閆風(fēng)智,劉 瑤,蔣 立,任亞萍,楊 森,盧德杰

(桂林醫(yī)學(xué)院a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;b.臨床醫(yī)學(xué)院;c.組織學(xué)胚胎學(xué)教研室,廣西 桂林 541199)

妊娠過程極其復(fù)雜,子宮蛻膜化作為整個妊娠周期的關(guān)鍵步驟,是胚胎植入成功的前提并決定著后期滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲程度,在一定程度上對后期胚泡著床、胎盤形成等一系列過程起到精確調(diào)控作用[1]。細(xì)胞為適應(yīng)機(jī)體生長發(fā)育的需求而進(jìn)行的自我淘汰過程稱為凋亡,這種程序性細(xì)胞死亡模式補(bǔ)充了經(jīng)典的半胱天冬氨酸蛋白酶介導(dǎo)的凋亡模式[2],而且細(xì)胞凋亡在整個妊娠周期中都發(fā)揮了極其重要的作用。RBM10基因是位于X染色體上的RNA結(jié)合蛋白和凋亡相關(guān)基因的剪接調(diào)節(jié)劑[3]。RBM10的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖[4],在細(xì)胞凋亡的進(jìn)程中,caspase-9作為線粒體凋亡通路的起始因子,caspase-9的釋放可激活下游的凋亡因子,最終導(dǎo)致活化的半胱天冬蛋白酶發(fā)生層疊級聯(lián)反應(yīng)引發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。故本實(shí)驗(yàn)研究探討RBM10、caspase-9和eNOS在孕鼠早中期蛻膜組織表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性未交配的昆明鼠35只(SPF級),鼠齡(49±2)d,體重25.0~30.0 g;雄性昆明鼠6只,鼠齡(56±2)d,體重40.0~50.0 g左右(均購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司,SPF級)。動物飼養(yǎng)于光照周期為12 h開燈,12 h關(guān)燈的明暗變化環(huán)境中,每天光照時間段為6∶00~18∶00,相對濕度35.0%~45.0%,室溫保持24℃左右,可自由采食、飲水(飲用水經(jīng)過消毒處理)。本研究獲得桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物委員會的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

RBM10、caspase-9以及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的兔抗鼠多克隆抗體(均購自北京中杉金橋);瑞氏染液(安徽雷根生物);中性樹膠(珠海貝索生物);乙醇,石蠟,福爾馬林DAB(北京中杉金橋);包埋器、石蠟切機(jī)、染色操作臺、恒溫水浴鍋;顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 受孕與組織標(biāo)本采集 將昆明小鼠放入桂林醫(yī)學(xué)院動物房飼養(yǎng)1周后,于第1天晚上用陰道脫落物做陰道脫落細(xì)胞檢查:用消毒棉簽粘取少量生理鹽水輕輕插入雌鼠陰道輕轉(zhuǎn)一圈,取出棉簽涂抹在載玻片上,滴加2~3滴甲醇固定,待載玻片風(fēng)干后,滴加2滴瑞氏染液染色3 min,再滴加PBS緩沖液(pH=7.0)混勻,10 min后,輕甩去掉玻片上染液,自來水沖洗30 s,自然風(fēng)干后封片,顯微鏡下觀察。以觀察到陰道脫落細(xì)胞中出現(xiàn)大量角化上皮細(xì)胞,并且極少見炎癥細(xì)胞者為合籠最佳時機(jī)小鼠。

雌鼠進(jìn)入發(fā)情周期時將雌雄鼠按4∶1合籠,第2天清晨進(jìn)行察看,看到白色陰道栓即確定為孕鼠,記為妊娠第1天,隨機(jī)抽取6.5~9.5 d孕鼠進(jìn)行取材。采用頸椎脫臼法將孕鼠處死,于腹部正中線恥骨聯(lián)合上方0.5 cm處切開暴露子宮及輸卵管,用手術(shù)器械將子宮頸及輸卵管剪斷并且將其完整取出,同時將斷端結(jié)扎,標(biāo)本放置入包埋液中固定保存,標(biāo)注日期、序號。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測 36%的中性甲醛固定子宮組織24 h,石蠟包埋組織后連續(xù)切片(5μm),60℃恒溫箱烤片1 h左右脫蠟,乙醇水化后蒸餾水沖洗1次,時間1 min,用乙二胺四乙酸抗原修復(fù)組織切片,蒸餾水沖洗,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min,PBS洗3次,5 min/次,BSA封閉30 min,然后加入稀釋好的一抗(RBM10稀釋度1∶200,eNOS稀釋度1∶100,caspase-9稀釋度1∶50)50μl,37℃孵育1 h,用PBS(pH=7.4)沖洗3次,5 min/次,加入二抗37℃孵育30 min后,用PBS緩沖液沖洗3次,5 min/次,加DAB液(100μl)顯微鏡下觀察,顯色后用蒸餾水沖洗切片,蘇木素復(fù)染30 s,自來水沖洗10 min,酒精梯度脫水,分別為75%酒精5 min,85%酒精5 min,95%酒精5 min,100%酒精8 min,然后二甲苯透明2×10 min后,放于通風(fēng)廚中風(fēng)干,樹膠封片,顯微鏡下觀察并采集圖片,之后用IPP 6.0版本圖像軟件標(biāo)記,測定各組光密度值即為各組蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RBM10、caspase-9與eNOS在組織中的表達(dá)定位

Caspase-9集中表達(dá)于蛻膜組織的腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)及部分基質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì);RBM10表達(dá)于蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞核,合體滋養(yǎng)層細(xì)胞胞核,腺細(xì)胞胞核,基質(zhì)細(xì)胞胞核;eNOS在基蛻膜細(xì)胞胞質(zhì)呈弱陽性表達(dá)。表達(dá)陽性為染色呈棕褐色、棕黃色。見圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測RBM10,Caspase-9和eNOS的表達(dá)(20×)

2.2 RBM10,caspase-9與eNOS表達(dá)量

Caspase-9在孕鼠8.5 d的蛻膜組織中表達(dá)高于6.5 d、9.5 d(P<0.05);RBM10在孕鼠8.5 d的子宮蛻膜中表達(dá)高于6.5 d,且在8.5 d時達(dá)高峰后下降,9.5 d時的表達(dá)低于8.5 d(P<0.05);eNOS在孕鼠蛻膜化的6.5 d、8.5 d和9.5 d時,呈弱陽性表達(dá),且8.5 d時的表達(dá)水平高于9.5 d(P<0.05)。見圖2。

圖2 RBM10、caspase-9、eNOS表達(dá)的灰度分析(?P<0.05,??P<0.01)

3 討論

蛻膜化被認(rèn)為是建立可接受的子宮內(nèi)膜微環(huán)境以支持和維持妊娠的關(guān)鍵過程[6]。目前調(diào)控細(xì)胞凋亡的研究主要集中于線粒體與死亡受體兩種途徑[7],caspase-9是細(xì)胞凋亡線粒體通路的關(guān)鍵起始因子[8]。在本研究中,Caspase-9在妊娠早中期發(fā)育過程中,隨胚胎發(fā)育表達(dá)逐漸升高,在8.5 d時,表達(dá)最高,但到第9.5天又很快下降,提示妊娠8.5 d時,子宮蛻膜細(xì)胞以凋亡為主。caspase-9在早中期蛻膜組織細(xì)胞中的表達(dá)變化,提示caspase-9在蛻膜形成的早期已經(jīng)啟動凋亡程序并為蛻膜增厚及胚胎的順利定位做準(zhǔn)備,但在第8.5天處于凋亡表達(dá)最高,根據(jù)增殖與凋亡的動態(tài)平衡,胚胎第8.5天也是子宮蛻膜增殖生長發(fā)育最活躍的時間點(diǎn)。因此,推測在蛻膜化中主要是通過caspase9的凋亡通路而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。RBM10在子宮蛻膜中的表達(dá)量先升高,在胚胎的8.5 d達(dá)到高峰后下降,提示RBM10在蛻膜化的早中期通過細(xì)胞的增殖與凋亡來推進(jìn)妊娠過程的發(fā)展。胚胎干細(xì)胞和小鼠腭細(xì)胞因缺乏RBM10,細(xì)胞生長緩慢[9],同樣說明RBM10的表達(dá)與細(xì)胞增殖有關(guān)。圖2結(jié)果顯示,caspase-9和RBM10呈同步變化,推測caspase-9與RBM10的表達(dá)可能具有相關(guān)性,caspase-9與RBM10共同參與早中期蛻膜化的發(fā)生,兩者可能共同協(xié)調(diào),完成蛻膜的增殖和凋亡活動,維持蛻膜化過程中蛻膜細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞之間的動態(tài)平衡,使蛻膜的基質(zhì)細(xì)胞、血管和腺細(xì)胞的生長發(fā)育至一定的水平,為胚胎植入及其生長發(fā)育提供了充分的準(zhǔn)備。

蛻膜化進(jìn)程中通常伴隨血管改變,而這對后續(xù)胚泡著床及胎盤形成至關(guān)重要。RBM10表達(dá)與VEGF的表達(dá)增加相關(guān),RBM10自身磷酸化也支持RBM10在調(diào)節(jié)血管生成中的作用,RBM10表達(dá)異常導(dǎo)致胚胎早期死亡[10]。這可能意味著RBM10參與了早中期胚胎發(fā)育過程中血管的建立。Caspase-9在基質(zhì)細(xì)胞中明顯高表達(dá),隨著妊娠進(jìn)展基質(zhì)細(xì)胞承擔(dān)啟動新血管形成任務(wù)。本課題組前期研究顯示eNOS在滋養(yǎng)層細(xì)胞之間的血管、胚外中胚層細(xì)胞之間毛細(xì)血管內(nèi)皮均有較強(qiáng)表達(dá),而胚外中胚層細(xì)胞將發(fā)育為絨毛膜的組織,說明在胚胎著床后,NO發(fā)揮著重要作用。圖1顯示,eNOS表達(dá)于基蛻膜細(xì)胞胞質(zhì),隨著蛻膜化進(jìn)展,基蛻膜將參與胎盤形成。提示eNOS在胎盤新生血管及維持血管擴(kuò)張以提供豐富血液,對促進(jìn)胚胎生長發(fā)育方面具有重要意義。妊娠期間的子宮肌層內(nèi)的NOS釋放NO,與其他的因子共同維持孕期子宮肌層的舒張與血管構(gòu)建。RBM10與caspase-9在蛻膜化過程中表達(dá)規(guī)律,提示二者可能共同參與了胚泡的著床及血管構(gòu)建進(jìn)程。而eNOS在妊娠早期表達(dá)量低,少量NO可能參與著床處血管壁的構(gòu)建。

蛻膜化在整個妊娠階段起到奠基作用并在其辨別胚胎質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用。敲除小鼠ES細(xì)胞中的RBM10導(dǎo)致細(xì)胞生長急劇下降,并影響胚狀體的形成[11],提示RBM10在妊娠早期發(fā)揮重要作用。eNOS通過調(diào)節(jié)NO的含量來調(diào)控血管,NO作為細(xì)胞的信號分子,在維持子宮蛻膜化、新血管形成方面發(fā)揮作用[12]。eNOS在胚胎蛻膜組織中的表達(dá)變化,推測早期胎盤還未完全形成,血液交換較少,胚胎處于相對缺氧的環(huán)境中,隨后母胎之間營養(yǎng)物質(zhì)快速交換,循環(huán)逐步形成,此時eNOS表達(dá)水平的增加為NO合成奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)胚胎發(fā)育周期規(guī)律提示,caspase-9可能參與了胚胎植入與神經(jīng)溝的建立過程;凋亡因子caspase-9與RBM10在胚胎蛻膜組織的表達(dá)變化規(guī)律,提示小鼠妊娠的第8.5天是非常有意義的1天,此時胚胎植入完成,蛻膜生長包裹整個胚胎,為胚胎的生長發(fā)育提供了適宜的環(huán)境及充足的營養(yǎng)供應(yīng)。同時期小鼠的器官原基已建立,增殖的細(xì)胞可通過細(xì)胞凋亡途徑來達(dá)到維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)環(huán)境和機(jī)體生長發(fā)育的需要。Caspase-9和RBM10在蛻膜的高表達(dá)提示凋亡因子可能參與了胚胎三胚層及神經(jīng)溝的構(gòu)建過程。人類妊娠過程中胚胎植入時間比孕鼠晚,人類需要更長植入過程及器官原基發(fā)育時間,而這將決定整個妊娠的質(zhì)量及出生后疾病發(fā)生概率。

本研究結(jié)果說明RBM10,caspase-9和eNOS在早中期蛻膜化過程中共同調(diào)節(jié)妊娠子宮蛻膜細(xì)胞的增殖與凋亡及胚胎生長發(fā)育過程。子宮蛻膜化對于整個妊娠周期的發(fā)展起到極為關(guān)鍵作用,而內(nèi)膜受損則會導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)、不孕不育、子宮內(nèi)膜疾病及子宮內(nèi)膜異位癥結(jié)節(jié)的發(fā)生等。凋亡因子RBM10,caspase-9在子宮蛻膜組織的表達(dá)變化類似,推測其可能具有相關(guān)性。