葉心，王力，姜超，杜曉靜，丁小玉，王洪新,3*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(江蘇瑾輝生物科技有限公司，江蘇 鹽城，224100) 3(江南大學(xué), 國家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫，214122)

茶葉是以山茶科植物茶(Camelliasinensis)的芽葉為原料制成的產(chǎn)品，在全世界有著非常悠久的藥用和飲用歷史，據(jù)陸羽《茶經(jīng)》所載，飲茶“發(fā)乎于神農(nóng)，聞于魯周公，興于唐，而盛于宋”。茶葉中含有豐富的功能活性物質(zhì)，如茶多酚、茶多糖、咖啡堿和茶氨酸等[1]，其中茶多酚是最主要的活性成分，也是茶葉深加工的主要產(chǎn)物。目前工業(yè)上生產(chǎn)茶多酚主要采用液液萃取工藝，即使用乙酸乙酯萃取茶葉水提液中的茶多酚，再通過水反萃取除去乙酸乙酯中夾帶的咖啡堿以獲得高純度的茶多酚[2-3]，因此萃余液中含有大量的咖啡堿和一些非酯型兒茶素類、酚酸類和縮酚酸類茶多酚，這幾類茶多酚活性較低且分離純化困難[4]，萃余液常被作為廢液排放。茶葉咖啡堿屬于甲基黃嘌呤類生物堿，具有提神醒腦、利尿減肥、促進(jìn)機(jī)體代謝、治療新生兒呼吸暫停和協(xié)助鎮(zhèn)痛等功效[5-6]，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)。此外，茶葉咖啡堿還具有良好的抗皮膚光老化、生熱解脂和紫外線防護(hù)作用，因此常被添加到眼霜、防曬霜和洗面奶等日用護(hù)膚產(chǎn)品中，起到提亮膚色、消除眼部浮腫和減緩皮膚老化的效果[7-8]。為了有效合理地利用資源，為茶葉深加工企業(yè)增收，選擇一種高效經(jīng)濟(jì)的方法提取純化萃余液中的咖啡堿十分必要。

現(xiàn)階段茶葉咖啡堿的純化方法主要有溶劑萃取法、升華法、超臨界流體萃取法和吸附分離法。溶劑萃取法通常選用毒性較大的氯仿作為萃取劑，咖啡堿得率較高，但對生產(chǎn)人員的健康具有較大危害，且容易帶來二次污染；超臨界萃取法提取效率高，對環(huán)境污染較小，但設(shè)備造價高昂，無法進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)；吸附分離法綠色安全，但分離效率低，溶劑使用量大[9-11]。升華法利用咖啡堿在100 ℃以上時易失去結(jié)晶水開始升華、溫度達(dá)到178 ℃左右時快速升華的性質(zhì)進(jìn)行純化，具有操作簡單方便、工序少、所得咖啡堿純度高等優(yōu)點，適用于工業(yè)化生產(chǎn)[12]，但現(xiàn)有報道主要集中于升華裝置的改進(jìn)，對升華工藝進(jìn)行研究和優(yōu)化的文章較少，而且傳統(tǒng)的升華工藝通常使用氧化鈣處理原料液，存在得率低、升華時間長和所得咖啡堿偏黃等缺點[13]。

膠原酶和彈性蛋白酶是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中最重要的2種酶，主要由成纖維細(xì)胞合成分泌，能夠降解皮膚中的膠原蛋白，和彈性蛋白導(dǎo)致皮膚老化[14]，然而茶葉咖啡堿對膠原酶和彈性蛋白酶活性的影響鮮有報道?；诖?，本研究以液液萃取技術(shù)提取茶多酚后的萃余液為原料，采用升華法提取純化其中的咖啡堿，通過單因素和響應(yīng)面實驗優(yōu)化升華工藝參數(shù)，并研究了所得茶葉咖啡堿對膠原酶和彈性蛋白酶活性的影響，以期實現(xiàn)萃余液中茶葉咖啡堿的高效提取，并為進(jìn)一步促進(jìn)其在護(hù)膚品等領(lǐng)域的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶由江蘇瑾輝生物科技有限公司提供；膠原酶、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)，上海源葉生物科技有限公司；彈性蛋白酶，上海麥克林生化科技有限公司；N-[3-(2-呋喃基)丙烯?；鵠-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸{N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala，F(xiàn)ALGPA}、N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-p-硝基苯胺(N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide，AAAPAN)、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)，美國Sigma公司；氧化鈣、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鈣、檸檬酸、乙酸乙酯(均為分析純)，國藥試劑有限公司。

DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市儀器廠；UV-2100紫外分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；M5全波長酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；HH-4數(shù)顯攪拌水浴鍋，常州賽普實驗儀器廠；1525EF高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶葉萃余液的制備

模擬工業(yè)化生產(chǎn)茶多酚的方法獲得萃余液：將綠茶在105 ℃下鼓風(fēng)干燥12 h，機(jī)械粉碎后過40目篩，取一定量過篩后的茶粉，在90 ℃的熱水中回流浸提1 h，浸提后過濾，濾渣反復(fù)浸提2次，合并濾液后濃縮至固形物含量為8%左右，取適量濃縮液用等體積的乙酸乙酯通過三級錯流萃取富集濃縮液中的茶多酚，再用等體積的蒸餾水通過三級錯流反萃取除去乙酸乙酯中夾帶的咖啡堿，將萃余液濃縮至固形物含量為5%后作為原料備用，參照張琪等[15]的實驗方法通過高效液相色譜法測定濃縮后萃余液中咖啡堿的含量。

1.2.2 萃余液中咖啡堿的提取

采用升華法提取純化萃余液中的咖啡堿：取40 mL濃縮后的萃余液于蒸發(fā)皿內(nèi)，加入適量的前處理劑后用玻璃棒攪拌均勻，放入95 ℃的烘箱中烘干水分至固體狀，將塊狀固體碾磨成粉末并均勻分散在蒸發(fā)皿底部，將蒸發(fā)皿放在油浴鍋內(nèi)的三角支架上，調(diào)整油面高度使蒸發(fā)皿內(nèi)粉末均能穩(wěn)定受熱，在蒸發(fā)皿上方蓋1張刺有許多小孔且孔刺向上的濾紙，將與蒸發(fā)皿口徑相同的漏斗倒扣在濾紙上方，用棉花堵住漏斗頸部，設(shè)定油浴鍋內(nèi)的溫度開始加熱，一段時間后停止加熱并冷卻10 min，冷卻后輕輕取下漏斗，將漏斗內(nèi)壁與濾紙上的白色晶體用適量超純水溶解，稀釋至合適倍數(shù)后參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》，采用紫外分光光度法對咖啡堿含量進(jìn)行測定，繪制咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.049 8C+0.010 9，R2=0.999 1(A為吸光度，C為質(zhì)量濃度，μg/mL)，線性范圍在0～12 μg/mL，按照公式(1)計算咖啡堿得率：

(1)

1.2.3 前處理劑篩選試驗

采用1.2.2中方法提取萃余液中的咖啡堿，固定反應(yīng)條件為升華溫度200 ℃，升華時間30 min，前處理劑添加量與萃余液固形物的質(zhì)量比為2.5∶1，考察不同前處理劑(氧化鈣、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸鈣、乙酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉)對咖啡堿得率的影響。

1.2.4 單因素試驗

采用1.2.2中方法提取萃余液中的咖啡堿，固定反應(yīng)條件為選擇碳酸鈉作為前處理劑，升華時間30 min，碳酸鈉添加量與萃余液固形物的質(zhì)量比為2.5∶1(碳固比)，考察不同升華溫度(180、190、200、210、220 ℃)對咖啡堿得率的影響；固定反應(yīng)條件為選擇碳酸鈉作為前處理劑，升華溫度200 ℃，碳固比2.5∶1，考察不同升華時間(10、20、30、40、50 min)對咖啡堿得率的影響；固定反應(yīng)條件為選擇碳酸鈉作為前處理劑，升華溫度200 ℃，升華時間30 min，考察不同碳固比(1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1)對咖啡堿得率的影響。進(jìn)行單因素試驗，考察各因素變量對咖啡堿得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇升華溫度、升華時間和碳固比為考察因素，咖啡堿得率為響應(yīng)值，采用Design Expert軟件進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計，對升華法提取萃余液中咖啡堿的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，實驗水平和編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實驗的因子水平和編碼Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.6 茶葉咖啡堿抑制膠原酶活性測定

膠原酶抑制試驗按照SATYAVANI等[16]的方法進(jìn)行，并稍作修改。配制含有400 mmol/L NaCl和10 mmol/L CaCl2的Tricine緩沖液(50 mmol/L、pH 7.5)，利用Tricine緩沖液配制0.8 U/mL的膠原酶溶液和2 mmol/L的FALGPA溶液。將40 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與100 μL Tricine緩沖液混合后加入20 μL 0.8 U/mL的膠原酶溶液，混勻后于25 ℃恒溫孵育15 min，再加入40 μL 2 mmol/L的FALGPA溶液，15 min后在335 nm處測定吸光度值，選用EGCG作為陽性對照，平行測定3次。保證混合體系中樣品和EGCG的質(zhì)量濃度梯度均為10、50、100、500、1 000 μg/mL。按照公式(2)計算樣品對膠原酶的抑制率：

(2)

式中：A為不含樣品的反應(yīng)溶液的吸光度；B為不含樣品和酶的反應(yīng)溶液的吸光度；C為含有樣品和酶的反應(yīng)溶液的吸光度；D為不含酶的反應(yīng)溶液的吸光度。

1.2.7 茶葉咖啡堿抑制彈性蛋白酶活性測定

參照NEMA等[17]的實驗方法進(jìn)行彈性蛋白酶的抑制實驗，并稍作修改。取85 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)與15 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液混合后加入25 μL彈性蛋白酶溶液(60 mU/mL)，在25 ℃下孵育15 min，隨后加入25 μL 1.015 mmol/L AAAPAN溶液，15 min后在410 nm處測定吸光度值，彈性蛋白酶溶液和AAAPAN溶液均用50 mmol/L Tris-HCl的緩沖液(pH 8.0)配制，以EGCG作為陽性對照，平行測定3次。保證混合體系中樣品和EGCG的質(zhì)量濃度梯度均為10、50、100、500、1 000 μg/mL。按照公式(2)計算樣品對彈性蛋白酶的抑制率。

1.2.8 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0和Design Expert 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗重復(fù)測試3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理劑篩選試驗結(jié)果與分析

不同前處理劑對咖啡堿得率的影響如圖1所示，其中使用碳酸鈉和碳酸鉀作為前處理劑時咖啡堿得率最大，分別達(dá)到57.21%和55.55%，而不使用前處理劑時咖啡堿得率僅15.3%，傳統(tǒng)升華工藝中使用最多的氧化鈣作為前處理劑時，咖啡堿得率為34.47%，遠(yuǎn)低于碳酸鈉和碳酸鉀，也低于碳酸氫鈉和乙酸鈉，但高于空白組。這表明萃余液在蒸發(fā)水分過程中，高濃度的咖啡堿會與萃余液中的其他物質(zhì)以多種方式結(jié)合，如與沒食子酸等酸類物質(zhì)結(jié)合生成鹽[12]，與EGCG等多酚類物質(zhì)形成絡(luò)合物沉淀等[18]，這些結(jié)合阻礙了咖啡堿的升華，而加入合適的前處理劑能避免咖啡堿與這些物質(zhì)發(fā)生結(jié)合，因此提高了得率。使用碳酸鈣作為前處理劑時，咖啡堿得率最低，僅為18.35%，與空白組相當(dāng)，這是因為碳酸鈣不溶于水，無法在萃余液中電離出碳酸根離子和鈣離子，因此不能與萃余液中的其他物質(zhì)反應(yīng)。氧化鈣與水反應(yīng)后生成微溶于水的氫氧化鈣，氫氧化鈣只能電離出少量的鈣離子和氫氧根離子，而且鈣離子會促進(jìn)咖啡堿與EGCG等多酚類物質(zhì)形成沉淀[19]，另外，氧化鈣與水反應(yīng)生成的氫氧化鈣會夾雜在蒸干水分后的塊狀物內(nèi)，這可能會對咖啡堿的升華產(chǎn)生一定的阻礙作用，因此導(dǎo)致咖啡堿得率偏低。選用氯化鈉作為前處理劑時，咖啡堿得率較低，這是因為氯化鈉呈中性，無法與萃余液中的酸性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，高于空白組可能是鈉離子在其中起到了一定的積極作用。而碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉和乙酸鈉均為強(qiáng)堿弱酸鹽，不僅能與萃余液中的沒食子酸等酸類物質(zhì)反應(yīng)生成鹽，還能提高萃余液的pH值，使萃余液中的多酚類物質(zhì)發(fā)生降解和氧化聚合反應(yīng)，避免了與咖啡堿的結(jié)合，因此咖啡堿得率較高。4種前處理劑在水溶液中堿性大小順序為碳酸鉀>碳酸鈉>碳酸氫鈉>乙酸鈉，這表明前處理劑在水溶液中的堿性越強(qiáng)，咖啡堿得率也越高，而碳酸鉀得率低于碳酸鈉可能是因為鉀離子促進(jìn)咖啡堿與EGCG形成沉淀的作用較強(qiáng)[19]。因此，相比于傳統(tǒng)工藝中使用的氧化鈣，使用碳酸鈉作為前處理劑時能較大地提高咖啡堿得率，同時所得咖啡堿為白色針狀晶體，品質(zhì)較高。另外，碳酸鈉作為一種常用的食品添加劑，具有綠色安全，經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點。

圖1 不同前處理劑對咖啡堿得率的影響Fig.1 Effect of different pretreatment agent on the yield of caffeine注：不同小寫字母代表具有顯著性差異(P<0.05)

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

由圖2-a可知，升華溫度為180～190 ℃時，咖啡堿得率隨溫度升高變化不明顯，當(dāng)溫度達(dá)到190 ℃后，隨著溫度的升高，咖啡堿得率急劇上升，并在210 ℃時咖啡堿得率達(dá)到最大值，繼續(xù)升高溫度咖啡堿得率反而減低，這說明當(dāng)升華溫度達(dá)到210 ℃左右時，咖啡堿的升華速率已經(jīng)達(dá)到了峰值，繼續(xù)升高溫度不僅會增加能耗，還可能使蒸發(fā)皿內(nèi)的物質(zhì)炭化影響咖啡堿的品質(zhì)和得率。由圖2-b可知，在其他升華條件一定的情況下，咖啡堿得率隨著升華時間的增加而升高，但絕大部分咖啡堿在前20 min內(nèi)升華出來，20 min 后僅有少量咖啡堿升華，繼續(xù)增加升華時間對咖啡堿得率的提升較小，這表明咖啡堿的最佳升華時間在20 min左右。另外，當(dāng)升華溫度為200 ℃時，即使升華50 min，咖啡堿得率仍低于在210 ℃的溫度下升華30 min，這可能是因為部分咖啡堿需要在較高溫度才能被升華出來。由圖2-c可知，隨著碳固比的增加，咖啡堿得率也逐漸增加，當(dāng)碳固比達(dá)到2∶1后，繼續(xù)增加碳酸鈉的添加量，其得率并無明顯提升，而且當(dāng)碳固比為3∶1時咖啡堿得率反而降低，這可能是因為部分未參加反應(yīng)的碳酸鈉蒸干水分后沉積在蒸發(fā)皿內(nèi)阻礙了咖啡堿的升華。

a-升華溫度對得率的影響；b-升華時間對得率的影響；c-碳固比對得率的影響圖2 咖啡堿純化工藝中升華溫度、升華時間、碳固比對得率的影響Fig.2 Effects of sublimation temperature, sublimation time and sodium carbonate-solid ratio on the yield of caffeine

2.3 升華工藝條件的優(yōu)化

在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，確定以升華溫度(A)、升華時間(B)、碳固比(C)為基礎(chǔ)設(shè)計3因素3水平共17 組響應(yīng)面分析實驗，實驗方案設(shè)計及結(jié)果見表2。對咖啡堿得率與升華溫度、升華時間和碳固比之間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y= 71.21+5.36A+10.82B+0.85C+3.27AB-0.5AC+1.96BC-8.73A2-8.52B2-1.64C2，其中Y為咖啡堿得率的預(yù)測值。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 Response surface test plan and results and results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression model

使用Design-Expert軟件對兩兩變量之間的交互作用進(jìn)行分析，做出響應(yīng)曲面圖和等高線圖，響應(yīng)曲面圖中坡度越陡峭，等高線圖越趨近于橢圓形，則表明該交互作用越顯著[20]。由圖3分析可知，AB的響應(yīng)曲面較陡峭，說明升華溫度與升華時間的交互作用顯著，AC和BC響應(yīng)曲面比較平滑，說明升華溫度與碳固比之間的交互作用及升華時間與碳固比之間的交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

利用Design-Expert軟件分析計算出咖啡堿的最佳純化工藝條件：升華溫度214.34 ℃，升華時間27.96 min，碳固比2.33∶1，此時咖啡堿得率達(dá)到76.97%。為了驗證模型的有效性，同時結(jié)合實際操作將最佳工藝條件調(diào)整為升華溫度214 ℃，升華時間28 min，碳固比2.3∶1，在此工藝條件下進(jìn)行3次平行實驗，最終測得咖啡堿得率為76.21%，與預(yù)測值偏差較小，表明基于響應(yīng)面法所得的咖啡堿純化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。

a-升華時間、升華溫度交互作用；b-碳固比、升華溫度交互作用；c-碳固比、升華時間交互作用圖3 各因素交互作用對咖啡堿得率的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on caffeine yield

2.4 茶葉咖啡堿對膠原酶和彈性蛋白酶活性的抑制作用

膠原酶和彈性蛋白酶不僅能夠降解包括膠原蛋白和彈性蛋白在內(nèi)的大部分胞外基質(zhì)蛋白，還能激活其他基質(zhì)金屬蛋白酶活性，加速真皮層細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致人類皮膚真皮層正常的結(jié)構(gòu)和功能被嚴(yán)重?fù)p害，使皮膚產(chǎn)生明顯的皺紋，失去彈性[21]，因此抑制膠原酶和彈性蛋白酶的活性在一定程度上能起到減緩皮膚老化的功效。茶葉咖啡堿對膠原酶的抑制作用如圖4所示，在10～1 000 μg/mL，隨著咖啡堿質(zhì)量濃度的增加，其對膠原酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)，1 000 μg/mL的咖啡堿對膠原酶的抑制率達(dá)到46.72%，而陽性對照組EGCG在1 000 μg/mL時對膠原酶的抑制率為81.65%。

圖4 不同濃度茶葉咖啡堿對膠原酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of different concentrations of tea caffeine on collagenase activity

茶葉咖啡堿對彈性蛋白酶的抑制作用如圖5所示，茶葉咖啡堿對彈性蛋白酶的抑制作用與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，但在相同質(zhì)量濃度下咖啡堿對彈性蛋白酶的抑制作用低于對膠原酶的抑制作用，質(zhì)量濃度為1 000、10 μg/mL的咖啡堿對彈性蛋白酶的抑制率分別為38.43%和3.42%，而EGCG則表現(xiàn)出顯著的抑制能力，1 000、10 μg/mL的EGCG對彈性蛋白酶的抑制率分別為80.23%和14.15%。實驗表明茶葉咖啡堿對膠原酶和彈性蛋白酶具有良好的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，雖然抑制作用低于陽性對照組EGCG，但咖啡堿的體外穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于EGCG[22]，因此適宜濃度的咖啡堿有潛力用于護(hù)膚品中作為膠原酶和彈性蛋白酶的天然抑制劑，起到減緩皮膚老化的效果。

圖5 不同濃度茶葉咖啡堿對彈性蛋白酶活性的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of different concentrations of tea caffeine on elastase activity

3 結(jié)論

本文通過升華法對工業(yè)化生產(chǎn)茶多酚后的萃余液中的咖啡堿進(jìn)行了純化，探究了不同前處理劑對咖啡堿得率的影響，并在單因素實驗基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化了升華工藝。結(jié)果表明，升華法純化茶葉咖啡堿的最佳工藝條件為升華前使用碳酸鈉處理萃余液、碳酸鈉添加量與萃余液固形物的質(zhì)量比為2.3∶1、升華溫度214 ℃、升華時間28 min，在此條件下咖啡堿得率為76.21%，咖啡堿純度>98.5%。升華工藝使用了更加安全廉價的碳酸鈉代替常用的氧化鈣，極大地提高了咖啡堿的得率，增加了咖啡堿的品質(zhì)，同時具有操作簡單、工序步驟少的優(yōu)點，這對茶葉中活性物質(zhì)的綜合提取和工業(yè)化生產(chǎn)咖啡堿具有實際的指導(dǎo)意義。另外，茶葉咖啡堿對膠原酶和彈性蛋白酶具有一定的抑制作用，當(dāng)茶葉咖啡堿的質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，對膠原酶和彈性蛋白酶的抑制率分別達(dá)到46.72%和38.43%，該實驗結(jié)果表明茶葉咖啡堿具有減緩皮膚老化的潛力，適宜濃度的茶葉咖啡堿可添加到更多類型的護(hù)膚品中發(fā)揮其有益作用。