鐘國(guó)防 石 磊 張彥俊

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心1，上海 201306)(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心2，上海 201306)(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3,上海 201306)

豆粕由于來(lái)源豐富，氨基酸平衡性好，有較好的適口性[1]，是較為理想的魚粉替代植物蛋白源[2，3]。但豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子降低了其利用率[4]，大豆過(guò)敏源蛋白還對(duì)腸組織產(chǎn)生不良影響[5]。豆粕發(fā)酵能有效降低大豆蛋白中的大分子蛋白，產(chǎn)生含量豐富的游離氨基酸、小肽和多肽[6]，極大地降低了豆粕的抗原性，提高豆粕蛋白質(zhì)的利用率[7]。Yamamoto等[8]研究認(rèn)為豆粕發(fā)酵后在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)飼料中替代魚粉的比例顯著高于普通豆粕，且改善了虹鱒肝臟和腸道結(jié)構(gòu)異常的現(xiàn)象。通過(guò)優(yōu)化豆粕發(fā)酵工藝可以得到小肽、多肽含量豐富的大豆肽產(chǎn)品，能進(jìn)一步提升發(fā)酵豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9，10]。肽類產(chǎn)品具有促生長(zhǎng)[11]、提高消化酶活力[12]和提高免疫及抗氧化能力[13]等特點(diǎn)。適宜的豆粕及其加工產(chǎn)品替代魚粉通常不會(huì)引起消化酶和消化道組織結(jié)構(gòu)的變化，但過(guò)量替代會(huì)引起不良影響。飼料中添加1.5%魚粉小肽制品能有效提高凡納濱對(duì)蝦消化酶活力[14]，斑點(diǎn)叉尾鮰飼料中用大豆多肽替代75%的魚粉[15]對(duì)其生長(zhǎng)和消化酶活力都沒(méi)有不良影響。豆粕及其加工產(chǎn)品對(duì)魚類腸道等消化器官的影響研究還較少，豆粕蛋白在對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化道結(jié)構(gòu)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)具有廣鹽性、食性雜、生長(zhǎng)快和抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種重要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種[16-18]，養(yǎng)殖產(chǎn)量大且對(duì)魚粉需求量大，對(duì)其飼料中魚粉替代研究具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)用的大豆肽產(chǎn)品是全脂豆粕通過(guò)深度酶解制得，粗蛋白和粗脂肪含量分別為40.50%和24.70%，且酶解后的大豆肽產(chǎn)品酸溶蛋白的比例較高，蛋白質(zhì)溶解度達(dá)82.50%，蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)于普通發(fā)酵豆粕。將其替代凡納濱對(duì)蝦飼料中的魚粉，研究其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能、消化酶活力和腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，為大豆蛋白深加工產(chǎn)品在凡納濱對(duì)蝦飼料中的高效利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

根據(jù)凡納濱對(duì)蝦的營(yíng)養(yǎng)需求配制魚粉含量為25%的基礎(chǔ)飼料(FM)，用大豆肽產(chǎn)品替代基礎(chǔ)飼料中10%、20%、30%、40%、100%的魚粉(分別記做FSM10、FSM20、FSM30、FSM40、FSM100)，配制成6種等氮等能實(shí)驗(yàn)飼料(表1)。大豆肽產(chǎn)品成分見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)所有原料過(guò)80目篩，按飼料配方稱量后加40%的水?dāng)嚢杈鶆?，再過(guò)20目篩網(wǎng)。然后用雙螺旋桿擠條機(jī)將粉料壓成條狀物，烘干后破碎成顆粒，于-4 ℃冰箱保存。

表1 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉飼料組成/%

表2 大豆肽數(shù)據(jù)

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)水泥池網(wǎng)箱中進(jìn)行(網(wǎng)箱規(guī)格為2 m×1.5 m×1 m)。凡納濱對(duì)蝦幼蝦購(gòu)自浙江省嘉善縣東升水產(chǎn)苗種公司，挑選規(guī)格均勻、體格健壯、平均體重為(1.53±0.36) g的幼蝦540尾，隨機(jī)分給6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖過(guò)程中保持水深在1 m左右，溶氧>7.00 mg/L，氨氮<0.03 mg/L。每天投喂2次飼料(08：00和17：00)。投喂量在3%左右，記錄投餌量及殘餌量。養(yǎng)殖時(shí)間為50 d。

1.3 樣品采集與測(cè)定

1.3.1 取樣及消化酶活力測(cè)定

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h取樣。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取5尾蝦，冰上解剖得到肝胰腺和腸組織，稱重后保存于-20 ℃冰箱。消化酶活力采用南京建成生物工程試劑盒檢測(cè)[19]。

1.3.2 切片制作及讀片

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3尾蝦，冰上分離取腸組織2～3 cm，生理鹽水沖洗后，用濾紙擦干表面水分后放入Bouin試液中，24 h內(nèi)換用70%的酒精保存。制作切片時(shí)，組織樣本乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，切片(5 μm)隨后進(jìn)行展片，烤片，H&E染色，封片等系列工作[20，21]。

1.4 計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

成活率(SR)=100%×(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦尾數(shù)/實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)蝦尾數(shù))

增重率(WGR ) = 100% ×[末體重-初體重]/初體重

特定生長(zhǎng)率( SGR) =100% ×[ln 末體重- ln 初體重]/飼養(yǎng)時(shí)間

飼料系數(shù)(FCR) = 100 × 攝食飼料總量/[末體重-初體重]

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì),對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析(one-way ANOVA, LSD)，若有顯著差異，則采用Duncan法作多重比較。差異顯著水平采用0.05，若P<0.05，則表示有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，F(xiàn)M組飼料系數(shù)與FSM10、FSM20、

表3 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

FSM30和FSM40組之間的差異均不顯著(P>0.05)，但顯著低于FSM100組(P<0.05)；FM組增重率與FSM10、FSM20，F(xiàn)SM30組差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于FSM40和FSM100組(P<0.05)。FM組特定生長(zhǎng)率顯著高于FSM40組和FSM100組(P<0.05)，但與FSM10、FSM20和FSM30組差異不顯著(P>0.05)。大豆肽產(chǎn)品替代魚粉量達(dá)20%時(shí)已經(jīng)顯著影響凡納濱對(duì)蝦存活率(P<0.05)。

2.2 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶活力的影響

大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消化酶活力的影響見(jiàn)表4。FM組肝胰腺淀粉酶活力顯著高于其他各組(P<0.05)。肝胰腺脂肪酶隨替代的增加而下降，且替代量達(dá)20%后顯著低于對(duì)照(P<0.05)。當(dāng)替代量達(dá)40%時(shí)肝胰腺胰蛋白酶活力顯著低于對(duì)照組(FM組)(P<0.05)。

表4 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消化酶活力的影響

大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸組織消化酶活力的影響見(jiàn)表5。腸組織中的淀粉酶活力各實(shí)驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)；大豆肽產(chǎn)品能提高腸組織中脂肪酶活力，F(xiàn)SM20、FSM30及FSM40的脂肪酶活力顯著高于FM組(P<0.05)；胰蛋白酶活性FSM20組顯著高于其他各組(P<0.05)，其他替代組與FM組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

表5 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸組織消化酶活力的影響

2.3 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸組織結(jié)構(gòu)的影響

大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸組織結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)表6。凡納濱對(duì)蝦腸組織絨毛長(zhǎng)度FSM20值最大，且除FSM100組顯著低于對(duì)照組之外(P<0.05)，其各組與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。絨毛寬度呈先上升后下降的趨勢(shì)，且FSM10和FSM20顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。肌層厚度FSM10和FSM30實(shí)驗(yàn)組顯著高于其他各組(P<0.05)。

表6 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸組織結(jié)構(gòu)的影響

3 討論

3.1 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

大豆肽產(chǎn)品由于具有小分子蛋白、小肽及多肽比例高、蛋白質(zhì)溶解度高等特點(diǎn)，蛋白質(zhì)品質(zhì)優(yōu)于普通發(fā)酵豆粕，在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用已有報(bào)道[22]。研究表明，普通發(fā)酵豆粕替代飼料中的魚粉因魚蝦種類不同差異較大，魚類替代量較高，而甲殼類替代量相對(duì)較低。羅非魚[23]、珍珠龍膽石斑魚[24]等飼料中發(fā)酵豆粕可替代40%的魚粉，大口黑鱸[25]飼料中發(fā)酵豆粕可替代50%的魚粉。而甲殼類飼料中發(fā)酵豆粕替代魚粉的量不宜超過(guò)25%[26，27]，甚至更低[28-30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大豆肽產(chǎn)品替代魚粉量在20%以內(nèi)時(shí)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的增重率、飼料系數(shù)和特定生長(zhǎng)率都沒(méi)有產(chǎn)生不良影響，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)大豆肽產(chǎn)品中水蘇糖、棉子糖及大豆球蛋白等抗?fàn)I養(yǎng)因子去除較好及蛋白質(zhì)消化率較高(表2)，從而促進(jìn)了凡納濱對(duì)蝦的消化吸收。但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)替代量達(dá)20%時(shí)對(duì)成活率有不良影響，因此，建議實(shí)際應(yīng)用時(shí)替代量應(yīng)低于20%。

3.2 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶活力的影響

蝦類消化酶活性受到飼料組成[31]，發(fā)育周期[32]，個(gè)體大小[33]，水體環(huán)境[34]等多種因素的影響。肝胰腺是對(duì)蝦蛋白酶產(chǎn)生的主要器官[35]，胰蛋白酶在沒(méi)被外界因素激活的情況下主要以酶原的形式存在，這可能是本實(shí)驗(yàn)中隨著大豆肽產(chǎn)品替代量的增加肝胰腺胰蛋白酶活力與對(duì)照組并沒(méi)有出現(xiàn)顯著性差異的一個(gè)主要原因。本實(shí)驗(yàn)胰蛋白酶活力與許培玉等[36]研究結(jié)果一致，腸道中胰蛋白酶的活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，但其肝胰腺中淀粉酶活力與其研究不同，這可能與兩者小肽來(lái)源的不同有關(guān)[37]。王重剛等[38]研究認(rèn)為真鯛稚魚脂肪酶和淀粉酶的活力與飼料中脂肪含量與淀粉含量相關(guān)，但本試驗(yàn)結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)有類似的相關(guān)性，這除了配方設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)不同之外(前者是等氮等脂，本實(shí)驗(yàn)是等氮等能)，還可能與研究對(duì)象不同有關(guān)。飼料組成特別是飼料中動(dòng)植物蛋白源的比例對(duì)魚蝦的消化酶活性的影響極為顯著[39,40]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)c組織中胰蛋白酶和脂肪酶的活性受飼料組成的影響較大，與王天神[41]在克氏原螯蝦上的研究結(jié)果類似，這可能是隨著魚粉替代量的增加，飼料中動(dòng)物蛋白源與植物蛋白源的比例逐漸變小，從而引起相關(guān)消化酶的活性出現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可知，肝胰腺和腸組織中消化酶活性的變化規(guī)律有一定的差異，這可能是由于肝胰腺是消化酶的主要產(chǎn)生器官[35]，而腸組織是消化酶活動(dòng)主要的場(chǎng)所，是消化器官與功能相適應(yīng)所致。

3.3 大豆肽產(chǎn)品替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦腸組織結(jié)構(gòu)的影響

張錦秀[42]在使用大豆蛋白源飼喂建鯉的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)替代魚粉的量超過(guò)60%以后，會(huì)導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞頂端脫落，影響建鯉的消化和吸收功能。研究認(rèn)為，腸組織作為水產(chǎn)動(dòng)物消化吸收的主要場(chǎng)所其消化功能與組織結(jié)構(gòu)具有一定的相關(guān)性，可通過(guò)腸組織絨毛的增長(zhǎng)，上皮細(xì)胞的數(shù)量增多，增加消化和吸收的面積[35]從而提高消化吸收能力。小肽對(duì)腸組織中刷狀緣酶活力有一定的刺激作用，并且可以加速腸道絨毛增長(zhǎng)[43，44]。Kotzamanis[45]在歐洲鱸幼魚上的研究發(fā)現(xiàn)小肽對(duì)腸組織消化機(jī)能有改善作用。王恬等[46]發(fā)現(xiàn)飼料的小肽有助于提高仔豬腸道胰蛋白酶和脂肪酶活性。牟玉超等[47]研究發(fā)現(xiàn)植物蛋白的水解產(chǎn)物產(chǎn)生的小肽能促進(jìn)大鱗鲆幼魚腸道黏膜的形成。本實(shí)驗(yàn)中適宜大豆肽產(chǎn)品替代魚粉改善了腸道的組織結(jié)構(gòu)，但隨著替代含量的增加腸道絨毛高度有下降的趨勢(shì)，推測(cè)可能是由于飼料中的非淀粉多糖與膽汁酸結(jié)合后對(duì)微絨毛生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，影響了腸道絨毛的正常生長(zhǎng)[48]。

4 結(jié)論

大豆肽產(chǎn)品替代20%以內(nèi)的魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能、消化酶活性和腸組織結(jié)構(gòu)均無(wú)不良影響，但替代100%魚粉會(huì)損傷凡納濱對(duì)蝦小腸組織。