張曦文，方梓鎣，修 倩，馬瑩雪，宋志遠(yuǎn)

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品分析檢驗及加工技術(shù)科技服務(wù)中心，遼寧大連 116023）

鮑魚在加工過程中會產(chǎn)生大量的內(nèi)臟，占鮑魚體重的20%~30%[1]。研究表明，鮑魚內(nèi)臟中約5%的多糖，具有抗腫瘤、提高免疫力及抗氧化等生物活性[2-4]。目前，海洋生物多糖的輔助提取方法主要有微波法[5]、酶解法[6]等，試驗采用鹽析萃取和酶解相結(jié)合的方法提取鮑魚內(nèi)臟多糖，為鮑魚內(nèi)臟多糖的提取和綜合高值化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內(nèi)臟，產(chǎn)于大連市長?？h；葡萄糖、碳酸鈉、無水乙醇、木瓜蛋白酶、硫酸、苯酚，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S型分析天平，廣州市賽多利斯有限公司產(chǎn)品；Synergy H/HM型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型精密pH計，常州德普科技有限公司產(chǎn)品；FD-1型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 鮑魚內(nèi)臟多糖的鹽析萃取

采用碳酸鈉/乙醇體系鹽析萃取鮑魚內(nèi)臟多糖[7]，取一定量碳酸鈉溶于水中，依次加入鮑魚內(nèi)臟凍干粉和乙醇，體系為50 g，將混合體系渦旋振蕩充分混勻，于35℃下靜置，體系分層，形成上相、中相（固相）、下相，取出中間固相檢測多糖含量，計算多糖回收率。分別固定乙醇體積分?jǐn)?shù)（W/W）20%，25%，30%，考查碳酸鈉濃度對鮑魚內(nèi)臟多糖回收率的影響；分別固定碳酸鈉體積分?jǐn)?shù)（W/W）10%，15%，20%，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)對鮑魚內(nèi)臟多糖回收率的影響。

1.3.2 鮑魚內(nèi)臟多糖（中間固相）的酶解提取

將鹽析萃取的中間固相取出，冷凍干燥粉碎備用。以鮑魚內(nèi)臟多糖提取率為指標(biāo)，考查溫度（50，55，60，65，70℃）、加酶量（1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%）、pH值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）、料液比（20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，40∶1）4個單因素對多糖提取率的影響。依據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用四因素三水平的正交試驗，優(yōu)化提取條件。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.4 多糖回收率及提取率計算

采用苯酚硫酸法[8]測定鮑魚內(nèi)臟總糖含量，3,5-二硝基水楊酸法[9]測定還原糖含量，多糖含量=總糖含量-還原糖含量，多糖回收率=固相中多糖質(zhì)量/鮑魚內(nèi)臟干粉質(zhì)量，多糖提取率=粗多糖中多糖質(zhì)量/原料樣品質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳酸鈉-乙醇體系鹽析萃取鮑魚內(nèi)臟多糖

分別固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%，25%，30%，考查碳酸鈉添加量對鮑魚內(nèi)臟多糖回收率的影響。

碳酸鈉添加量對多糖回收率的影響見圖1。

圖1 碳酸鈉添加量對多糖回收率的影響

由圖1可以看出，當(dāng)固定乙醇體積分?jǐn)?shù)時，多糖回收率隨碳酸鈉添加量的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)碳酸鈉添加量超過20%，體系不再成相。當(dāng)乙醇（25%）-碳酸鈉（20%）時，鮑魚內(nèi)臟多糖的回收率最高，為94.05%。分別固定碳酸鈉添加量為10%，15%，20%，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)對鮑魚內(nèi)臟多糖回收率的影響。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖回收率的影響見圖2。

由圖2可以看出，當(dāng)固定碳酸鈉時，多糖回收率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過26%時，多糖回收率基本呈現(xiàn)平穩(wěn)的狀態(tài)。當(dāng)乙醇（26%）-碳酸鈉（20%）時，鮑魚內(nèi)臟多糖的回收率最高，為94.08%。因此，確定最優(yōu)條件為乙醇（25%）-碳酸鈉（20%）。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖回收率的影響

2.2 鮑魚內(nèi)臟多糖（中間固相）的酶解提取單因素試驗

2.2.1 料液比對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響

料液比對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對多糖提取率的影響

由圖3可以看出，鮑魚內(nèi)臟多糖提取率開始隨料液比的增加呈現(xiàn)上升趨勢，在料液比達(dá)到1∶35之后趨于平緩。一方面，料液比會影響多糖與提取溶劑的濃度差，從而影響傳質(zhì)速率，因此多糖會呈現(xiàn)上升趨勢[10]；另一方面，料液比會影響底物濃度，底物濃度對酶催化反應(yīng)有非常顯著的影響，底物濃度較低時，酶催化反應(yīng)速率隨底物濃度的增加而增大，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時，會抑制酶催化反應(yīng)[11]。因此，選擇料液比為1∶35。

2.2.2 pH值對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響

pH值對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 pH值對多糖提取率的影響

由圖4可以看出，pH值從6.0升高到7.0時，多糖提取率快速升高，當(dāng)pH值達(dá)到7之后，多糖提取率開始逐漸下降，因此最優(yōu)pH值為7。酶活性會受pH值的影響，當(dāng)偏離最適pH值時，酶的活性將會降低或失去活性，使得多糖提取率下降[12]。

2.2.3 溫度對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響

溫度對多糖提取率的影響見圖5。

圖5 溫度對多糖提取率的影響

由圖5可以看出，多糖提取率開始隨溫度的升高呈現(xiàn)上升的趨勢，65℃時多糖提取率最大，之后多糖提取率下降。一方面，溫度過高超過了酶催化反應(yīng)的最適溫度導(dǎo)致酶活下降；另一方面，溫度過高可能引起內(nèi)臟結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生變化及糖蛋白發(fā)生變性等，不利于多糖的溶出[13]。

2.2.4 加酶量對鮑魚內(nèi)臟多糖提取率的影響

加酶量對多糖提取率的影響見圖6。

圖6 加酶量對多糖提取率的影響

由圖6可知，多糖提取率隨著加酶量的增加而增大，在2.5%時達(dá)到最大值，之后趨于平緩。因此，最佳加酶量為2.5%。

2.3 鮑魚內(nèi)臟多糖酶解提取正交試驗

正交試驗直觀分析見表2。

各因素對多糖提取率影響順序為加酶量（B）>溫度（A）>pH值（C）>料液比（D），最優(yōu)組合條件為A1B3C2D2，即溫度65℃，加酶量3%，pH值7，料液比1∶35，進(jìn)行驗證試驗，多糖提取率為2.88%。

3 結(jié)論

采用鹽析萃取和酶解提取相結(jié)合的方法，從鮑魚內(nèi)臟中提取多糖。鹽析萃取的最優(yōu)條件為乙醇（25%）-碳酸鈉（20%），多糖的回收率為94.08%。將鹽析萃取的固相取出，以多糖提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗，獲得鮑魚內(nèi)臟多糖最佳酶解工藝條件為溫度65℃，加酶量3%，pH值7，料液比1∶35，此條件下多糖提取率為2.88%。相比單一的酶解水提法，鹽析萃取法可有效去除部分色素、重金屬及其他雜質(zhì)，有效提高多糖的品質(zhì)。鹽析萃取法和酶解水提法具有條件溫和、提取效率高、易于操作放大等優(yōu)點，擁有非常廣闊的應(yīng)用前景。

表2 正交試驗直觀分析