陳泳蓓，陸俏岑，何韻怡，陳柏希，吳 岳，劉洪波③

(桂林醫(yī)學(xué)院a.第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；b.臨桂臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541199)

腸道病毒被認(rèn)為是引起1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)的主要致病因素之一，其中以柯薩奇病毒B4型(CVB4)最為常見[1]。研究表明，CVB4感染與T1DM發(fā)病存在相關(guān)性，但CVB4致T1DM的機(jī)制仍未明確。1979年，Yoon等[2]從1名T1DM患者的胰腺組織中分離出CVB4，隨后在T1DM患者中發(fā)現(xiàn)了CVB4的結(jié)構(gòu)蛋白VP1[3]。因此，認(rèn)為VP1蛋白可能是CVB4引起T1DM的重要分子和CVB4功能和表位所依托的分子[4]。筆者以從胰島中分離得到的CVB4株的VP1蛋白作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行生物信息分析，預(yù)測其基本理化性質(zhì)、相關(guān)功能結(jié)構(gòu)以及B細(xì)胞線性表位，為腸道病毒引起T1DM的機(jī)制研究提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 CVB4 VP1氨基酸序列獲取和生物信息工具

從NCBI數(shù)據(jù)庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載28條CVB4全長氨基酸序列，并以新發(fā)T1DM患者胰島中分離得到的CVB4 Tuscany株[3](登錄號(hào)為ABF19105.1)VP1蛋白為研究對(duì)象，利用Bioedit、DNAstar、B細(xì)胞線性表位預(yù)測在線服務(wù)器ABCpred(https：∥ webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC _submission.html)、免疫表位數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站IEDB(http：∥tools.iedb.org/bcell/)以及生物信息學(xué)門戶ExPASy(https：∥www.expasy.org/proteomics)提供的多種在線工具對(duì)其進(jìn)行分析[5]。

1.2 CVB4 VP1蛋白的基本理化性質(zhì)分析

利用Bioedit對(duì)VP1氨基酸的組成進(jìn)行分析。利用ProtParam預(yù)測VP1的分子組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、消光系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)，以及在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞、酵母和大腸桿菌中的半衰期等。

1.3 CVB4 VP1蛋白的結(jié)構(gòu)功能和B細(xì)胞線性表位預(yù)測

以VP1為研究對(duì)象，應(yīng)用SignalP進(jìn)行信號(hào)肽分析；Tmpred和TMHMM進(jìn)行跨膜螺旋預(yù)測；NetPhos分析磷酸化位點(diǎn)；MotifScan分析乙?；稽c(diǎn)；Net-NGlyc分析糖基化位點(diǎn)；TargetP和NetNES分析亞細(xì)胞定位；SMOPA和Predictprotein分析二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用ABCpred和IEDB對(duì)線性B細(xì)胞表位進(jìn)行綜合預(yù)測，利用MEGA將預(yù)測到的表位序列與下載的28條CVB4全長氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，分析表位保守性。

2 結(jié)果

2.1 CVB4 VP1 的氨基酸組成

應(yīng)用Bioedit軟件對(duì)VP1的氨基酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，VP1由284個(gè)氨基酸組成，其中Ser 10.18%、Thr 9.12%、Val 7.37%，這3種氨基酸含量最多。見圖1。

圖1 VP1氨基酸組成

2.2 CVB4 VP1的理化性質(zhì)

利用ProtParam工具預(yù)測，VP1蛋白的分子組成為C1410H2173N395O434S15，理論相對(duì)分子質(zhì)量為32 083.05，等電點(diǎn)為8.31。若全部胱氨酸殘基以Cys形式形成二硫鍵，則其在水溶液中(A280 nm)的摩爾消光系數(shù)為46 090 L·mol-1·cm-1；若所有二硫鍵打開，其在水溶液中(A280 nm)的摩爾消光系數(shù)為45 840 L·mol-1·cm-1。若VP1的N端為Gly，在哺乳動(dòng)物體外網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)>20 h，在大腸桿菌內(nèi)>10 h，其不穩(wěn)定系數(shù)為46.20，屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.3 CVB4 VP1蛋白的功能相關(guān)結(jié)構(gòu)

應(yīng)用SignalP分析，提示VP1為非分泌性蛋白。應(yīng)用Tmpred和TMHMM進(jìn)行跨膜螺旋分析，發(fā)現(xiàn)VP1無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。應(yīng)用NetPhos分析，發(fā)現(xiàn)VP1有36個(gè)磷酸化位點(diǎn)。應(yīng)用MotifScan分析，發(fā)現(xiàn)VP1無乙?；稽c(diǎn)。應(yīng)用Net-NGlyc進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析，顯示VP1有2個(gè)糖基化位點(diǎn)。應(yīng)用TargetP進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，提示VP1定位于線粒體。應(yīng)用NetNES核定位分析，發(fā)現(xiàn)VP1無核定位信號(hào)。

2.4 CVB4 VP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原表位

應(yīng)用SMOPA和Predictprotein在線工具對(duì)VP1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)VP1的螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲分別占29.82%、24.56%、10.18%、35.44%。運(yùn)用Predictprotein分析，發(fā)現(xiàn)VP1的螺旋、折疊、無規(guī)則卷曲分別占8.77%、23.86%、67.37%。結(jié)合兩種方法的預(yù)測分析，可知螺旋和折疊是VP1蛋白的剛性支撐，無規(guī)則卷曲是VP1的主要結(jié)構(gòu)，是VP1抗原表位存在的可能位置。

2.5 VP1蛋白的B細(xì)胞線性表位

應(yīng)用ABCpred預(yù)測VP1蛋白的B細(xì)胞線性表位，以0.85為閾值，結(jié)果有10條肽入選(表1)。在線預(yù)測網(wǎng)站IEDB分析，得到VP1蛋白的β-轉(zhuǎn)角、表面可及性、柔韌性、抗原性、親水性等抗原表位數(shù)據(jù)(圖2)。綜合ABCpred預(yù)測和IEDB分析，推測B細(xì)胞線性表位較可能位于33～49、120～136、141～157、200～216、235～251位氨基酸區(qū)段。利用MEGA對(duì)這5條預(yù)測到的優(yōu)勢表位序列進(jìn)行型內(nèi)保守性分析，顯示這些表位均具有較高的保守性，其中141～157、200～216位氨基酸區(qū)段在CVB4內(nèi)完全保守，33～49、120～136、235～251位氨基酸區(qū)段均僅存在1個(gè)氨基酸突變。見圖3。

表1 ABCpred預(yù)測VP1的線性B細(xì)胞表位

A：β-轉(zhuǎn)角；B：表面可及性；C：柔韌性區(qū)域；D：抗原性；E：親水性圖2 IEDB分析VP1的抗原表位

圖3 MEGA分析優(yōu)勢表位序列的保守性

3 討論

T1DM是一種受遺傳和環(huán)境因素共同影響的自身免疫病，以T細(xì)胞介導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷引起自身免疫破壞為特征。腸道病毒感染在T1DM發(fā)病中具有重要作用，特別是CVB4[6-7]。VP1是腸道病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，新發(fā)T1DM患者的胰島組織中能檢測出VP1蛋白，且其表達(dá)高于對(duì)照組[8]。提示VP1與T1DM發(fā)病可能存在相關(guān)性。本文以新發(fā)T1DM患者胰島中分離的CVB4 Tuscany株為研究對(duì)象，通過多種在線工具分析CVB4 VP1蛋白的基本理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)功能特征、B細(xì)胞線性表位以及其三維結(jié)構(gòu)，直觀地顯示了CVB4 VP1蛋白的生物學(xué)信息，為CVB4致T1DM的相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)參考。

腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1與酪氨酸磷酸酶IA-2存在相同序列“ALTAV”[9]。本研究中，28條CVB4全長氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果也顯示了“ALTAV”序列在CVB4中完全保守。信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，“ALTAV”只部分涵蓋了預(yù)測到的優(yōu)勢表位33～49 aa(AVETGHTSQVDPSDTM)，并不在主要抗原表位上。提示CVB4通過分子模擬機(jī)制引起T1DM的可能性不高，但有可能是通過表位擴(kuò)展，在持續(xù)感染過程中暴露了該隱匿表位，引起糖尿病性自身免疫反應(yīng)；這需要構(gòu)建克隆表達(dá)“ALTAV”序列，并利用NOD小鼠加以驗(yàn)證[10]。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示CVB4 VP1蛋白以無規(guī)則卷曲為主，無規(guī)則卷曲往往是蛋白質(zhì)功能和構(gòu)象的基本結(jié)構(gòu)，同時(shí)B細(xì)胞線性表位也多位于無規(guī)則卷曲所在的位置。目前，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析篩選腸道病毒B細(xì)胞線性表位的報(bào)道較多[11-13]，但關(guān)于CVB4鮮有報(bào)道。本研究利用ABCpred預(yù)測CVB4 VP1的線性B細(xì)胞表位，并通過免疫表位數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站IEDB提供的多種在線工具分析了VP1蛋白β-轉(zhuǎn)角、表面可及性、柔韌性、抗原性以及親水性5個(gè)參數(shù)，最后獲得了5條保守的優(yōu)勢線性B細(xì)胞表位，為后期疫苗開發(fā)提供參考。

CVB4的VP1蛋白可能在病毒感染胰島細(xì)胞過程中扮演重要的信號(hào)角色。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，CVB4 VP1存在線粒體定位信號(hào)，提示CVB4感染胰島細(xì)胞后，可能通過影響線粒體功能而導(dǎo)致胰島細(xì)胞死亡，引起T1DM的發(fā)生[14]。通過分析發(fā)現(xiàn)，CVB4 VP1蛋白存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而病毒的感染最重要的信號(hào)是一系列蛋白質(zhì)的磷酸化[15]。提示CVB4在感染過程中，可通過對(duì)VP1特定位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化，從而開啟或關(guān)閉下游的一系列信號(hào)，引起胰島細(xì)胞死亡。

CVB4引起T1DM的機(jī)制尚未明確，本研究利用多種在線分析工具對(duì)CVB4 Tuscany分離株VP1蛋白進(jìn)行了一系列分析，這些分析結(jié)果將有助于研究腸道病毒致T1DM的作用及機(jī)制。