高涵 林崇韜

牙周炎是發(fā)生于牙齒周圍組織的慢性炎癥性疾病，以牙齦卟啉單胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg）為代表的牙周致病菌可以分泌多種毒力因子，激發(fā)宿主固有免疫應(yīng)答，引起炎癥性牙槽骨吸收[1]。牙周炎導(dǎo)致的結(jié)締組織喪失與牙槽骨吸收已成為成人失牙的首要原因，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，抑制炎癥進(jìn)程中牙槽骨吸收并促進(jìn)牙槽骨再生有著重要意義。

MicroRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA，研究顯示很多miRNA可以調(diào)節(jié)骨發(fā)育，成骨分化，及骨質(zhì)疏松等病理生理進(jìn)程[2]，其中miR-34a是較受關(guān)注的miRNA之一，其編碼基因位于染色體1p36.23區(qū)域[3]。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)miR-34a可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，并且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-34a可以促進(jìn)大鼠顱骨缺損區(qū)新骨形成[4，5]。另有研究提示miR-34a可能具有抗炎作用，例如Jiang[6]等證明巨噬細(xì)胞中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答反應(yīng)受miR-34a抑制，Ogata[7]等發(fā)現(xiàn)炎癥牙齦組織中miR-34a表達(dá)量是健康牙齦組織的0.51倍。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)旨在探索miR-34a是否具有促進(jìn)骨形成、抑制炎性牙槽骨吸收的作用。

資料和方法

1.主要材料和儀器：Pg W83（首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所惠贈(zèng)），MG63細(xì)胞（ATCC?CRL-1427TM），Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美國），miR-34a擬態(tài)物及陰性對(duì)照（吉瑪公司，蘇州），RNA提取試劑盒（Magen公司，廣州），普通逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（Takara公司，日本），miR-34a特異性逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（吉瑪公司，蘇州），胰酶（Hyclone公司，美國），HG-DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（PAA公司，奧地利），厭氧菌培養(yǎng)皿（康泰公司，溫州），腦心浸液（Gibco公司，美國）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：復(fù)蘇MG63細(xì)胞于HG-DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（5% CO2，37℃），每隔2天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并換液，待細(xì)胞約鋪滿底面積80%時(shí)按1:3傳代。

3.細(xì)菌培養(yǎng)：復(fù)蘇Pg模式株W83并劃線法接種于厭氧菌培養(yǎng)皿中，37℃厭氧（80% N2，10% H2，10% CO2）培養(yǎng)一周。挑取單個(gè)菌落接種于液體培養(yǎng)基中，置厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48h后達(dá)對(duì)數(shù)生長期時(shí)離心收集細(xì)菌，PBS洗滌并重懸，分光光度計(jì)測量于600nm處吸光度值，以感染復(fù)數(shù)MOI＝100∶1感染細(xì)胞。

4.轉(zhuǎn)染：以3×105細(xì)胞/孔為密度接種MG63細(xì)胞于6孔板，孵育24h后按試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟簡述如下：轉(zhuǎn)染前用1.5ml無血清培養(yǎng)液饑餓各組細(xì)胞30min，將5ul的Lipofectamine2000和5ul的miR-34a mimics、miR-34a mimic NC分別稀釋于250ul無血清培養(yǎng)液中，室溫靜置5min后將二者輕柔混勻，再靜置20min后加入相應(yīng)組別中，放入培養(yǎng)箱孵育6h后更換為有血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.熒光照相：將miR-34a FAM轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法如前，轉(zhuǎn)染后放入培養(yǎng)箱孵育6h后棄液，PBS輕輕沖洗，調(diào)節(jié)倒置熒光顯微鏡至激發(fā)光為藍(lán)光，鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光。

6.熒光定量PCR：收集各組細(xì)胞后按試劑盒要求提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用相應(yīng)RT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測miR-34a及其內(nèi)參U6基因表達(dá)量的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min后，95℃12s，62℃40s共40個(gè)循環(huán)，檢測成骨相關(guān)因子基因表達(dá)量的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30s后，95℃5s，60℃20s共40個(gè)循環(huán)。每組目的基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量以2-ΔΔct（ct值表示達(dá)到檢測熒光閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)）表示。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物基因序列

7.統(tǒng)計(jì)分析：應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，行組間配對(duì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α＝0.05。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1.熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果：向健康MG63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的miR-34a擬態(tài)物，6h后置于倒置激發(fā)光為藍(lán)光的熒光顯微鏡下觀察，可見明顯綠色熒光（圖1）。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果（×40,×100）

2.將miR-34a擬態(tài)物轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后miR-34a擬態(tài)物組成骨相關(guān)因子mRNA表達(dá)量升高：向MG63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)物及其陰性對(duì)照物48h、72h后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組較陰性對(duì)照組中miR-34a基因表達(dá)量明顯升高，表明miR-34a模擬物成功轉(zhuǎn)染至實(shí)驗(yàn)組（圖2A，miR-34a vs NC：*P＜0.05，**P＜0.01）。

為明確miR-34a對(duì)成骨樣細(xì)胞成骨分化的影響，我們向MG63細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)物及其陰性對(duì)照物，并檢測兩組細(xì)胞中特異性成骨相關(guān)因子Runx2、SP7及COLⅠ基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)物48h、72h后，細(xì)胞內(nèi)成骨標(biāo)志因子基因表達(dá)水平均較對(duì)照組高（圖2B，miR-34a vs NC：*P＜0.05，**P＜0.01）。

3.感染MG63細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平升高，且向這種感染細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)物后，成骨相關(guān)因子mRNA表達(dá)量降低：對(duì)受Pg感染48及72h的MG63細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)感染細(xì)胞中miR-34a表達(dá)量較對(duì)照組高（圖3A，Pg vs Control：*P＜0.05，**P＜0.01）。

圖2 A：轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)物48及72h后，RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平；B：轉(zhuǎn)染48，72h后，COLⅠ、Runx2及SP7基因表達(dá)水平

圖3 A：受Pg感染48及72h后，MG63細(xì)胞中miR-34a表達(dá)水平；B：轉(zhuǎn)染48，72h后，受感染細(xì)胞中COLⅠ、Runx2及SP7基因表達(dá)水平

向受Pg感染的MG63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)物及其陰性對(duì)照物，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)48及72h時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)因子基因表達(dá)水平均較對(duì)照組低（圖3B，miR-34a+Pg vs NC+Pg：*P＜0.05，**P＜0.01）。

討 論

MiR-34家 族 包 括MiR-34a，miR-34b和miR-34c，它們?cè)谶M(jìn)化過程中相對(duì)保守，其中miR-34a因其抗腫瘤作用而被大家熟知[8]。早在2014年，有學(xué)者指出miR-34a可以通過抑制破骨細(xì)胞內(nèi)Tgif2靶點(diǎn)抑制破骨細(xì)胞形成，進(jìn)而抑制癌癥骨轉(zhuǎn)移和骨質(zhì)疏松[9]，從而將miR-34a與骨代謝聯(lián)系在一起。

本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)miR-34a可以促進(jìn)MG63細(xì)胞成骨分化。Runx2與Sp7是成骨細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子[10]，COLⅠ的合成和分泌是成骨細(xì)胞活化的重要標(biāo)志[11]。向MG63細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)物后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)COLⅠ、Runx2及SP7基因表達(dá)水平均升高，證明miR-34a可以促進(jìn)其成骨分化。miR-34a對(duì)成骨分化的促進(jìn)作用可能通過調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。有研究認(rèn)為miR-34a可以促進(jìn)受地塞米松抑制的鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及人脂肪干細(xì)胞成骨分化，且這種促進(jìn)作用是通過靶向抑制Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[12，13]。目前已確認(rèn)miR-34a可靶向抑制Notch基因，盡管Chen[14]等認(rèn)為Notch信號(hào)通路的激活可促進(jìn)成骨分化，但更多研究結(jié)果顯示激活Notch信號(hào)通路對(duì)成骨分化有抑制作用[15～17]。最近有團(tuán)隊(duì)指出青蒿酯可以通過提高miR-34a表達(dá)水平調(diào)節(jié)miR-34a/DKK1/Wnt通路，進(jìn)而提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化水平[18]。

同時(shí)，miR-34a在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中有重要調(diào)節(jié)作用。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種促炎細(xì)胞因子，并且參與骨量調(diào)節(jié)。Xin[19]等發(fā)現(xiàn)TNF-α可以降低鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-34a表達(dá)，而miR-34a表達(dá)增加可以逆轉(zhuǎn)TNF-α造成的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞中成骨分化抑制。LPS是Pg的重要毒力因子，它可以誘導(dǎo)促炎因子生成并造成組織破壞，同時(shí)，它可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞分化進(jìn)而導(dǎo)致骨吸收。有研究表明LPS可抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-34a表達(dá)，而且miR-34a可抑制受LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答反應(yīng)[6，20]。另有研究證實(shí)miR-34a可能減輕LPS介導(dǎo)的人上皮細(xì)胞及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[21，22]。我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)探索miR-34a具有的抑制炎癥因子表達(dá)及促進(jìn)骨形成作用是否有利于Pg感染狀態(tài)下MG63細(xì)胞的成骨分化。在本實(shí)驗(yàn)中MG63細(xì)胞受Pg刺激后細(xì)胞內(nèi)miR-34a表達(dá)升高，向炎癥細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-34a擬態(tài)物后，實(shí)驗(yàn)組COLⅠ、Runx2及SP7基因表達(dá)水平均較對(duì)照組降低，表明在感染狀態(tài)時(shí)，miR-34a抑制MG63細(xì)胞成骨分化。