張建云，谷立坤，彭 更，史永勝，趙維文，崔方凱，臧亞奇

（1.河南工程學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 451191；2.河南工程學(xué)院 煤化工資源綜合利用與污染治理河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 451191）

甲醇是一種重要的有機(jī)化工基礎(chǔ)原料。甲醇可采用多種原料（如天然氣、煤炭、油、乙炔尾氣等）進(jìn)行生產(chǎn)，世界甲醇生產(chǎn)以天然氣為主，我國(guó)以煤炭為主[1]。目前，煤制甲醇的合成技術(shù)比較成熟，隨著煤化工行業(yè)的快速發(fā)展，大型甲醇裝置相繼投產(chǎn)，甲醇成本日趨降低，我國(guó)的甲醇產(chǎn)能已經(jīng)超過(guò)5 000萬(wàn)t/年，并呈繼續(xù)增加趨勢(shì)。然而國(guó)內(nèi)的甲醇需求量不足一半，導(dǎo)致產(chǎn)能過(guò)剩[2-3]。因此，急需開(kāi)發(fā)甲醇下游產(chǎn)品[4]。

甲基營(yíng)養(yǎng)菌指的能夠利用甲基化合物為唯一的碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)的一類(lèi)微生物，能夠?qū)⒆匀唤缛≈槐M、用之不竭的一碳化合物變?yōu)樘荚春湍茉矗〒?jù)估計(jì)，每年大概有83～273百萬(wàn)t甲醇，600百萬(wàn)t甲烷釋放到大氣中[6]），可以解決發(fā)酵過(guò)程中糖原料的限制并且擴(kuò)大石化原料的應(yīng)用范圍，因此對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物的代謝研究具有重大意義。甲醇利用菌屬于甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，比甲烷氧化菌更容易培養(yǎng)，可以利用甲醇獲取能量并轉(zhuǎn)化為蛋白和各種次生代謝產(chǎn)物包括輔酶、維生素B12、吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quineone，PQQ）、絲氨酸、聚-β-羥丁酸（poly-β-hydroxybu tyrate，PHB）、類(lèi)胡蘿卜素等，這些產(chǎn)物可以作為藥物、食品添加劑、生物防治菌劑，具有良好的應(yīng)用前景。目前相對(duì)比較成熟的技術(shù)是飼料用甲醇蛋白[7]，南京工業(yè)大學(xué)生物化工技術(shù)中心選育了生產(chǎn)甲醇蛋白的菌種，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)室小試；達(dá)到1 t/年及5 t/年的產(chǎn)量規(guī)模[8]。義煤集團(tuán)以畢赤酵母YM-SCP02作為生產(chǎn)菌種，得到的甲醇蛋白最高產(chǎn)量（細(xì)胞干質(zhì)量）為19.3 g/L[9]。以甲醇為碳源的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已表達(dá)出了數(shù)以千計(jì)的外源蛋白，且已經(jīng)有大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，表達(dá)重組蛋白時(shí)，已成功放大到10 000 L[10]。還有一些能以甲醇為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的微生物體能夠分泌附加值較高的生物活性物質(zhì)[11]，如：吡咯喹啉醌[12-15]、氨基酸[16-18]、維生素[19]、多糖[20]、有機(jī)酸類(lèi)[21-22]等。由于甲醇的可生化性比較強(qiáng)，甲醇利用菌在含甲醇的工業(yè)廢水的處理方面也有一定的應(yīng)用價(jià)值[23-26]，李寶慶等[23]篩選到一株甲醇利用菌對(duì)500 mg/L甲醇的降解率可達(dá)到97.75%，孔慶勝等[24]篩選的菌株SMD11對(duì)0.6%（V/V）甲醇的降解率為82.5%，田丹丹等[25]篩選的甲醇利用菌WGM16在60 h時(shí)對(duì)1%（V/V）甲醇的降解率為75%。

目前國(guó)內(nèi)甲醇蛋白及相關(guān)生化產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化尚處于起步階段，很多關(guān)鍵性技術(shù)如發(fā)酵成本的降低，優(yōu)質(zhì)高效菌種的選育，提取工藝的優(yōu)化等問(wèn)題亟待探索研究。本研究從氣化廠的甲醇車(chē)間分離純化甲醇利用菌，并建立相關(guān)的微生物資源庫(kù)，旨在為利用微生物資源開(kāi)發(fā)甲醇下游生化產(chǎn)品提供理論依據(jù)和新的實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

沿河南氣化廠甲醇生產(chǎn)線地下排污管道監(jiān)測(cè)口挖取10～15 cm深度的土樣，共得到7個(gè)土樣，將采集的樣品放于統(tǒng)一的樣品袋中，做好標(biāo)記并編號(hào)。

1.1.2 化學(xué)試劑

甲醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硝酸鉀（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、GoldView I核酸染色劑：北京索萊寶科技有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀7.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，無(wú)水氯化鈣0.015 g/L，氯化鈉0.5 g/L，硫酸銨2.0 g/L，加蒸餾水1 L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀7.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，無(wú)水氯化鈣0.015 g/L，氯化鈉0.5 g/L，硫酸銨2.0 g/L，瓊脂粉20 g/L，加蒸餾水1 L。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25B型數(shù)字酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；HC-2064高速臺(tái)式離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；LDZM-60KCS-II立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FA2204B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱、THZ-300臺(tái)式恒溫?fù)u床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FC多功能酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；XSP-2CA雙目生物顯微鏡：上海巴拓儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甲醇利用菌的富集、分離

配制500 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基分別移取50 mL培養(yǎng)基在8個(gè)滅菌的250 mL錐形瓶中，標(biāo)號(hào)1～8，再分別稱(chēng)取1～7號(hào)土樣各0.5～1.0 g投入對(duì)應(yīng)編號(hào)的錐形瓶中，以8號(hào)瓶作無(wú)菌對(duì)照。將8份樣品分別添加2%（V/V）甲醇為碳源，恒溫（34 ℃、180 r/min）富集培養(yǎng)48 h，第二天補(bǔ)加2%（V/V）甲醇，轉(zhuǎn)接2次（每次培養(yǎng)48 h）。

菌液富集培養(yǎng)完成后，分別取1～8號(hào)錐形瓶中少量菌液，均勻涂布于含1.5%甲醇（V/V）的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基表面，34 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長(zhǎng)情況（8號(hào)平板作為空白對(duì)照）。

1.3.2 甲醇利用菌的分離純化

待1～7號(hào)培養(yǎng)基中明顯觀察到菌體生長(zhǎng)后，挑取生長(zhǎng)速度快的菌體轉(zhuǎn)接到含1.5%（V/V）甲醇的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，等細(xì)菌長(zhǎng)好再次轉(zhuǎn)接。第三次轉(zhuǎn)接從第二次轉(zhuǎn)接的平板上挑取菌體進(jìn)行平板劃線分離純化，待長(zhǎng)好后挑取劃線平板上的明顯的單菌落進(jìn)行再一次劃線分離純化。挑取平生長(zhǎng)狀態(tài)好的單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（每個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接3份斜面），等斜面培養(yǎng)基上的菌體長(zhǎng)好后放在4 ℃冷藏，備用。

1.3.3 菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定

將分離獲得的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌株劃線接種于含1%（V/V）甲醇的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中，34 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)、色澤、質(zhì)地等；挑取待測(cè)菌株苔進(jìn)行革蘭氏染色，采用10×100油鏡，觀察菌體細(xì)胞形態(tài)。細(xì)菌生理生化鑒定主要參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[27]，生理生化鑒定用試劑的配制方法主要參考文獻(xiàn)[28]。

1.3.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定采用16S rDNA基因序列分析法。

細(xì)菌總DNA 的提?。翰捎眉?xì)菌基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，方法參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

16S rDNA 基因序列的擴(kuò)增：擴(kuò)增引物（上游引物：27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，下游引物：1492R：5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'），PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火l min，72 ℃延伸1 min（30個(gè)循環(huán)）；最后在72 ℃下再延伸10 min。

16S rDNA基因序列的測(cè)序及分析：將擴(kuò)增得到的16S rDNA基因序列由北京博邁德公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進(jìn)行序列比對(duì)，并使用MEGA軟件（Version 5.1）中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建微生物系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.3.5 分析檢測(cè)

（1）菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定

從平板上挑取單菌落，接種于1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，34 ℃、180 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，菌體的生長(zhǎng)量采用分光光度法測(cè)定，以波長(zhǎng)600 nm處的光密度來(lái)表示，測(cè)定時(shí)以空白培養(yǎng)基作為參比。

（2）甲醇降解率的測(cè)定

用變色酸分光光度法對(duì)樣品中殘留的甲醇含量進(jìn)行測(cè)定，參考余波等[29-30]的方法并略加改進(jìn)。

a、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取0.5%甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL、24 μL、28 μL、32 μL、36 μL、40 μL于4 mL離心管中用40 μL蒸餾水作為空白實(shí)驗(yàn)組，加入0.4 mL 25%的硫酸溶液，再加入0.2 mL 1%的高錳酸鉀溶液，充分搖勻后室溫放置5 min；加入0.2 mL亞硫酸鈉溶液，搖勻，加入2 mL濃硫酸，搖勻后冷卻至室溫；加入0.2 mL 0.5%變色酸溶液，搖勻后在沸水中加熱20min后，取出冷卻至室溫并定容至4mL，用分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)574 nm下的吸光度值，并對(duì)不同甲醇繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

b、培養(yǎng)液中甲醇?xì)埩袅康臏y(cè)定

定量接種菌株4311的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物于以甲醇為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)，定時(shí)取樣200 μL培養(yǎng)液，12 000 r/min離心5 min，取40 μL上清液按上述方法進(jìn)行測(cè)定，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算甲醇含量。

c、甲醇降解率的計(jì)算[31]

甲醇降解率的計(jì)算公式如下：

式中：X為甲醇的生物降解率，%；Cm為未接菌對(duì)照培養(yǎng)液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)，%；Cn為接菌處理培養(yǎng)液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)，%。

1.3.6 菌株生長(zhǎng)條件和降解條件的優(yōu)化

以甲醇體積分?jǐn)?shù)、初始pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氮源及最佳氮源添加量為影響因素，分別以菌體生長(zhǎng)量及甲醇?xì)埩袅繛樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，考查菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)和降解甲醇情況。

（1）甲醇體積分?jǐn)?shù)的確定

將對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物接種于甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的液體培養(yǎng)基中，同時(shí)以一組未接菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照，于34 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)量其OD600nm值和甲醇含量，考察甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解甲醇的影響。

（2）初始pH值的測(cè)定

將對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物接種于以1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，初始pH值分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，于34 ℃、180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)量其OD600nm值和甲醇含量，考察初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解甲醇的影響。

（3）NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

將對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物接種于以1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源，NaCl質(zhì)量濃度分別為0.05%、0.50%、1.00%、2.00%、3.00%的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于34 ℃、180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)量其OD600nm值和甲醇含量，考察NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解甲醇的影響。

（4）氮源的確定

將對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物接種于以1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的氮源分別為硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、尿素，氮源添加量為2.0 g/L，于34 ℃、180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)量其OD600nm值和甲醇含量，考察氮源種類(lèi)對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解甲醇的影響。

（5）氮源添加量的確定

將對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物接種于以1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中蛋白胨的添加量為0.5 g/L、2.0 g/L、4.0 g/L、6.0 g/L、8.0 g/L、10.0 g/L，于34 ℃、180 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。定時(shí)取樣測(cè)量OD600nm值和甲醇含量，考察氮源添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解甲醇的影響。

1.3.6 菌株4311對(duì)不同濃度甲醇降解率的測(cè)定

在上述甲醇降解條件優(yōu)化的工作基礎(chǔ)上，將對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物接種分別接種于以1.0%（V/V）和0.5%（V/V）甲醇為唯一碳源無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，按照最適條件進(jìn)行接種培養(yǎng)，定時(shí)取樣，采用變色酸分光光度法測(cè)定培養(yǎng)基內(nèi)殘留甲醇的含量，同時(shí)以未接種的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基做為對(duì)照，計(jì)算甲醇的生物降解率，繪制甲醇降解曲線，考察菌株4311在優(yōu)化后的條件下對(duì)不同濃度甲醇的降解能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株4311的鑒定

2.1.1 菌株4311的菌落和菌體形態(tài)觀察

通過(guò)反復(fù)傳代篩選，從7個(gè)土樣中最終共篩選到16株能在1.5%（V/V）甲醇為唯一碳源無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上快速生長(zhǎng)的菌株，保藏于斜面培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株保藏3份，共48份。4311是從4號(hào)土樣中，第3批篩選出來(lái)的編號(hào)為1號(hào)的菌株。將斜面保藏的4311菌株在1.0%（V/V）甲醇為唯一碳源無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上劃線分離，34 ℃培養(yǎng)3～5 d，對(duì)菌株4311進(jìn)行菌體、菌落形態(tài)觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌株4311的菌落（A）和細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.1 Colony(A) and cell (B) morphology of strain 4311

由圖1A可知，菌株4311的菌落呈白色，圓形，直徑范圍2～3 mm，中央隆起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤(rùn)。由圖1B可知，菌株4311革蘭氏染色為陰性，光學(xué)顯微鏡下觀察為短桿狀。

2.1.2 菌株4311的生理生化試驗(yàn)

菌株4311能夠在以甲醇、甲胺為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)更好，對(duì)鏈霉素和卡鈉霉素敏感，對(duì)氨芐青霉素不敏感，不產(chǎn)色素，可以產(chǎn)吡咯喹啉醌PQQ，可以在pH值為5的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，當(dāng)NaCl含量＞1.00%時(shí)幾乎不生長(zhǎng)。菌株4311的部分生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株4311生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments identification of strain 4311

2.1.3 菌株4311的分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，以細(xì)菌基因組DNA作為模板，以27F和1492R序列為引物，所擴(kuò)增的16S rDNA的堿基片段大小在1.5 kb左右。對(duì)該16S rDNA片段序列進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序后的結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，用BLAST工具進(jìn)行同源性比較結(jié)果顯示，和菌株4311的16SrDNA序列同源性達(dá)到99%的有4株，同源性98%以上的有近20種，為甲基球形菌屬（Methylopila）的有15株菌，分屬于不同的種。其中Methylopila oligotropha最多，有4株。菌株4311系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。由圖3可知，菌株4311與Methylopila capsulatastrain IM1和Methylopila oligotrophastrain 2395A兩株菌具有最高的相似性，均為99%，與同屬的Methylopila jiangsuensisstrain JZL-4和MethylopilaYHT-1的相似性為98%，菌株4311與Methylopila capsulatastrain IM1聚為一個(gè)分支。

圖2 菌株4311 16S rDNA 的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification results of 16S rDNA of strain 4311

圖3 基于16S rDNA序列菌株4311的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain 4311 based on 16S rDNA sequence

綜合菌體特征和生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，菌株4311被鑒定為甲基球形菌屬（Methylopilasp.），該菌株屬于變形菌綱（Alphaproteobacteria），根瘤菌目（Rhizobiales），甲基包囊菌科（Methylocystaceae）。

2.2 甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖4可知，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)在0～0.6%（V/V）時(shí)，甲醇體積分?jǐn)?shù)與吸光度值線性相關(guān)性良好。其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=3.058 4x-0.071 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 4。

圖4 甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of methanol determination

2.3 不同影響因素對(duì)菌株4311生長(zhǎng)和甲醇降解條件的影響

2.3.1 不同甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株4311生長(zhǎng)和甲醇降解的影響

由圖5A可知，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)＜2.0%時(shí)，菌株4311基本不長(zhǎng)，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%～1.5%時(shí)，菌株生長(zhǎng)達(dá)到的峰值相近，OD600nm值為0.7左右，而在甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%時(shí)能更快進(jìn)入對(duì)數(shù)期；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，在前40 h內(nèi)生長(zhǎng)速度較快，40 h以后生長(zhǎng)速度變慢，說(shuō)明在生長(zhǎng)后期甲醇體積分?jǐn)?shù)0.5%不能提供足夠的碳源供菌體生長(zhǎng)。由圖5B可知，在甲醇體積分?jǐn)?shù)0.5%的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)基內(nèi)甲醇含量從50～80 h之間有一個(gè)較大幅度的減少過(guò)程，而該時(shí)期菌株4311正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)碳源需求量大；在甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%和1.5%的情況下，同樣有一個(gè)甲醇含量急劇降低的過(guò)程，其時(shí)間范圍均與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相對(duì)應(yīng)；對(duì)于甲醇體積分?jǐn)?shù)為2.0%的培養(yǎng)體系，幾乎沒(méi)有降解作用。綜合菌株生長(zhǎng)及降解甲醇能力可知，菌株生長(zhǎng)最適的甲醇體積分?jǐn)?shù)為1.0%。

圖5 不同甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株4311生長(zhǎng)（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.5 Effects of different methanol volume fraction on the growth (A)and methanol degradation (B) of strain 4311

2.3.2 不同初始pH值對(duì)菌株4311生長(zhǎng)和甲醇降解的影響

由圖6A可知，與其他pH值相比，菌株4311在初始pH值5.0時(shí)生長(zhǎng)情況最好，其他pH值時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)情況明顯減弱，初始pH值為9.0時(shí)細(xì)菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制?？赡芘c菌體自身會(huì)分泌堿性物質(zhì)中和酸性培養(yǎng)基有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)菌在前20 h所有pH梯度都有生長(zhǎng)，但初始pH 5.0條件下的菌株生長(zhǎng)情況因受到抑制而生長(zhǎng)較為緩慢。40 h以后，細(xì)菌分泌的堿性物質(zhì)增多，使得培養(yǎng)基初始pH值越來(lái)越大，初始pH值為5.0條件下的菌株繼續(xù)生長(zhǎng)，而其他條件時(shí)的菌株的生長(zhǎng)受到抑制。由圖6B可知，對(duì)于菌株4311，在初始pH值為5.0～9.0，隨著pH的增大降解甲醇的速率而逐漸降低，在初始pH值為5的時(shí)候降解甲醇的速率最快，而且降解的最徹底。綜合菌株生長(zhǎng)及降解甲醇能力，菌株4311最適生長(zhǎng)的初始pH值為5.0。

圖6 不同初始pH值對(duì)菌株4311生長(zhǎng)（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.6 Effects of different initial pH value on the growth (A) and methanol degradation (B) of strain 4311

2.3.3 不同NaCl添加量對(duì)菌株4311生長(zhǎng)和甲醇降解的影響

由圖7A可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%時(shí)，菌株4311的生長(zhǎng)情況最好；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%時(shí)，生長(zhǎng)狀態(tài)次之；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞1.00%時(shí)，細(xì)菌活性極低，基本不生長(zhǎng)。由圖7B可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%時(shí)，菌株4311降解甲醇的能力最強(qiáng)，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)降解能力次之。說(shuō)明隨著鹽度的提高，菌株4311生長(zhǎng)狀況變差，導(dǎo)致降解甲醇的能力變差。篩選到的甲醇利用菌4311耐鹽能力較差，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞1%時(shí)，就不能正常生長(zhǎng)。綜合菌株生長(zhǎng)及降解甲醇能力，NaCl最適質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%。

圖7 不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株4311生長(zhǎng)（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.7 Effects of different NaCl mass concentrations on the growth (A)and methanol degradation (B) of strain

2.3.4 不同氮源對(duì)菌株4311生長(zhǎng)和甲醇降解的影響

氮源可用于合成細(xì)菌中的各種有機(jī)質(zhì)，對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)有著極其重要的作用，不同的氮源對(duì)細(xì)菌的影響也各不相同。由圖8A可知，菌株4311以蛋白胨為氮源時(shí)生長(zhǎng)速度最快，其次是硫酸銨和硝酸鉀，而在尿素中生長(zhǎng)最為緩慢，推測(cè)可能菌株4311體內(nèi)脲酶分泌量低，不能很好的利用尿素做為氮源，相應(yīng)地，當(dāng)以蛋白胨為氮源時(shí)，菌株4311生長(zhǎng)速度最快，其降解能力最強(qiáng)。沈壽國(guó)等[26]篩選出一株甲醇降解菌，其最適氮源為蛋白胨，其次是硫酸銨，在硝酸鉀中不生長(zhǎng)，其結(jié)論與本研究的相近。

圖8 不同氮源對(duì)菌株4311生長(zhǎng)（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.8 Effects of different nitrogen sources on growth (A) and methanol degradation (B) of strain 4311

2.3.5 不同氮源添加量對(duì)菌株4311生長(zhǎng)和甲醇降解的影響

由圖9A可知，蛋白胨添加量在0～10 g/L范圍內(nèi)，蛋白胨添加量越高，菌體生長(zhǎng)速度越快；當(dāng)以10 g/L的蛋白胨為氮源時(shí)，菌體的OD600nm值在96 h可以達(dá)到1.1左右。在培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)以硫酸銨為氮源時(shí)，培養(yǎng)基中的菌體在培養(yǎng)4 d以后溶液出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，而以蛋白胨為氮源時(shí)，菌體聚集的現(xiàn)象會(huì)延遲1～2 d出現(xiàn)。由圖9B可知，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛? g/L，菌株4311降解能力最強(qiáng)，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.5 g/L，降解能力略次之。蛋白胨添加量為10 g/L時(shí)，菌株4311生長(zhǎng)狀態(tài)最好，但降解能力最差，其原因可能是蛋白胨中含有碳源，會(huì)和甲醇起到競(jìng)爭(zhēng)作用，影響到甲醇的利用。綜合菌株生長(zhǎng)及降解甲醇能力，蛋白胨最適添加量為2 g/L。

圖9 不同蛋白胨添加量對(duì)菌株4311生長(zhǎng)（A）及甲醇降解（B）的影響Fig.9 Effects of different peptone addition on growth (A) and methanol degradation (B) of strain 4311

3 結(jié)論

本研究從義馬氣化廠甲醇車(chē)間附近的土壤中篩選到一株甲醇利用菌4311。分析菌株的16S rDNA序列并結(jié)合其形態(tài)特征和生理生化特征，鑒定菌株4311為甲基球形菌屬（Methylopilasp.）。生長(zhǎng)特性研究表明，該菌株的最適生長(zhǎng)及降解條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)1.0%，初始pH 值5.0，氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%，最適氮源為蛋白胨，其添加量為2 g/L。在此最佳培養(yǎng)條件下，1%（V/V）甲醇的降解率最高可以達(dá)到85%。