在潮水褪去以后,為了避免污染,在盡可能遠(yuǎn)離海岸的地方取樣。用鐵鏟除去頂部10 c m左右的海沙與海泥的混合物,樣品放置于滅菌的自封袋內(nèi),標(biāo)明采樣的時(shí)間和地點(diǎn)[11]。

2)海草:從海邊巖石上取各類海草、海藻、青苔封裝于滅菌自封袋內(nèi),標(biāo)明采樣時(shí)間地點(diǎn)。

3)海水:取遠(yuǎn)離海岸的海平面10 c m以下的清澈海水,用干凈的塑料桶盛裝,封口后貼標(biāo)簽,標(biāo)明采樣的時(shí)間和地點(diǎn)。經(jīng)測定,海水鹽度約為3%。

1.2 主要試劑

葡萄糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、可溶性淀粉、瓊脂、(NH4)2SO4、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7 H2O、FeSO4·7 H2O、K2Cr2O7、HgSO4、DNS試劑、0.1%剛果紅染液、1%孟加拉紅溶液、磷酸緩沖溶液(p H＝6)。

1.3 模擬廢水

向海水樣品中按每1 L海水加入1 g葡萄糖,0.11 g(NH4)2SO4,0.045 3 g KH2PO4。隨著培養(yǎng)的不斷進(jìn)行,逐漸用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)代替葡萄糖,以C源占比10%的比例逐漸上升,直至100%。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 富集培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:牛肉膏(5 g·L－1),蛋白胨(10 g·L－1),p H為7～7.2,使用海水定容。

馬丁氏培養(yǎng)基:葡萄糖(10 g·L－1),蛋白胨(5 g·L－1),KH2PO4(1 g·L－1),MgSO4·7 H2O(0.5 g·L－1),1%孟加拉紅(3.3 mL·L－1),使用海水定容。

高氏培養(yǎng)基:可溶性淀粉(20 g·L－1),KNO3(1 g·L－1),K2HPO4(0.5 g·L－1),MgSO4·7 H2O(0.5 g·L－1),FeSO4·7 H2O(0.01 g·L－1),p H為7.4～7.6。

1.4.2 鑒別培養(yǎng)基

CMC固體培養(yǎng)基:CMC-Na(10 g·L－1),Mg-SO4·7 H2O(0.5 g·L－1),KH2PO4(1 g·L－1),Na2HPO4(1 g·L－1),酵母膏(5 g·L－1),蛋白胨(10 g·L－1),瓊脂(20 g·L－1),p H為7.2～7.4,海水定容。

1.4.3 深層發(fā)酵培養(yǎng)基

CMC-Na(10 g·L－1),MgSO4·7 H2O(0.5 g·L－1),KH2PO4(1 g·L－1),Na2HPO4(1 g·L－1),酵母膏(5 g·L－1),蛋白胨(10 g·L－1),p H為7.2～7.4,海水定容,高壓蒸汽滅菌(20 min,121℃)。錐形瓶接種菌株,在30℃恒溫、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min－1的條件下培養(yǎng)2 d。

1.5 菌群馴化

將采集回的海泥、海沙放入2 L燒杯中加入海水,保持水泥比1∶1,進(jìn)行曝氣培養(yǎng)。以葡萄糖為碳源,以NH4Cl為氮源,以KH2PO4為磷源,以海水為溶劑,每天按照營養(yǎng)比例n(C)∶n(N)∶n(P)＝100∶5∶1向燒杯中加入營養(yǎng)液,進(jìn)行換水,持續(xù)2周。

CODCr定義為在一定條件下,經(jīng)重鉻酸鉀氧化處理,水樣中的溶解性物質(zhì)和懸浮物所消耗的重鉻酸鉀相對應(yīng)的氧的質(zhì)量濃度,1 mol重鉻酸鉀(1/6 K2Cr2O7)相當(dāng)于1 mol氧(1/2 O)。當(dāng)CODCr去除率趨于穩(wěn)定時(shí),認(rèn)定燒杯中的微生物正常存活,且具有耐鹽特性(鹽度3%)。

之后用CMC-Na逐漸取代葡萄糖作為碳源,CMC-Na占比以每次10%的程度遞增,每個(gè)濃度梯度培養(yǎng)1周。當(dāng)碳源全部替換為CMC-Na,CODCr去除率趨于穩(wěn)定時(shí),則認(rèn)為菌群馴化成功。

1.6 快速消解分光光度法測定廢水中化學(xué)需氧量(CODCr)

按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)HJ/T 399—2007配制試劑并選擇試劑用量。取4支消解管(1支空白＋3支平行試樣),空白試樣中依次加入2 mL蒸餾水、1 mL重鉻酸鉀溶液(0.12 mol·L－1)與硫酸汞溶液(0.24 g·mL－1)混合液、4 mL硫酸銀-硫酸溶液(10 g·L－1),混勻;被測試樣消解管中用2 mL水樣代替蒸餾水,其余不變,混勻。在快速消解儀中,將消解管中的溶液在150℃溫度下消解2 h后取出,使用COD測定儀進(jìn)行測定。取三組數(shù)據(jù)的平均值作為出水CODCr,并計(jì)算CODCr的去除率。

1.7 菌種的分離、純化

將燒杯中的泥水分別接種至富集培養(yǎng)基,細(xì)菌采用LB培養(yǎng)基,真菌用馬丁氏培養(yǎng)基,放線菌用高氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[11]。采用平板劃線分離法在CMC固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離、純化,根據(jù)菌落大小、顏色、形狀、隆起程度、透明程度和表面光澤等形態(tài)特征對菌株進(jìn)行區(qū)分,并挑取單菌落制成斜面培養(yǎng)基放于冰箱4℃冷藏。

1.8 剛果紅染色法初篩

剛果紅染液可以與培養(yǎng)基中的多糖結(jié)合形成紅色混合物,對纖維二糖和葡萄糖無作用。而產(chǎn)纖維素酶的微生物可以降解多糖底物,通過Na Cl溶液的作用可以將染液洗脫,從而產(chǎn)生透明圈[12]。將配制的CMC固體培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(20 min,120℃),冷卻后制成平板。將菌種接種于平板上,30℃恒溫培養(yǎng)2 d后取出,向培養(yǎng)基表面滴加0.1%的剛果紅染液浸泡15 min,然后用適量1 mol·L－1Na Cl溶液洗脫20 min,觀察有無透明水解圈出現(xiàn)。出現(xiàn)水解圈的菌株即為所需要的耐鹽型產(chǎn)纖維素酶菌。記錄水解圈直徑(D)和菌株的直徑(d),D/d的值作為初篩的依據(jù)。

1.9 粗酶液的制備

將菌株接種在深層發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30℃恒溫、搖床轉(zhuǎn)速150 r·min－1條件下培養(yǎng)2 d,取上清液4 mL于離心管中,4 000 r·min－1離心10 min,上清液即為粗酶液。

1.10 DNS法測定FPA酶活

以規(guī)格為(6.0 c m×1.0 c m)的What man No.1濾紙條為底物,加入定量粗酶液和DNS試劑后,測定FPA酶活。

1.11 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制1.0 mg·mL－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL,取若干25 mL比色管,按表1所示配制混合溶液?；靹蚝蠓兴? min,立即放入冰水中冷卻至室溫,用蒸餾水定容至25 mL。以1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照,在540 nm波長下測定溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),葡萄糖含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制Table 1 Glucose standar d solution preparation

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

其中R2＝0.999 42＞0.95,說明在540 n m波長處,吸光度與溶液中葡萄糖含量存在可靠的線性關(guān)系,該組數(shù)據(jù)可以作為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.12 FPase酶活測定

將FPA酶活定義為酶水解1 h后每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量[12]。測定FPA酶活時(shí)樣品中包含規(guī)格為6.0 c m×1.0 c m(50 mg)的Whatman No.1濾紙條、1 mL粗酶液、1 mL p H＝6的磷酸緩沖溶液。將樣品與空白(濾紙條＋2 mL緩沖溶液)50℃恒溫水浴1 h后各加入1.5 mL DNS試劑,沸水浴5 min后冷卻、定容至25 mL,靜置20 min后于540 n m波長處測定吸光度。計(jì)算酶活[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 污泥馴化

當(dāng)營養(yǎng)液中的碳源全部由葡萄糖替換為CMCNa后,開始每2 d對出水CODCr進(jìn)行監(jiān)測,持續(xù)兩周,期間CODCr去除率變化情況見圖2。在第3 d時(shí)CODCr去除率有下降趨勢,且出現(xiàn)絮凝性變差的情況,原因是碳源全部改為CMC-Na,微生物無法短時(shí)間適應(yīng)。之后CODCr去除率逐漸回升,在第13 d的時(shí)候達(dá)到最高值62.4%。在第15、17 d測量時(shí)發(fā)現(xiàn)CODCr去除率有所下降,并且出現(xiàn)污泥沉降性能變差的情況,污泥量因此有所減少。經(jīng)分析可能是由于馴化期間沒有新污泥的加入,且持續(xù)時(shí)間過長,微生物傳代次數(shù)過多,導(dǎo)致降解能力有所衰退。為保存菌種,在第17 d時(shí)將菌株分離出來,結(jié)束馴化過程。

圖2 CODCr去除率變化情況Fig.2 CODCr removal rate changes

2.2 菌種的初篩

經(jīng)分離、純化后獲得10株耐鹽菌,對于其是否具有降解纖維素的性能還需進(jìn)行檢驗(yàn)。

剛果紅染色后會(huì)在產(chǎn)纖維素酶菌株周圍出現(xiàn)以菌株為中心的透明圈,因此可以通過染色后菌株周圍是否產(chǎn)生透明圈來判斷是否該菌株具備降解纖維素的能力[10]。使用剛果紅染液染色后共有7株菌出現(xiàn)了透明水解圈,分別命名為1～7號(hào)菌株。實(shí)驗(yàn)測定了水解圈直徑D和菌落直徑d,通過D/d的值來初步表示菌株降解纖維素的能力。該值越大,說明菌株的產(chǎn)酶能力越高,降解纖維素的能力越強(qiáng),反之則越弱,結(jié)果見表2。

表2 CMC-Na固體培養(yǎng)基不同菌株的水解能力Table 2 Hydr olysis ability of different strains of CMC-Na solid mediu m

由表2可知,分離得到的10株菌種,只有7種菌產(chǎn)生了透明水解圈,即初步判定具有降解纖維素的能力,但D/d的值存在較大差異,比值最小1.27,最大4.00。數(shù)據(jù)初步表明,3號(hào)和4號(hào)菌株顯示出了良好的降解能力,D/d的值分別為3.67和4.00。其次是5號(hào)和7號(hào),D/d的值分別為2.00和2.20。以上4株菌株在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要重點(diǎn)關(guān)注,其余菌株降解能力一般。雖然1號(hào)菌株在培養(yǎng)基上的生長速度很快,菌落直徑達(dá)到0.55 c m,但D/d的值只有1.27,為7株菌種內(nèi)降解能力最弱的一種。

在實(shí)驗(yàn)過程中,同一株菌,菌落大小不同,水解圈大小和染色效果也不同,而且存在測量誤差。所以在選擇測量對象的時(shí)候要盡量選取界限分明、染色效果好、大小適中的單菌落,同一直徑測量3次取平均值,最終計(jì)算得出D/d的值進(jìn)行比較。

另外,一株菌是否具備降解纖維素的能力不能只靠是否產(chǎn)生透明圈來判斷。某些菌株會(huì)分泌色素或者降解色素的活性物質(zhì),同樣會(huì)在培養(yǎng)基中產(chǎn)生透明圈,即假陽性結(jié)果。因此,需要對透明圈實(shí)驗(yàn)中的陽性菌株進(jìn)行定量篩選,以纖維素總酶活(FPA酶活)為指標(biāo),進(jìn)行酶活測定[12]。

2.3 菌種的復(fù)篩

將7種菌株各取一環(huán)接種至深層發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于30℃,轉(zhuǎn)速150 r·min－1的恒溫水浴搖床中發(fā)酵2 d后取出,DNS法測定各菌株的FPA酶活數(shù)據(jù),見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:7個(gè)菌株都有降解纖維素的酶,只不過存在能力大小的差異。4號(hào)菌的FPA酶活最高,是實(shí)驗(yàn)的優(yōu)良菌種,其他菌種FPA酶活都在0.05 U·mL－1左右,能力相差不大。綜合菌落形狀、水解圈大小、產(chǎn)酶能力3項(xiàng)指標(biāo),2、3、4、6號(hào)菌株為實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)菌株,同時(shí)具備耐鹽度3%和降解纖維素的能力,4號(hào)菌為最佳菌株。由于高鹽度對微生物活性的抑制作用,實(shí)驗(yàn)中測定得到的FPA酶活普遍低于同類研究中的酶活數(shù)據(jù)。如想提高其酶活,可在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中通過改變p H值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間等因素進(jìn)行改善。

表3 各菌株FPase酶活測定Table 3 FPase enzy me activity of each strain

3 結(jié) 論

前期通過控制反應(yīng)條件對海洋中原始菌種進(jìn)行馴化。經(jīng)過約2個(gè)月的馴化,污泥顏色從灰黑色逐漸變?yōu)辄S褐色,CODCr去除率穩(wěn)定在65%左右。對馴化后的菌株進(jìn)行篩選得到4株目標(biāo)菌株,其耐鹽度為3%。2號(hào)菌株FPase酶活為0.052 U·mL－1,菌落特征為白色、形狀規(guī)則、邊緣整齊、扁平狀、較小;3號(hào)菌株FPase酶活為0.065 U·mL－1,菌落特征為白色,形狀規(guī)則,邊緣整齊,凹陷狀,較大;4號(hào)菌株FPase酶活為0.120 U·mL－1,菌落為中間淡黃色四周透明的較大規(guī)則圓形,邊緣有褶皺;6號(hào)菌株FPase酶活為0.047 U·mL－1,菌落特征為中間乳白色,四周透明,規(guī)則圓形,邊緣整齊,黏稠。4株菌后期可以進(jìn)行酶系互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和拮抗實(shí)驗(yàn),用以構(gòu)建混合菌劑,提升降解纖維素的能力。