賁雨龍，李世芬，胡 奇，王言之，王玉邦

（1.南京醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，江蘇南京 211166；2.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 211166；3.江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心，江蘇 南京 211166；4.南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 211166）

0 引言

人參皂苷屬于固醇類(lèi)化合物，作為一種活性成分主要存在于人參屬藥材中。因?yàn)槿藚⒃碥赵诙鄺l代謝途徑中都能發(fā)揮一定的作用，因此具有復(fù)雜的效能。有研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷具有抑制癌細(xì)胞向其他器官轉(zhuǎn)移[1-2]、增強(qiáng)免疫力等作用[3-4]。同時(shí)，人參皂苷在興奮中樞神經(jīng)、抗疲勞、改善記憶與學(xué)習(xí)能力、抗休克[5-8]等方面具有重要意義。鑒于人參凍干粉膠囊中主要有效成分為人參皂苷，課題組設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠緩解疲勞的功能，旨在為人參凍干粉膠囊的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品

人參凍干粉膠囊，規(guī)格為0.4 g/?！?00粒/瓶，批號(hào)：20151128，由南京中科藥業(yè)有限公司提供的膠囊內(nèi)容物為試驗(yàn)的受試樣品，樣品顏色為淡灰色，呈粉末狀，樣品密封置干燥處保存。樣品標(biāo)示保質(zhì)期為24個(gè)月，該受試樣品的人體推薦攝入量為2.4 g/人·日。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，數(shù)目為160只，規(guī)格為SPF級(jí)，由上海某公司提供。各平行試驗(yàn)組初始體重范圍為19.0~21.9 g。按體重隨機(jī)分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ4組，其中每大組中的小鼠均為40只，各分為每小組10只的4個(gè)劑量組，分別進(jìn)行負(fù)重游泳試驗(yàn)、血漿尿素測(cè)定、肝糖原測(cè)定和血乳酸測(cè)定。

試驗(yàn)動(dòng)物在中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，維持飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20~26℃，相對(duì)濕度為40%~70%。

1.3 劑量選擇與受試物給予方式

根據(jù)受試樣品每人每日推薦攝入量2.4 g（按60 kg體重計(jì)），按照劑量大小設(shè)計(jì)低、中、高3個(gè)劑量組，即0.20，0.40，1.20 g/kg·bw/d，分別等同于人體推薦攝入量的5倍，10倍，30倍，另設(shè)0 g/kg·bw/d對(duì)照組，用無(wú)菌水代替受試物。受試樣品用無(wú)菌水配制，低、中、高劑量配制質(zhì)量濃度分別為20，40，120 mg/mL，按0.1 mL/10 g·bw灌胃。以每日1次的頻率，經(jīng)口途徑給予小鼠相應(yīng)濃度的受試樣品，不間斷灌胃1個(gè)月后測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4 儀器

TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)、JA2003型電子天平、科華ST960型酶標(biāo)儀、HWS-26型水浴鍋等。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 負(fù)重游泳試驗(yàn)

末次給小鼠受試物后，等待30 min，在鼠尾根部負(fù)荷5%體重的鉛絲。將小鼠放置在水深約35 cm，水溫25±1℃的游泳箱中使其做游泳運(yùn)動(dòng)。用計(jì)時(shí)器計(jì)量試驗(yàn)小鼠從游泳開(kāi)始到完全死亡的時(shí)長(zhǎng)，即小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

劑量組負(fù)重游泳時(shí)間明顯長(zhǎng)于0 g/kg·bw/d組，且差異有顯著性，可判定該試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

1.5.2 血漿尿素測(cè)定

末次給小鼠有關(guān)受試物后，間隔30 min，使小鼠處于不負(fù)重狀態(tài)，在水溫30℃的環(huán)境下做90 min的游泳運(yùn)動(dòng)。小鼠休息60 min后立即對(duì)其執(zhí)行眼眶采血操作。對(duì)收集的小鼠血樣進(jìn)行離心處理，吸取20μL血漿，用二乙酰-肟法測(cè)定血漿尿素值。

劑量組血漿尿素低于0 g/kg·bw/d組，且差異有顯著性，可判定該試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

1.5.3 肝糖原測(cè)定

末次給小鼠受試物后，留以0.5 h等待時(shí)間，然后立刻執(zhí)行處死操作并摘取其肝臟。用實(shí)驗(yàn)室自制的生理鹽水漂洗摘取物，用濾紙吸干殘余水漬，將0.225 mL堿溶液加入精確稱(chēng)取的75 mg肝臟中，將混合物煮沸20 min，制成1%肝勻漿液。將2 mL蒽酮試劑加入0.1 mL所制溶液，進(jìn)行煮沸處理5 min。待其冷卻后進(jìn)行比色測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)為620 nm，基于稱(chēng)得的肝臟質(zhì)量對(duì)肝糖原含量進(jìn)行計(jì)算并記錄。

劑量組肝糖原含量明顯高于0 g/kg·bw/d組，且差異有顯著性，可判定該試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

1.5.4 血乳酸測(cè)定

末次給小鼠受試物后，留以0.5 h等待時(shí)間，于眼眶采血。然后令未負(fù)重的小鼠在水溫為30℃的環(huán)境中做10 min的游泳運(yùn)動(dòng)，結(jié)束后立即眼眶采血，休息20 min后再執(zhí)行眼眶采血操作，對(duì)小鼠血乳酸含量進(jìn)行測(cè)定和記錄。

劑量組血乳酸曲線下面積小于0 g/kg·bw/d組，且差異有顯著性，可判定該試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0軟件對(duì)各試驗(yàn)各劑量組的初始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，用兩兩比較方法和秩和檢驗(yàn)分別對(duì)滿(mǎn)足方差齊要求的數(shù)據(jù)資料和非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.7 結(jié)果判定

若負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，同時(shí)血乳酸、血漿尿素、肝糖原3項(xiàng)生化指標(biāo)中任意2項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性，即可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠體重的影響

人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠體重的影響見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，小鼠的初始體重0.20，0.40，1.20 g/kg·bw/d組與0 g/kg·bw/d組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。即小鼠的初始體重在各組間較為均衡。

表1 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠體重的影響

表1 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠體重的影響

劑量/g·（kg·bw/d）-1 動(dòng)物數(shù)/只 Ⅰ組初始體重/g p值 Ⅰ組終末體重/g 增長(zhǎng)值/g p值0 0.20 0.40 1.20 10 10 10 10 20.44±0.93 20.48±0.69 20.43±0.79 20.44±0.89 0.999 1.000 1.000 27.34±1.31 26.87±1.05 26.98±1.17 27.65±1.11 6.90±1.40 6.39±0.96 6.55±1.24 7.21±1.56 0.716 0.880 0.912

由表1可見(jiàn)，0.20，0.40，1.20 g/kg·bw/d組與0 g/kg·bw/d組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。

2.2 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，0.40 g/kg·bw/d組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間長(zhǎng)于0 g/kg·bw/d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。

表2 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

2.3 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠游泳后血漿尿素水平的影響

人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠游泳后血漿尿素的影響見(jiàn)表3。

表3 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠游泳后血漿尿素的影響

表3 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠游泳后血漿尿素的影響

劑量/g·（kg·bw/d）-1動(dòng)物數(shù)/只 血漿尿素/mmol·L-1 p值0 0.20 0.40 1.20 10 10 10 10 6.19±0.83 5.96±0.52 5.44±0.24 5.71±0.47 0.667 0.013 0.148

由表3可見(jiàn)，0.40 g/kg·bw/d組血漿尿素水平低于0 g/kg·bw/d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。其余2個(gè)劑量組與對(duì)照組比較，血漿尿素水平都存在一定水平的降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠肝糖原儲(chǔ)備量的影響

人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠肝糖原儲(chǔ)備量的影響見(jiàn)表4。

表4 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠肝糖原儲(chǔ)備量的影響

表4 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠肝糖原儲(chǔ)備量的影響

劑量/g·（kg·bw/d）-1動(dòng)物數(shù)/只 肝糖原/mg·g-1 p值0 0.20 0.40 1.20 10 10 10 10 22.6±5.6 27.6±6.6 25.7±2.1 27.5±4.2 0.089 0.218 0.063

由表4可見(jiàn)，0.20，0.40，1.20 g/kg·bw/d組肝糖原儲(chǔ)備量與0 g/kg·bw/d組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠肝糖原儲(chǔ)備量無(wú)顯著影響。

2.5 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠游泳前后血乳酸值及其曲線下面積的影響

人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠游泳后血乳酸（mmol/L）曲線下面積的影響見(jiàn)表5。

表5 人參凍干粉膠囊對(duì)小鼠游泳后血乳酸（mmol/L）曲線下面積的影響

由表5可見(jiàn)，0.40 g/kg·bw/d組小鼠游泳后血乳酸曲線下面積值低于0 g/kg·bw/d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。與對(duì)照組相比，0.40 g/kg·bw/d，1.20 g/kg·bw/d劑量組小鼠血乳酸曲線下面積值均有降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果分析，與0 g/kg·bw/d組相比，0.40 g/kg·bw/d組負(fù)重游泳的時(shí)間更長(zhǎng)，血漿尿素含量更低；游泳后血乳酸曲線下面積值也更小，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》之緩解體力疲勞功能試驗(yàn)的結(jié)果判定，在試驗(yàn)條件下人參凍干粉膠囊具有緩解體力疲勞的作用。

隨著社會(huì)壓力的日益增大，疲勞逐漸成為一種普遍而廣泛的社會(huì)現(xiàn)象，并對(duì)人們的身心健康產(chǎn)生重大危害。根據(jù)疲勞物質(zhì)累積理論，勞動(dòng)者在勞動(dòng)過(guò)程中會(huì)在體內(nèi)逐漸積累起某種疲勞物質(zhì)（即乳酸等化學(xué)物質(zhì)），這種疲勞物質(zhì)會(huì)在肌肉和血液中逐漸堆積，最終使人體力衰竭。因此，血乳酸含量是衡量疲勞程度的重要標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)中，0.40 g/kg·bw/d組小鼠游泳后血乳酸曲線下面積值低于0 g/kg·bw/d組，與宋昕恬等人[9]的研究結(jié)果互相印證，證實(shí)人參皂苷能顯著減少乳酸堆積。同時(shí)，由于能使機(jī)體紅細(xì)胞的數(shù)量增加，血紅蛋白含量提高，因此人參皂苷在提高氧的供給和增強(qiáng)氧代謝方面具有重要作用，最終減少乳酸的產(chǎn)生，緩解疲勞[10]。再者，人參皂苷能大大刺激機(jī)體運(yùn)動(dòng)時(shí)LDH的活性[11-12]，使氫離子的釋放受到抑制，同時(shí)加強(qiáng)機(jī)體對(duì)乳酸的清除能力，讓機(jī)體的酸化程度得到一定程度的降低，并且有利于恢復(fù)肌肉正常的收縮性能，這與姚根蘭等人[13]研究的人參抗疲勞作用試驗(yàn)結(jié)果相近。人參凍干粉膠囊的緩解疲勞作用或可廣泛應(yīng)用于提高人體運(yùn)動(dòng)能力、減輕疲勞對(duì)人體發(fā)育的阻礙作用等方面。隨著人參皂苷研究成果的積累，其功效原理必將發(fā)揮更加積極的作用。