熊 穎 鐘海雁 周 波

(林產(chǎn)可食資源安全與加工利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，長(zhǎng)沙 410004)(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，長(zhǎng)沙 410004)(湖南省森林植物園3，長(zhǎng)沙 410116)

杏仁種皮又被稱為杏仁種衣、杏仁紅衣，顏色深黃，約占果實(shí)干質(zhì)量的2%～5%[1]，是杏仁深加工過(guò)程中的副產(chǎn)物，除了少數(shù)被用作飼料之外，大部分都被丟棄[2]。杏仁種皮含有大量多酚，目前已檢測(cè)到杏仁種皮含有兒茶素、山柰酚、槲皮素、柚皮素、綠原酸、表兒茶素等[3-7]，是一種理想的天然抗氧化劑的來(lái)源。溶劑提取法是目前工業(yè)上最常見(jiàn)的天然活性物質(zhì)分離方式，但是溶劑提取法常伴隨大量有機(jī)溶劑的消耗，溶劑回收較復(fù)雜，并且有機(jī)溶劑的大量應(yīng)用容易造成環(huán)境的污染。低共熔溶劑(Deep Eutectic Solvents，DESs)是一種新型綠色溶劑，這類溶劑由于可降解、可回收、提取效率高而備受科研工作者的青睞，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開(kāi)始利用低共熔點(diǎn)溶劑提取植物活性成分，如黃酮[8]、多酚[9]、皂苷[10]等。

油茶是我國(guó)四大木本油料之一，油茶籽油富含不飽和脂肪酸，其中油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)75%～80%，是一種理想的食用油來(lái)源，油茶籽油在運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過(guò)程中易發(fā)生氧化，可通過(guò)添加一定量的抗氧化劑來(lái)減緩其氧化，有研究表明杏仁種皮的存在對(duì)提高油脂氧化穩(wěn)定性有重要意義[14]。從杏仁種皮中提取出來(lái)的酚類物質(zhì)是純天然抗氧化劑，如果能應(yīng)用于油茶籽油中不但能延長(zhǎng)油的貨架期降低油茶籽油的添加成本的同時(shí)，起到資源循環(huán)高值化利用的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶籽油、杏仁種皮(山杏)、沒(méi)食子酸(純度>98%)、原兒茶酸(純度>98%)、3,4-二羥基苯乙酸(純度>98%)、兒茶素(純度>98%)、綠原酸(純度>98%)、沒(méi)食子酸丙酯(純度>99%)；甲醇和冰乙酸為色譜純；其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CP224C型電子天平，WF-04B型粉碎機(jī)，1200型高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18分析型色譜柱，892型Rancimat油脂氧化穩(wěn)定性測(cè)定儀，TITREX 2000微調(diào)型電子滴定儀，DHG-9070A型高溫鼓風(fēng)干燥箱，UV-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，RTC型集熱式磁力攪拌器，HJ-4A型數(shù)顯控溫磁力攪拌器。

1.2 方法

1.2.1 溶劑的制備

低共熔點(diǎn)溶劑的組成見(jiàn)表1，所述組分和比例進(jìn)行混合并在水浴加熱條件下攪拌直至形成穩(wěn)定的無(wú)色透明液體，制備的液體均以100%、90%、75%和50%的質(zhì)量濃度配制不同的濃度梯度。配制4種傳統(tǒng)溶劑：60%甲醇、60%乙醇、酸化甲醇(甲醇/水/12 mol/L HCl，70∶29∶1)、去離子水。

表1 低共熔點(diǎn)溶劑的組成

1.2.2 提取物的制備

杏仁種皮處理：將杏仁種皮放入粉碎機(jī)中磨粉，隨后取出放入研缽內(nèi)用適量液氮進(jìn)一步研磨，過(guò)80目篩，杏仁種皮粉用密封袋裝好封口，于4 ℃保存。

酚類的提取參照文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)[15]：準(zhǔn)確稱取0.50 g杏仁種皮粉，以1∶10的料液比將杏仁種皮粉和溶劑置于燒杯中，以保鮮膜封口，在25 ℃下攪拌提取12 h，隨后將混合物于4 000 r/min下離心20 min，取上清液并用對(duì)應(yīng)的DESs將上清液定容至5 mL即為提取物。

1.2.3 總酚含量的測(cè)定

總酚的測(cè)定采用福林酚法，參照GB/T 8313—2008并略作調(diào)整，取1 mL提取物稀釋10倍后得待測(cè)液。取1 mL待測(cè)液于10 mL容量瓶加入0.2 mL 福林酚試劑，搖勻后靜置3～8 min，然后加入2 mL15% Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至刻度后搖勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定760 nm處的吸光度，記為A1，去離子水調(diào)零。操作均重復(fù)3次，杏仁種皮總酚含量由公式計(jì)算，總酚含量以沒(méi)食子酸當(dāng)量計(jì)(mg/g)。

總酚含量=C×V×d/m

式中：C為待測(cè)液總酚質(zhì)量濃度；V為提取物定容體積；d為稀釋因子；m為樣品質(zhì)量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制濃度為0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加入2 mL福林酚試劑，搖勻后避光靜置3～8 min，然后加入2 mL的15%Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至刻度后搖勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定760 nm處的吸光度，去離子水調(diào)零，繪制標(biāo)曲(Y=0.084 5X+0.058 5，R2=0.997 9)。

1.2.4 提取物的HPLC分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室條件設(shè)置參數(shù)為：流動(dòng)相A為甲醇；流動(dòng)相B為0.2%乙酸水溶液；色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速1.0 mL/min；柱溫箱25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；洗脫程序設(shè)置如下：0～5 min流動(dòng)相A由10%增加至20%，5～18 min流動(dòng)相A增加至35%，18～22 min流動(dòng)相A增加至50%，22～36 min流動(dòng)相A增加至65%，36～40 min流動(dòng)相A增加至100%，40～45 min流動(dòng)相A降至0%。

1.2.5 油茶籽油氧化穩(wěn)定性測(cè)定

Rancimat氧化穩(wěn)定性測(cè)定按照文獻(xiàn)方法并加以修改[16，17]：分別稱取0.5%、1%、2%、3%、4%的提取物于油茶籽油中，并在油茶籽油中分別加入2%的單甘酯和去離子水，用磁力攪拌器攪拌均勻，溶劑也按同樣方法進(jìn)行處理以排除溶劑干擾，準(zhǔn)確稱取3.00 g的油樣于試管中，按文獻(xiàn)設(shè)置條件[17]，連接裝置，溫度穩(wěn)定后開(kāi)始通入空氣。油茶籽油的氧化穩(wěn)定性由所測(cè)得的氧化誘導(dǎo)時(shí)間來(lái)表示，其中添加提取物的油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間為te，添加溶劑的油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間為ts，氧化誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)量t=te-ts。

Schaal烘箱法：分別稱取2%的提取物加入油茶籽油中，用磁力攪拌器攪拌均勻后靜置過(guò)濾，用高溫干燥箱在63 ℃下加熱，不間斷連續(xù)加熱20 d，每4 d收集樣品并測(cè)定油茶籽油加熱后的酸價(jià)、過(guò)氧化值以及p-茴香胺值，油茶籽油酸價(jià)按照GB 5009.229—2016所述的方法進(jìn)行測(cè)定，過(guò)氧化值按照GB 5009.227—2016的方法進(jìn)行測(cè)定，p-茴香胺值按照GB/T 24304—2009的方法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取物總酚含量比較

組成DESs的成分不同會(huì)影響目標(biāo)物的提取量。本研究對(duì)比了4種傳統(tǒng)溶劑和5組低共熔點(diǎn)溶劑在不同濃度下對(duì)杏仁種皮多酚的提取效果。不同溶劑對(duì)杏仁種皮多酚提取量的影響如圖1所示，從圖1a可以看出傳統(tǒng)溶劑組別中酸化甲醇具有最強(qiáng)的酚類提取能力，去離子水的提取效果最差，從圖1b可以看出不同低共熔點(diǎn)溶劑對(duì)杏仁種皮的酚類物質(zhì)提取量有很大的差別，且大部分DESs的總酚提取量均高于傳統(tǒng)溶劑。除此之外，DESs的濃度對(duì)總酚提取量影響很大，DESs1、DESs2、DESs3、DESs4和DESs5在不同濃度下總酚最高含量分別為最低含量的5.43、3.75、3.37、1.33、2.19倍，且不同種類DESs的多酚提取量隨濃度變化呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。

注：圖中不同字母代表數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)。圖1 不同溶劑對(duì)杏仁種皮多酚提取量的影響

2.2 提取物的HPLC分析

不同溶劑提取物的HPLC圖譜如圖2所示，可以看出溶劑種類主要影響提取物的組成，其中傳統(tǒng)溶劑、DESs1和DESs4杏仁種皮提取物酚類組成較復(fù)雜，且各酚類物質(zhì)提取量較低，DESs2、DESs3和DESs5杏仁種皮提取物中酚類組成比較單一，且酚類提取量較高，這可能是由于DESs2、DESs3和DESs5組分中含有機(jī)酸，酸性條件更加有利于酚類的提取，不同DESs由于溶劑酸度不同，對(duì)酚類物質(zhì)的目標(biāo)性和提取量會(huì)有所區(qū)別[19]。從圖2b～圖2f還可以看出相同的DESs在不同濃度下提取物的酚類物質(zhì)組成無(wú)太大差別，而提取量受濃度影響較大，因此可以推測(cè)DESs在不同濃度導(dǎo)致溶劑與酚類物質(zhì)的作用力大小有所改變，酚類物質(zhì)的提取量也會(huì)隨之發(fā)生變化[20]?？傮w來(lái)看，DESs在提取量和對(duì)酚類物質(zhì)的專一性方面來(lái)看均普遍優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑，且DESs對(duì)傳統(tǒng)溶劑無(wú)法高效提取的酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的針對(duì)性，這進(jìn)一步說(shuō)明了DESs在活性物質(zhì)提取方面的優(yōu)越性。

圖2 不同溶劑提取物的HPLC圖譜

2.3 提取物對(duì)油茶籽油氧化穩(wěn)定性的影響

2.3.1 提取物對(duì)油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的影響

不同溶劑的杏仁種皮提取物對(duì)油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的影響如圖3a所示，可以看出提取物對(duì)油茶籽油的氧化誘導(dǎo)時(shí)間均有不同程度的延長(zhǎng)。DESs杏仁種皮提取物對(duì)油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)效果受溶劑濃度影響較大，這主要是由于提取物的總酚含量有所區(qū)別導(dǎo)致的，DESs杏仁種皮提取物與傳統(tǒng)溶劑相比具有更好的延長(zhǎng)油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的效果，DESs2、DESs3和DESs5杏仁種皮提取物總酚含量雖明顯高于其他組別，但對(duì)油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的影響與其他組別相比區(qū)別不大，這可能是因?yàn)槠渌M別提取物總酚含量雖低，但酚類物質(zhì)組成較復(fù)雜，酚類物質(zhì)之間以及酚類物質(zhì)與其他物質(zhì)之間存在協(xié)同增效的作用導(dǎo)致的[21，22]。從圖3a可以看出當(dāng)提取物添加濃度為2%時(shí)具有較理想的油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)效果，添加DESs1、DESs2、DESs3、DESs4和DESs5杏仁種皮提取物的油茶籽油在此添加量下氧化誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)量分別為1.16、1.13、1.22、1.37、1.16 h，當(dāng)各組提取物添加量超過(guò)2%時(shí)油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間增加量隨添加量變化不大，由此可知2%為較理想的添加量。

圖3 不同提取物對(duì)油茶籽油氧化穩(wěn)定性的影響

2.3.2 提取物對(duì)油茶籽油酸價(jià)的影響

提取物在不同加熱時(shí)間下對(duì)油茶籽油酸價(jià)變化量的影響如圖3b所示，隨著加熱時(shí)間的增加，空白組油茶籽油酸價(jià)的增加量高達(dá)0.55 mg/g，添加了杏仁種皮提取物的油茶籽油酸價(jià)升高量明顯低于空白組，傳統(tǒng)溶劑杏仁種皮提取物中酸化甲醇杏仁種皮提取物對(duì)油茶籽油酸價(jià)升高的抑制效果最好，升高量?jī)H為0.34 mg/g，各組DESs杏仁種皮提取物對(duì)油茶籽油酸價(jià)升高的抑制效果最好的分別為50%DESs1、100%DESs2、75%DESs3、50%DESs4和100%DESs5，酸價(jià)升高量分別為0.24、0.23、0.24、0.26、0.25 mg/g，明顯低于添加傳統(tǒng)溶劑杏仁種皮提取物的油茶籽油。因此可以看出DESs杏仁種皮提取物具有比傳統(tǒng)溶劑杏仁種皮提取物更好的抑制油茶籽油酸價(jià)升高的效果，這可能是由于DESs杏仁種皮提取物總酚含量較高導(dǎo)致的。

2.3.3 提取物對(duì)油茶籽油過(guò)氧化值的影響

提取物在不同加熱時(shí)間下對(duì)油茶籽油過(guò)氧化值變化量的影響如圖3c所示。可以看出各組油茶籽油的過(guò)氧化值均隨著加熱時(shí)間的增加而呈現(xiàn)出增長(zhǎng)的趨勢(shì)，加熱20 d后空白對(duì)照組的油茶籽油過(guò)氧化值增加量為0.86 g/100 g，添加提取物的油茶籽油過(guò)氧化值增加量均小于空白組，添加傳統(tǒng)溶劑、DESs1、DESs2、DESs3、DESs4和DESs5杏仁種皮提取物的油茶籽油對(duì)過(guò)氧化值的最高抑制量分別為0.32、0.26、0.72、0.56、0.13、0.47 g/100 g，其中DESs2和DESs3杏仁種皮提取物對(duì)油茶籽油過(guò)氧化值升高的抑制效果最佳，這可能是由于DESs2和DESs3組別的杏仁種皮提取物中的某些活性成分對(duì)抑制油茶籽油過(guò)氧化值的升高具有良好的效果。

2.3.4 提取物對(duì)油茶籽油p-茴香胺值的影響

提取物在不同加熱時(shí)間下對(duì)油茶籽油p-茴香胺值變化量的影響如圖3d所示，隨著加熱時(shí)間的增加，各組油茶籽油的p-茴香胺值均呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)?？瞻捉M油茶籽油加熱時(shí)間為4～16 d時(shí)，p-茴香胺值增加量相對(duì)較低，但當(dāng)加熱時(shí)間為20 d時(shí)，空白組油茶籽油的p-茴香胺值增加量可達(dá)16.32。添加杏仁種皮提取物的油茶籽油與空白組相比茴香胺值的升高均有明顯的減少，這說(shuō)明提取物能在一定程度上抑制油茶籽油初級(jí)氧化產(chǎn)物的進(jìn)一步分解。添加傳統(tǒng)溶劑杏仁種皮提取物的油茶籽油在加熱20 d后，p-茴香胺值增加量為空白對(duì)照組的87.07%～95.83%，添加各組DESs杏仁種皮提取物的油茶籽油，其p-茴香胺值增加量分別為對(duì)照組的69.36%～89.03%、53.68%～81.62%、54.66%～77.02%、58.95%～67.77%和36.83%～62.01%，由此可見(jiàn)DESs組的增量遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)溶劑組，其中DESs5杏仁種皮提取物最能體現(xiàn)出對(duì)油茶籽油p-茴香胺值升高的抑制效果，這可能是由于DESs5杏仁種皮提取物中的有效成分對(duì)油茶籽油p-茴香胺值的升高具有更好的抑制效果。

3 結(jié)論

本研究對(duì)比了傳統(tǒng)溶劑和DESs對(duì)杏仁種皮酚類物質(zhì)的提取效果及其提取物對(duì)油茶籽油氧化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，DESs對(duì)杏仁種皮中的酚類物質(zhì)具有更好的提取效果，且與傳統(tǒng)溶劑相比DESs對(duì)某些酚類物質(zhì)的提取更具有針對(duì)性。DESs杏仁種皮提取物與傳統(tǒng)溶劑相比具有更好的延長(zhǎng)油茶籽油氧化誘導(dǎo)時(shí)間的效果。所有提取物對(duì)油茶籽油酸價(jià)、過(guò)氧化值和p-茴香胺值的升高均有一定的抑制效果，而DESs杏仁種皮提取物與傳統(tǒng)溶劑相比具有更好的抑制油茶籽油酸價(jià)升高的效果，DESs2和DESs3杏仁種皮提取物對(duì)油茶籽油過(guò)氧化值的升高有良好的抑制效果，DESs5杏仁種皮提取物對(duì)油茶籽油p-茴香胺值的升高具有最強(qiáng)的抑制效果。