鄧佑林　冉思妍　蘇慧仁　李芳芳　張鵬　黃秀香

摘? 要：用乙醇-水混合溶液從廣西宜州的火棘果（Pyracantha fortuneana（Maxim.） Li）中提取總多酚，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化法得到影響D-101大孔樹脂吸附火棘果總多酚的優(yōu)化條件，并建立數(shù)學(xué)模型;探討了溶液pH值、吸附時間和吸附溫度對火棘果總多酚吸附率的影響，并對實(shí)驗(yàn)的顯著性和方差進(jìn)行了分析，結(jié)果表明最佳條件為吸附時間120 min、溶液pH值5、吸附溫度70 ℃，火棘果總多酚的提取率為0.244 72%，模型預(yù)測值為0.238 70%，組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果比模型預(yù)測值小0.006 02%.

關(guān)鍵詞：火棘果;大孔樹脂;響應(yīng)面法;總多酚;提取工藝

中圖分類號：TQ353DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.02.016

0引言

火棘果（Pyracantha fortuneana（Maxim.）Li）又稱為火把果、水杈子、水紅子[1-3]等，屬于薔薇科火棘屬蘋果亞科[4]，在廣西主要分布在山地丘陵.火棘果具有降血脂、抗氧化、美白等功效，多酚類化合物具有抗病原微生物、抗腫瘤、延緩機(jī)體衰老和抗氧化等功能[5-7].隨著人們對生活品質(zhì)要求的提高，健康問題和形象保養(yǎng)越來越受到關(guān)注，而火棘果在食用、藥用、化工、生態(tài)等方面都有著較好的開發(fā)前景[8-12]，所以火棘果總多酚的研究具有較廣闊的前景和較好的研究價(jià)值.深入研究火棘果，既可以充分利用當(dāng)?shù)刭Y源，又可為廣西的經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供一定的效益.

本研究使用D-101大孔樹脂分離火棘果總多酚[13-20]，進(jìn)行3個單因素實(shí)驗(yàn)：溶液的pH值、吸附時間和吸附溫度，然后根據(jù)Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，得到回歸方程后建立模型進(jìn)行顯著性分析，得到了最優(yōu)工藝條件，并在最佳條件下進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明此方法可行.

1?? 材料與方法

1.1? 儀器與試劑

1.1.1?? 主要試劑及材料

試劑：福林酚試劑、鹽酸、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、乙醇、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品等均為分析純，試劑購于西隴化工股份有限公司和成都金山化學(xué)試劑有限公司，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，超純水取于河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院.

材料：火棘果采摘于廣西宜州，干燥后，用粉碎機(jī)粉碎后過30目（550 μm）篩，保鮮保存?zhèn)溆?D-101大孔吸附樹脂購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，規(guī)格是HG2-885-76.

1.1.2?? 主要儀器

主要儀器有：Agilent8453紫外-可見分光光度計(jì)（安捷倫科技有限公司）、KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）、DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī) （上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、200A-1搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（永康市云達(dá)冷風(fēng)機(jī)廠）、DISCV-I-18超純水機(jī)（成都艾柯水處理設(shè)備有限公司）、HH-S4恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）等.

1.2實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1? ?樹脂預(yù)處理

將新采購的D-101大孔樹脂在超純水中浸泡24 h，樹脂溶脹后，沖洗至水無顏色，并分別用4%氫氧化鈉溶液和4%鹽酸溶液浸泡12 h，換溶液時樹脂用水洗至中性，最后在蒸餾水中浸泡2 h～? 4 h，處理后的濕樹脂保存于冰箱中備用，使用前充分搖勻[20].

1.2.2?? 提取總多酚

準(zhǔn)備250 mL的錐形瓶，稱取火棘果粉12.5 g于其中，加入87.5 mL的 70%乙醇水溶液并封住錐形瓶口，在60 ℃的超聲波清洗機(jī)中超聲提取 60 min，抽濾，濾液用70%乙醇水溶液定容至?? 250 mL，冷藏備用.

1.2.3?? 福林酚比色法

在樣液中加入5.0 mL超純水進(jìn)行稀釋后，再加0.5 mL福林酚試劑進(jìn)行混合，充分反應(yīng)1 min后，滴加1.5 mL 20%碳酸鈉溶液到混合溶液中，利用超純水進(jìn)行定容，最后，在75 ℃條件下反應(yīng)?? 10 min，用紫外-可見吸收光譜儀在760 nm波長下測定混合溶液的吸光度[21].

1.2.4?? 不同溶液pH值對總多酚的吸附影響

于5個100 mL具塞的錐形瓶中放入5.0 mL按1.2.2節(jié)方法制得的火棘果提取液，用鹽酸和氫氧化鈉配置的稀溶液，將火棘果提取液的pH分別調(diào)至3、4、5、6和7，按固液比1∶10（m（g）∶V（mL））加入處理過的濕樹脂0.5 g，于60 ℃恒溫水浴鍋中吸附120 min，抽濾;濾渣轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶，并加5.0 mL的60%乙醇-水溶液，60 ℃下解析120 min，再次進(jìn)行抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移入5個10 mL容量瓶中，按1.2.3節(jié)方法測定溶液吸光度.

1.2.5不同吸附時間對總多酚的吸附影響

于6個100 mL具塞的錐形瓶中放入5.0 mL按1.2.2節(jié)方法制得的火棘果提取液，并按固液比 1∶10（m（g）∶V（mL））各加入處理過的樹脂0.5 g，讓它分別吸附30 min、60 min、90 min、120 min、150 min和180 min（恒溫水浴鍋中的溫度是60 ℃），抽濾;備好6個100 mL具塞的錐形瓶，并將上述步驟所得的濾渣轉(zhuǎn)移到其中，各加5.0 mL的 60%乙醇水溶液，60 °C解析120 min，抽濾，分別將濾液轉(zhuǎn)移至6個10 mL容量瓶中，按1.2.3節(jié)方法測定吸光度.

1.2.6?? 不同吸附溫度對總多酚的吸附影響

于5個100 mL具塞的錐形瓶中放入5.0 mL按1.2.2節(jié)方法制得的火棘果提取液，分別放在不同溫度的恒溫水浴鍋中，溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，按1∶10（m（g）∶V（mL））的固液比，加入0.5 g處理過的大孔吸附樹脂，在60 ℃的恒溫水浴鍋中吸附120 min，抽濾;準(zhǔn)備5個100 mL具塞的錐形瓶，并將濾渣全部轉(zhuǎn)移至其中，加入5.0 mL的 60%乙醇水溶液，于60 ℃超聲波清洗機(jī)上解析120 min，抽濾，準(zhǔn)備5個10 mL容量瓶，分別將濾液轉(zhuǎn)移至其中，按1.2.3節(jié)方法測定吸光度.

1.2.7?? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與繪制

準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為0.01 g的沒食子酸對照品，溶于超純水中并定容至100 mL，得0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.分別量取0.10 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、? 0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL于 10 mL容量瓶中，按1.2.3節(jié)福林酚比色法處理后，用紫外-可見吸收光譜儀在400～800 nm范圍進(jìn)行全波長掃描，在最大吸收波長760 nm處測定吸光度.沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果如表1所示，根據(jù)表1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程y=103.07x + 0.008 2，如圖1所示.

1.2.8?? 含量測定

準(zhǔn)備25 mL的容量瓶，移取2.0 mL火棘果提取液置于其中，按1.2.3節(jié)方法測定吸光度.火棘果總多酚提取率計(jì)算方法如下：

[X=cV1V2MV3]

其中：[X]為火棘果中總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù);c為溶液質(zhì)量濃度，mg/mL;[V1]為稀釋體積，mL;[V2]為火棘果提取液體積，mL;[V3]為火棘果提取液取樣體積，mL;[M]為火棘果粉末質(zhì)量，g.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1?? 不同pH值對樹脂吸附總多酚的影響

[pH值對樹脂吸附總多酚的影響如圖2所示.???? ]

研究在固液比為1∶10（m（g）∶V（mL）），提取溫度為60 ℃，提取時間為120 min的條件下，溶液的不同pH值對火棘果總多酚提取率（W）產(chǎn)生的影響，由圖2可見，當(dāng)pH值從3到5時，因?yàn)闃渲奈搅康陀诮馕?，所以W逐漸增大;當(dāng)pH值為5時，吸附量和解吸量達(dá)到平衡，W達(dá)到最大值 ?0.212 1%;當(dāng)pH值在5之后，吸附量比解析量低，所以W減小.因此得出：pH值過大或者過小都會影響總多酚的提取率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出，pH值應(yīng)選擇5.

2.1.2?? 不同吸附時間對樹脂吸附總多酚的影響

[吸附時間對樹脂吸附總多酚的影響如圖3所示.?????? ]

研究在固液比為1∶10（m（g）∶V（mL）），提取溫度為60 ℃，溶液pH值為5的條件下，由于吸附時間的變化，其對火棘果總多酚提取率（W）產(chǎn)生的影響.由圖3可見，隨著吸附時間逐步由30 min增加至150 min，因?yàn)槲搅刻幱谖达柡蜖顟B(tài)，吸附持續(xù)進(jìn)行，W增大;當(dāng)吸附時間為150 min時，樹脂吸附達(dá)到平衡，吸附量不再改變，此時W最大值為0.249 5%;當(dāng)吸附時間在150 min之后，已吸附的總多酚被氧化，W減小.所以最佳吸附時間為150 min.

2.1.3?? 不同吸附溫度對樹脂吸附總多酚的影響

[吸附溫度對樹脂吸附總多酚的影響如圖4所示.?????? ]

研究在1∶10（m（g）∶V（mL））的固液比，pH值為5，提取時間為120 min的條件下，改變進(jìn)行吸附時的溫度，對火棘果總多酚的提取率（W）的影響.由圖4可知，當(dāng)吸附溫度從40 ℃上升到60 ℃時，因?yàn)闃渲讲换钴S，吸附量小，所以溫度越高，W越大;當(dāng)吸附溫度為60 ℃時，溫度剛好適宜， W達(dá)到最高為0.298 1%;當(dāng)吸附溫度大于60 ℃時，使得已吸附的總多酚被氧化，W減小.所以吸附溫度60 ℃為最佳.

2.2?? 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1? 因素水平表

進(jìn)行溶液pH值、吸附時間和吸附溫度3個單因素實(shí)驗(yàn)，得到最佳吸附水平，根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以實(shí)際提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[22]，因素水平表見表2.

2.2.2?? Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

根據(jù)1.2.4、1.2.5和1.2.6節(jié)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3.

2.2.3?? 建立模型和分析顯著性

利用Design expert 8.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的回歸統(tǒng)計(jì)分析：吸附時間（A）、溶液pH值（B）和吸附溫度（C）對火棘果總多酚提取率的二次多項(xiàng)式回歸方程為：Y=0.24+1.38×10-4×A+2.69×10-4×B+3.18×10-4×C+1.05×10-3×A×B-1.28×10-3×A×C-1.24×10-3×B×C+2.81×10-4×A2-0.016×B2+1.17×10-3×C2.

方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4.

表4顯示所選實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娘@著水平為0.000 7，P<0.001，說明模型效果極顯著，有實(shí)際意義，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠;分析結(jié)果顯示復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.954 6，線性關(guān)系良好，說明回歸模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況吻合程度較高;回歸模型失擬差0.716>0.050，不顯著，說明模型與實(shí)驗(yàn)值差異較小;從P值來看，二次項(xiàng)B2表現(xiàn)為極為顯著，說明回歸方程能較好地描述出單因素與樹脂吸附火棘果總多酚量的關(guān)系，因此，分析得出預(yù)測的最佳工藝條件是比較正確的.

2.2.4?? 響應(yīng)面的分析結(jié)果

3個因素的交互作用影響大小可根據(jù)回歸模型分析得出，用Design expert 8.0軟件進(jìn)行擬合響應(yīng)面形狀，可以清晰地分析3個因素之間的交互作用，能更直觀地分析交互作用之間對響應(yīng)值的影響，結(jié)果見圖5—圖7.

響應(yīng)面圖的作用是：反映因素之間的交互影響大小，判斷方法為：若圖曲面陡峭則交互作用影響顯著，反之則不顯著.由圖5、圖6可知，兩因素之間有交互作用影響;由圖7可知，因素之間交互作用影響不顯著，因?yàn)閳D中所示曲面平緩，與實(shí)驗(yàn)分析的結(jié)果（見表5）一致.吸附實(shí)驗(yàn)最佳條件用Design expert 8.0軟件預(yù)測得：在pH值4.94、吸附時間120 min、吸附溫度70 ℃條件下，模型預(yù)測值為0.238 70%.

2.2.5?? 組合實(shí)驗(yàn)

將預(yù)測值稍微作一點(diǎn)調(diào)整，保證實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)際可操作性和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮侠硇?，用調(diào)整后的條件進(jìn)行5次組合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：pH值為5，吸附時間120 min，吸附溫度70 ℃.結(jié)果見表5，可見模型優(yōu)化后，預(yù)測結(jié)果是合理的，因?yàn)樘崛÷手槐饶Ｐ皖A(yù)測值大0.006 02%.

3結(jié)論

研究了火棘果總多酚最佳提取工藝條件，以火棘果總多酚提取率為響應(yīng)值，用D-101大孔吸附樹脂分離火棘果總多酚，采用響應(yīng)面優(yōu)化，得出：在固液比1∶10（m（g）∶V（mL））、溶液pH值5、吸附時間120 min、吸附溫度70 ℃的條件下，5次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得出總多酚提取率與模型預(yù)測值相差0.006 02%，其值為0.244 72%;各因素對火棘果總多酚提取率的影響，可通過該回歸方程真實(shí)地反映出來，且D-101大孔樹脂不影響分離產(chǎn)物活性;該方法具有實(shí)驗(yàn)分離效果好、設(shè)備操作簡單等優(yōu)點(diǎn).

在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將對其在醫(yī)藥或者保健上的功能進(jìn)行研究.廣西火棘果資源非常豐富，把火棘果發(fā)展成廣西的特色產(chǎn)品，可拉動區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展，因此，火棘果的研究和利用對于廣西來說具有一定的價(jià)值.

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Optimization of the technological conditions for the separation of

total polyphenols from pyracanthophora fruit by macroporous resin

DENG Youlin， RAN Siyan， SU Huiren， LI Fangfang， ZHANG Peng， HUANG Xiuxiang

（School of Chemistry and Biological Engineering， Hechi University， Yizhou 546300， China）

Abstract： Taking the Pyracantha fortuneana （Maxim.） Li from Yizhou， Guangxi as the experimental material， the total polyphenols in the Pyracantha fortuneana （Maxim.） Li were extracted. The solvent used was an ethanol-water mixed solution. Based on the single factor experiment， the optimal process conditions for the separation of the total polyphenols from the Pyracantha fortuneana （Maxim.） Li for D-101 macro-porous resin were obtained by response surface optimization method and a mathematical model was established to study the factors affecting the extraction rate of total polyphenols from the fire spine fruit fortune： pH value of solution， adsorption time， adsorption temperature， and the significance and variance of the experiment were tested. It is concluded that the optimal conditions were adsorption time 120 min， solution pH=5， adsorption temperature 70 ℃ and the extraction rate of total polyphenols from the Pyracantha fortuneana （Maxim.） Li fortune was 0.244 72%. The predicted value of the model was 0.238 70%， and the combined experimental results were 0.006 02% less than the predicted value.

Key words： pyracantha fortuneana; macroporous resin; response surface method; total polyphenol;extraction technology

（責(zé)任編輯：羅小芬、黎 ? 婭）

收稿日期：2020-10-23

基金項(xiàng)目：廣西高校微生物及植物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（2018HL006）;大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（202010605060）;河池學(xué)院2019

年校級項(xiàng)目（2019XJQN015）;廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2018GXNSFAA138140）資助.

作者簡介：鄧佑林，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)，E?mail：461958538@qq.com.