彭佳聰,官宏莉,李媛媛,蔣莉萍,彭小紅

(桂林醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體寄生蟲學教研室,廣西 桂林 541199)

瘧疾是世界上嚴重危害公共衛(wèi)生的三大傳染病之一,主要通過感染瘧原蟲的雌性按蚊叮咬而傳播。據(jù)WHO估計,2019年全球共有2.29億人感染瘧疾,導致約40.9萬人死亡,其中2/3為撒哈拉以南非洲地區(qū)5歲以下兒童[1]。近年來,盡管瘧疾防控已取得巨大進展,但瘧疾患病及死亡人數(shù)仍居高不下,其原因主要是殺蟲劑及抗瘧藥物耐藥性的擴散[2-3]。因此,新型抗瘧藥物和瘧疾疫苗的研制變得尤為迫切。

過去70多年來,全球在瘧疾疫苗研制方面進行了艱苦的努力,但尚未開發(fā)出一種安全、有效的瘧疾疫苗[4]。由于瘧原蟲抗原具有高度多態(tài)性,以瘧原蟲表面優(yōu)勢抗原為基礎的亞單位疫苗產生的免疫保護性受限[5-6],使得近年來瘧疾疫苗的研發(fā)焦點逐漸轉移至全蟲疫苗。實驗證實,瘧原蟲紅內期全蟲減毒疫苗對瘧原蟲再感染具有免疫保護作用,但其免疫過程中可能因減毒不完全而導致接種者出現(xiàn)瘧原蟲感染[7-8]。因此,全蟲滅活疫苗或許能成為紅內期瘧疾疫苗研制的突破點。本研究在瘧原蟲感染康復期小鼠紅細胞內發(fā)現(xiàn)類似Howell-Jolly小體的單點狀深紫染顆粒,采用約氏瘧原蟲感染小鼠模型,制備及富集該顆粒,并以此為抗原免疫小鼠,檢測其接種安全性和免疫保護性,為其作為瘧原蟲紅內期全蟲滅活疫苗的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康清潔級雌性BALB/c小鼠40只,6~8周齡,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司;健康普通級雌性昆明株小鼠40只,6~8周齡,購自桂林醫(yī)學院實驗動物中心;約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii,P.yoelii)BY265株,為本室長期保存蟲株;甲醇購自西隴科學股份有限公司;姬姆薩染液購自珠海貝索生物技術有限公司;磷酸氯喹(chloroquine phosphate,CQ)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;生理鹽水購自廣西裕源藥業(yè)有限公司;磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS,0.1 mol/L,pH 7.5)購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠接種感染 取昆明株小鼠,按常規(guī)方法經(jīng)腹腔接種P.yoeliiBY265株感染的紅細胞(infected red blood cells,iRBCs),接種后第3天尾靜脈取血,薄血膜涂片,甲醇固定后姬姆薩染色,光鏡下觀察小鼠瘧原蟲感染情況,計數(shù)紅細胞的瘧原蟲感染率,即原蟲血癥百分比。

1.2.2 抗原獲取 采取以下3種方法制備類似Howell-Jolly小體顆?？乖?每組5只昆明株小鼠。①CQ-ITV法(基于磷酸氯喹的感染后控制疫苗):按照參考文獻[9]構建CQ-ITV免疫小鼠模型。末次免疫后第30天,計數(shù)P.yoelii感染小鼠的原蟲血癥所占百分比,根據(jù)計數(shù)結果,用生理鹽水將P.yoelii感染小鼠的全血稀釋至103iRBCs/100μl,尾靜脈注射100μl攻擊小鼠;攻擊后第2天起,每日查血,計數(shù)小鼠原蟲血癥及類似Howell-Jolly小體顆粒所占的比例。②高劑量接種法:計數(shù)P.yoelii感染小鼠的原蟲血癥所占百分比,用生理鹽水將P.yoelii感染小鼠的全血稀釋至108iRBCs/100μl,小鼠尾靜脈注射接種100μl;3 h后,腹腔注射100μl PBS稀釋的CQ(0.8 mg/100μl),此后每日同一時間注射CQ,并查血計數(shù)小鼠原蟲血癥及類似Howell-Jolly小體顆粒所占的比例。③感染后CQ治療法:小鼠腹腔注射100μl P.yoelii感染小鼠的全血,接種后第3天起,每日查血觀察小鼠原蟲血癥。待原蟲血癥約15%時,腹腔注射100μl PBS稀釋的CQ(0.8 mg/100μl)進行治療,此后每日同一時間注射CQ,并查血計數(shù)小鼠原蟲血癥及類似Howell-Jolly小體顆粒所占的比例。

選擇完全無瘧原蟲感染且含類似Howell-Jolly小體顆粒最多的時間點取小鼠全血,4℃,離心15 min,去除血漿,留取紅細胞,PBS洗滌3次,5 min/次,加入與血漿等量PBS重懸,獲得類似Howell-Jolly小體顆?？乖?。

1.2.3 接種安全性及保護性檢測 計數(shù)以上類似Howell-Jolly小體顆粒抗原含量,用生理鹽水將抗原稀釋至103個/100μl及105個/100μl,分別尾靜脈注射進行免疫接種兩組BALB/c小鼠(5只/組,100μl/只),共免疫3次,每次間隔14 d。末次免疫后第30天,計數(shù)小鼠的原蟲血癥(P.yoelii感染的紅細胞)所占百分比;用生理鹽水將P.yoelii感染小鼠的全血稀釋至103iRBCs/100μl,尾靜脈注射100μl攻擊小鼠,同時另取3只空白(未經(jīng)免疫接種)BALB/c小鼠,同樣方法進行攻擊作對照,攻擊后第3天起,每日查血檢查小鼠瘧原蟲感染情況。

1.2.4 凍存后抗原的接種安全性及免疫保護性檢測將1.2.2獲得的抗原于-20℃凍存30 d。免疫前37℃水浴鍋中迅速解凍,計數(shù)抗原含量,用生理鹽水將抗原稀釋至105個/100μl,尾靜脈注射100μl稀釋抗原對昆明株小鼠進行免疫接種(5只/組,100μl/只),共免疫3次,每次間隔14 d,另取3只空白小鼠同樣方法注射100μl PBS作對照。末次免疫后第30天,用1.2.1制備的103iRBCs/100μl攻擊小鼠,攻擊后第2天起,每日查血檢查小鼠瘧原蟲感染情況,檢測凍存后抗原免疫保護性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8軟件完成實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析與作圖,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 類似Howell-Jolly小體的單點狀深紫染顆粒

小鼠瘧原蟲感染康復期,部分紅細胞內出現(xiàn)類似Howell-Jolly小體的特殊單點狀深紫染顆粒,其形態(tài)不同于紅內期瘧原蟲,但這些紅細胞的基本形態(tài)與正常紅細胞無異,將該顆粒命名為侵入后失活瘧原蟲(invaded and inactivatedPlasmodium,IIP)。詳見圖1。

圖1 IIP及紅內期瘧原蟲光鏡下形態(tài)(100×)

2.2 IIP的獲取情況

采用CQ-ITV法、高劑量接種法及感染后CQ治療法均成功獲取IIP,其中CQ-ITV法最早可于接種后第59天出現(xiàn)IIP,高劑量接種法最早可于接種后第3天出現(xiàn)IIP,但小鼠外周血僅見IIP的時間差異較大,從7 d至18 d不等;感染后CQ治療法最早可于接種后第12天出現(xiàn)IIP,第14天開始,外周血僅見IIP。

2.3 IIP接種的安全性

103個IIP/100μl的低劑量組,小鼠免疫全程均未出現(xiàn)瘧原蟲感染,而105個IIP/100μl的高劑量組,小鼠首次免疫后第3至8天相繼出現(xiàn)感染。原蟲血癥峰值僅7%。

2.4 IIP免疫的原蟲血癥峰值

實驗組與對照組小鼠均于攻擊后第3天出現(xiàn)原蟲血癥,隨著時間的增加,全部小鼠出現(xiàn)瘧原蟲感染,原蟲血癥也逐漸上升,兩組小鼠原蟲血癥對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但是,未免疫組原蟲血癥于攻擊后第12至15天達到峰值,隨后逐步下降,而免疫組原蟲血癥在第8至22天維持在較低水平,于第23天起迅速下降。此外,免疫組原蟲血癥峰值(43.8%)明顯低于未免疫組(56.1%)。詳見圖2。

圖2 IIP免疫保護性檢測

2.5 IIP凍存后的安全性及免疫保護性

接種凍存后IIP小鼠3次免疫過程中均未出現(xiàn)瘧原蟲感染。免疫的實驗組與對照組小鼠均于iRBCs攻擊后第5天出現(xiàn)原蟲血癥,免疫的實驗組原蟲血癥于第10天達到峰值,隨后逐漸下降,至第23天完全恢復;未免疫組原蟲血癥于第12天達到峰值,但小鼠分別于第8、10、16天死亡;此外,免疫組原蟲血癥峰值明顯低于未免疫組。詳見圖3。

圖3 IIP凍存后的免疫保護性檢測

3 討論

目前在研的瘧疾全蟲疫苗均為減毒疫苗,除了制備條件,安全性也是限制其應用的主要原因[10]。紅外期基因減毒子孢子疫苗(genetically-attenuated parasites,GAP)的人體實驗中,第一批接種惡性瘧原蟲p52-/p36-GAP的6名志愿者之一出現(xiàn)了瘧原蟲感染[11]。感染后控制疫苗(infection and treatment vaccine,ITV)免疫過程中低劑量的藥物治療也可能導致受試者出現(xiàn)瘧原蟲感染,提高藥物濃度可降低感染風險,但高濃度藥物可能會引起不良反應,殘留藥物也可能導致不良反應發(fā)生[12]。

本研究建立約氏瘧原蟲感染小鼠模型,在小鼠感染瘧原蟲康復期的部分紅細胞內發(fā)現(xiàn)了單點狀深紫染顆粒(圖1)。起初以為該顆粒是Howell-Jolly小體,它是位于成熟紅細胞或晚幼紅細胞胞質中的紫紅色圓形顆粒,多見于溶血性貧血。然而,在CQ-ITV免疫過程中也發(fā)現(xiàn)了該物質,此時小鼠處于正常生理狀態(tài),并無貧血及紅細胞增生癥狀。CQ主要作用于瘧原蟲紅內期裂殖體,對早期滋養(yǎng)體作用并不明顯[13]。因此,上述特殊顆粒不是CQ直接對瘧原蟲殺傷形成的,而可能為侵入紅細胞過程中被免疫系統(tǒng)殺傷失活的瘧原蟲。

通過比較CQ-ITV法、高劑量接種法以及感染后CQ治療法3種制備方法發(fā)現(xiàn),CQ-ITV法因其3次免疫逐步加強了對再感染的保護效果,攻擊后一般不會出現(xiàn)瘧原蟲感染,但此法耗時較長,從接種到獲取IIP至少需要59 d。而CQ治療法小鼠狀態(tài)穩(wěn)定,且僅需約14 d即可獲得IIP,因此后續(xù)實驗均采用此法制備。低劑量IIP(103個IIP/100μl)接種小鼠過程中均未出現(xiàn)瘧原蟲感染,而高劑量IIP(105個IIP/100μl)首次接種即出現(xiàn)感染,但是小鼠原蟲血癥峰值僅為7%,說明IIP的制備仍有待改進。本研究所采取的IIP富集方式可能存在血涂片未見iRBCs,但體內仍有少量感染瘧原蟲未被發(fā)現(xiàn)的情況。

最后,在小鼠末次免疫后第30天給予免疫組與未免疫組小鼠103iRBCs/100μl攻擊發(fā)現(xiàn),兩組小鼠均于攻擊后第3天出現(xiàn)原蟲血癥,雖然其原蟲血癥對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但免疫組原蟲血癥峰值明顯低于未免疫組,說明IIP具有一定的免疫保護性,可能因免疫能力不夠導致其未出現(xiàn)完全免疫保護作用。此外,-20℃下,IIP凍存30 d后稀釋至105個IIP/100μl后免疫小鼠過程中均未出現(xiàn)瘧原蟲感染,攻擊后原蟲血癥水平明顯低于未免疫組,說明凍存后IIP具備100%的接種安全性,提示高免疫劑量可產生更好的免疫保護作用。

本研究未取得理想效果,還有很多問題有待深入探討。首先,康復期紅細胞內單點狀深紫染顆粒是否為侵入后失活瘧原蟲值得進一步確定,后續(xù)可采用質譜分析,明確該顆粒的成分。其次,如果確定了該顆粒為瘧原蟲成分,其瘧原蟲相關抗原是否可表達于侵入紅細胞表面。如果明確了上述兩個問題,可采用流式細胞術分選方式獲取高純度IIP,以確保免疫過程的安全性,同時通過提高免疫劑量驗證其保護性。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)了瘧原蟲感染康復期宿主紅細胞內的特殊顆粒物質,通過制備并富集證實了該顆粒具有一定的免疫保護性。提示IIP可能是潛在的瘧疾紅內期滅活全蟲疫苗,這也為新型有效瘧疾疫苗的設計提供了新的思路。