劉 溢，王 英，姜鈺婷，胡 晨，劉春葉，張 劍

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

紙基微流控芯片，是一種集成化、便攜化、低成本化的檢測技術(shù)。紙芯片可追溯到17世紀(jì)，英國化學(xué)家波義耳偶然發(fā)現(xiàn)紫羅蘭濺到鹽酸會(huì)變紅，由此發(fā)明了石蕊試紙。2007年，Whitesides團(tuán)隊(duì)首次提出紙基微流控芯片技術(shù)的概念，隨后紙基微流控芯片已經(jīng)得到了快速發(fā)展。2009年，張釗[1]繼2008年美國亞利桑那大學(xué)研制出第1張折紙芯片后，開發(fā)出新型DNA折紙芯片；2011年，王方方等[2]采用光刻法制備一維和二維紙芯片，驗(yàn)證了紙芯片上化學(xué)發(fā)光法檢測葡萄糖和尿酸的可能性；2012年Maejima Kento[3]等提出了利用噴墨打印技術(shù)制作紙芯片，研制出了低成本、可大量生產(chǎn)、能在家進(jìn)行血液檢測的紙芯片；同年，Xie Li等[4]通過噴墨打印電極技術(shù)制作出混合可穿戴的生物傳感系統(tǒng)，為新一代可穿戴的健康監(jiān)測技術(shù)提供了有力支持；2013年，馬翠翠[5]研發(fā)出一種基于紫外光降解自組裝單分子層的紙芯片新型加工法；同年，寇娟[6]提出用魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系測定藥物，嚴(yán)偉等[7]利用微流控紙芯片研究乳腺癌組織；2014年，貴金屬及其氧化物的納米材料開始廣泛運(yùn)用于紙芯片的制作與檢驗(yàn)[8-11]；2015～2016年紙芯片的新型制作方法層出不窮[12-16]，如回形針固定法、3D打印法、離子體法等；2017～2020年人們開始關(guān)注紙芯片與智能手機(jī)的結(jié)合[17-19]以及如何進(jìn)一步提高檢測精度與速度[20-22]等問題。

現(xiàn)如今，紙基微流控芯片已廣泛運(yùn)用于食品安全檢測[23-27]、醫(yī)藥[28-33]、環(huán)境檢測[34]等各領(lǐng)域。相比較于其他方法，紙芯片具有可大規(guī)模生產(chǎn)、易于攜帶、檢測迅速、不需要專業(yè)人員、大型配套設(shè)施分析，結(jié)果分明可直接觀察等突出優(yōu)勢。

1 紙基微流控芯片的檢測方法

目前，紙芯片的發(fā)展已較成熟，檢測方法眾多，但應(yīng)用最廣泛的大致有比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法4種。

1.1 比色法

比色法是將檢測對(duì)象加入到檢測體系，構(gòu)建相關(guān)的顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測的，通過顯色時(shí)間、體系pH值、檢測溫度、物質(zhì)濃度等因素來衡量檢測的有效程度。實(shí)際操作中，通常都會(huì)使用純化、富集或濃縮后的檢測溶液或根據(jù)實(shí)際情況加入顯色劑，以達(dá)到更理想的比色效果。

1.1.1 食品安全檢測

食品安全問題一直都是熱點(diǎn)，將比色法用于食品檢測大大增加了檢測的便利性和實(shí)用性。呂聰聰?shù)萚35]利用三聚氰胺對(duì)H2O2的催化作用，使辣根過氧化氫酶-3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(HRP-TMB)-H2O2體系在同一時(shí)間顏色加深，通過觀察紫外可見吸收曲線測定出三聚氰胺的檢出限為5 μmol/L；張一冉等[36]通過挑選出9種對(duì)三甲胺靈敏的指示劑，制作出氣敏紙芯片，對(duì)不同時(shí)期鱸魚肉的揮發(fā)性氣體進(jìn)行檢測，成功辨別出不同儲(chǔ)存時(shí)間段的鱸魚肉；Lung-ming Fu等[37]利用熱塑性聚酯紙芯片和SO2發(fā)生酸堿反應(yīng)，通過高分辨率的相機(jī)和紅綠藍(lán)(RGB)分析軟件檢測分析，結(jié)果表明食物中φ(SO2)=10×10-6～300×10-6，φ(SO2)與RGB色度值具有很高的線性關(guān)系(R2=0.998 1)，該結(jié)果與傳統(tǒng)方法的偏差小于3.82%。

1.1.2 蛋白質(zhì)檢測

蛋白質(zhì)的檢測在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域都很重要，采用比色法的優(yōu)點(diǎn)在于該方法操作簡單，可進(jìn)一步推行到日常生活中。李秀平[38]等通過紫外光刻技術(shù)制作紙芯片，利用體積為0.2 μL、質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溴酚藍(lán)作為指示劑檢測尿液中總蛋白含量，檢測時(shí)間控制在5 min以內(nèi)，經(jīng)過量化由顯微鏡電荷耦合器件(CCD)拍攝芯片圖像的灰度用來執(zhí)行半定量，檢測限為2.1 mg/L,定量限為6.9 mg/L，回收率為96.7%～103.82%。

1.2 熒光法

熒光法利用檢測對(duì)象與相應(yīng)的熒光材料作用產(chǎn)生熒光，運(yùn)用熒光光譜法、熒光光度法等進(jìn)行定量分析，是目前使用最廣泛的一種檢測方法。同時(shí)，熒光法與液相色譜法的結(jié)合能進(jìn)一步精確實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為熒光法的運(yùn)用帶來更多可能性。

1.2.1 重金屬檢測

隨著人類活動(dòng)的擴(kuò)大，食物、環(huán)境中的重金屬含量增加，有效檢測重金屬，確保人類健康生活這一問題在生活中日漸突出，采用熒光法檢測重金屬是很好的選擇。孫覓覓[39]基于紫脲酸銨(Mu)與鎘離子相互作用產(chǎn)生紫外可見光譜的變化，檢測出鎘離子檢測范圍為0～35 μmol/L，紫外檢測限為0.21 μmol/L,并成功用于大米中鎘離子的檢測；陳綺嫻[40]以鹽酸多巴胺為碳源，鄰苯二胺為修飾劑將熒光碳納米材料與紙芯片結(jié)合，發(fā)現(xiàn)該材料對(duì)Hg2+具有高選擇性，ρ(Hg2+)=0.04～0.610 μg/mL，對(duì)Hg2+表現(xiàn)出良好的線性響應(yīng),檢出限低至0.000 6 μg/mL(S/N=3，n=6)；王冠等[41]以玻璃纖維紙為基體，碲化鎘量子點(diǎn)為熒光響應(yīng)材料，3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)為單體，正硅酸四乙酯(TEOS)為交聯(lián)劑在玻璃紙表面分別合成鎘和鉛離子印跡聚合物，檢測出鎘離子的線性范圍為0.05～80.0 μg/L,檢出限為0.01 μg/L；鉛離子的線性范圍為0.10～78.0 μg/L，檢出限為0.03 μg/L。實(shí)際樣品檢測的回收率分別為98.0%～104.0%和99.4%～103.4%；Junrui Zhou等[42]首次利用離子印刷技術(shù)將新型熒光量子點(diǎn)ZnSe應(yīng)用于3D紙基微流控芯片，用來單獨(dú)或同時(shí)檢測鎘離子和鉛離子。檢測出該紙芯片對(duì)鎘離子的檢測范圍為1～70 μg/L，最低限為0.245 μg/L；鉛離子的檢測范圍為1～60 μg/L，最低限為0.335 μg/L。

1.2.2 蛋白質(zhì)檢測

同樣，熒光法也可用于蛋白質(zhì)的檢測。郭小艷[43]利用紙芯片免疫分析方法檢測免疫球蛋白，采用順序噴墨打印技術(shù)測定免疫球蛋白(IgG)的檢出限為0.4 ng/mL；陳瑩[44]利用量子點(diǎn)信號(hào)標(biāo)記物實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌胚抗原(CEA)和前列腺蛋白(PSA)的檢測，測定出線性范圍分別為1.0～40.0 ng/mL和1.0～45.0 ng/mL，檢出限分別為0.3 ng/mL和0.4 ng/mL。

1.2.3 農(nóng)藥檢測

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用農(nóng)藥，在一定程度上提高了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量，但是超標(biāo)的農(nóng)藥殘留同樣對(duì)環(huán)境、人體有不同程度的危害，所以應(yīng)該密切關(guān)注農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥的殘留量。楊鋮[45]將能識(shí)別目標(biāo)農(nóng)藥的適配體與基于熒光內(nèi)濾效應(yīng)(IFE)的金納米(AuNPs)-量子點(diǎn)(CdTe QDs)體系相結(jié)合，并與最優(yōu)的混合區(qū)通道組合，檢測出該系統(tǒng)對(duì)啶蟲脒的檢測范圍為50～600 μg/kg；對(duì)丙溴磷的檢測范圍為60～480 μg/kg，均低于國標(biāo)中的農(nóng)藥最大殘留限量。

1.3 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法是檢測對(duì)象與檢測體系之間經(jīng)過反應(yīng)發(fā)光，通過分析發(fā)光時(shí)間、發(fā)光強(qiáng)度等因素得出檢測結(jié)論的一種方法。采用化學(xué)發(fā)光法，要合理選擇背景，通過優(yōu)化各項(xiàng)條件使發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定，發(fā)光時(shí)間便于檢測，減少干擾。臨床上利用化學(xué)發(fā)光法檢測腫瘤、病毒等效果大多優(yōu)于放射免疫法、酶聯(lián)免疫法。目前已有公司利用化學(xué)發(fā)光法制作試劑盒來檢測新冠肺炎病毒。

1.3.1 蛋白質(zhì)檢測

化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)常用于醫(yī)療領(lǐng)域，該方法具有較高的精確性。于麗娟[46]基于甲胎蛋白上所標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP)能催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光，通過分析發(fā)光強(qiáng)度與甲胎蛋白(AFP)濃度的關(guān)系，檢測出了實(shí)際血清中的AFP；劉蒙蒙[47]基于血紅蛋白質(zhì)和肌紅蛋白質(zhì)都含有血紅素分子，能作為催化劑使魯米諾-過氧化氫體系發(fā)光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白質(zhì)定性低檢測限的分析。

1.3.2 化學(xué)物質(zhì)檢測

Hideyuki Matsuura等[48]利用噴蠟打印法將發(fā)光的報(bào)告蛋白固定在紙芯片上一排反應(yīng)圈中，該紙芯片能用于人全血中氨基糖苷類物質(zhì)的檢測，利用樣品檢測的數(shù)碼相機(jī)檢測發(fā)光信號(hào)，檢測結(jié)果在30～60 min呈現(xiàn)。該芯片為氨基糖苷類藥物抗生素的檢測治療提供了新思路，適用于不發(fā)達(dá)地區(qū)。

1.4 電化學(xué)法

電化學(xué)法是通過在紙芯片上建立電極，檢測樣品加入時(shí)能產(chǎn)生電流，在相關(guān)檢測儀器的處理下分析出結(jié)果的方法。該方法具有較高的靈敏度，能進(jìn)行高質(zhì)量的檢測，同時(shí)設(shè)計(jì)紙芯片時(shí)通常考慮電極材料、電壓大小、反應(yīng)時(shí)間、溶劑配比、樣品添加量等常見因素，制作思路較清晰。

1.4.1 離子檢測

離子的檢測不同于其他化合物較簡單的檢測，目前人們大多從離子帶電這一角度入手，采用電化學(xué)法進(jìn)行檢測。于涵等[49]通過滴涂導(dǎo)電碳漿及Ag/AgCl漿，分別制備了固態(tài)聚合物膜鈣離子選擇性指示電極和固態(tài)聚合物膜參比電極，用于海水中Ca2+的檢測，結(jié)果為在0.5 mol/L NaCl背景下，該系統(tǒng)在c(Ca2+)=1.0×10-4～3×10-2mol/L呈現(xiàn)線性響應(yīng),響應(yīng)斜率為24.3 mV/dec；溫雪飛[50]利用離子濺射儀在銅版紙表面電沉積金，再在銅版紙(Au/paper)電極表面修飾多壁碳納米管(MWCNTs)，加熱烘干后制得MWCNTs/Au/paper工作電極，實(shí)現(xiàn)了對(duì)塑料樣品中重金屬鉻和二酚基丙烷的檢測；Wang Xiaoqing等[51]利用磁控濺射法在硝化纖維紙上構(gòu)建出了一個(gè)三電極系統(tǒng)，利用方波溶出伏安法檢測Cu2+，在ρ(Cu2+)=5～200 μg/L、200～1 000 μg/L顯示出99.58%和98.87%的良好線性，該方法檢測最低限為2 μg/L，同時(shí)也適用于Zn2+、Cd2+、Pd2+、Bi3+等離子的檢測。

1.4.2 化學(xué)物質(zhì)的檢測

電化學(xué)法也能根據(jù)實(shí)際情況用于其他化合物的檢測。Dhouha jemmeli等[52]利用炭黑修飾的墨水制作出的納米紙芯片對(duì)雙酚A有高度敏感性，通過方波伏安法，檢測出河水以及飲用水中的雙酚A含量均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；楊文韜等[53]研發(fā)出一種基于濃差電池原理的紙芯片，通過與智能手機(jī)的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)三氯磷酸酯的快捷、可自供電的定量檢測，檢出限為0.89 μmol/L。

1.5 電化學(xué)發(fā)光法

電化學(xué)發(fā)光法是電化學(xué)法和化學(xué)發(fā)光法的結(jié)合，使結(jié)果更明顯的同時(shí)也能適用于平時(shí)檢測難度較大的對(duì)象，目前使用電化學(xué)發(fā)光法的資料較少，該方法也因此具有巨大潛力。王嘉偉[54]研制出一種在紙基上進(jìn)行的酶催化反應(yīng)，結(jié)合智能手機(jī)作為檢測的新型電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，可用于經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)人民健康檢測；Yu Chen等[55]研發(fā)出一種基于電化學(xué)發(fā)光法通過生物傳感器檢測乙肝表面抗體的紙芯片，利用循環(huán)伏安法和電化學(xué)發(fā)光法，得出線性范圍為34.2 pg/mL～34.2 ng/mL，該紙芯片相比于其他方法具有更高的選擇性和敏感性。

1.6 其他方法

1.6.1 光電檢測法

近年來光電檢測法也逐漸適用于紙芯片，該方法通常結(jié)合其他檢測方法一起使用，也為紙芯片后續(xù)的檢測提供了新思路。楊寧[56]等通過構(gòu)造橋式復(fù)合結(jié)構(gòu)提升微流控酶抑制顯色反應(yīng)的均勻度，設(shè)計(jì)出集化學(xué)反應(yīng)、光吸收反射效應(yīng)和環(huán)境參數(shù)控制于一體的農(nóng)藥檢測系統(tǒng)，該方法分辨率達(dá)0.002 mg/L，與YPS-1168型便攜式農(nóng)藥檢測儀檢出限相當(dāng)，但試劑消耗價(jià)格降低了94.79%，時(shí)間縮短了23%；李振[57]基于酶抑制生化反應(yīng)在紙基微流控芯片上檢測的基本原理，引入反射式光電檢測和熒光光電檢測技術(shù)，在進(jìn)行了信息采集、公式采集、誤差分析之后，運(yùn)用反射式光電檢測的紙基微流控芯片(RPPMC)法和面向熒光檢測的紙基微流控芯片(FPMC)法分別檢測敵百蟲時(shí)對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)為0.982和0.996，檢出限為0.010和0.007 mg/L；檢測對(duì)硫磷時(shí)對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)為0.984和0.978，檢出限為0.014和0.012 mg/L。

1.6.2 一體化檢測模型

傳統(tǒng)紙芯片檢測方法分為檢測和分析2個(gè)步驟，一體化檢測模型借助于不同儀器將檢測和分析過程一次完成，提高了紙芯片的簡便性。Ruey-Jen Yang等[58]基于3D紙基微流控芯片制作出一種新型一體化檢測模型，用于檢測人全血樣品中白蛋白的濃度。檢測時(shí)首先在紙芯片檢測區(qū)域添加溴甲酚綠(BCG)，并將該模型儲(chǔ)存在15 ℃的氮?dú)猸h(huán)境中；然后加入10 μL全血樣品，樣品會(huì)與BCG反應(yīng)，加熱使溫度上升至37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為6 min。結(jié)果表明，模型分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果(R2=0.983 7和R2=0.996 8)一致，該一體化模型可用于白蛋白的快速檢測。

綜合比較以上方法，可總結(jié)出紙芯片常用4種方法的特點(diǎn)，見表1。

表1 紙芯片常用4種檢測方法的特點(diǎn)

2 結(jié)束語

紙芯片因其具有低成本、便攜性、檢測快速、結(jié)果分明、無需高端檢測設(shè)備與技術(shù)人員等優(yōu)點(diǎn)可大量運(yùn)用于不發(fā)達(dá)地區(qū)以及日常生活中。在紙芯片的檢測方法中，比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法操作簡單，結(jié)果易分辨，適用于日常檢測及自我檢測；電化學(xué)法制備紙芯片有一定難度，使用受限，需要相關(guān)儀器配合使用，通常用于專業(yè)性的離子檢測。紙芯片在醫(yī)療方面的疾病診斷、藥物含量檢測、食品安全方面的有害物質(zhì)檢測、環(huán)境方面的污染物檢測等有很大的應(yīng)用前景。

隨著社會(huì)需求的變化，關(guān)于優(yōu)化紙芯片檢測，應(yīng)該考慮設(shè)計(jì)出更加靈敏、一體化、多功能、有效期長、便于儲(chǔ)存的紙芯片。還可以考慮能否用紙芯片代替更多傳統(tǒng)的檢測，特別是在疾病檢測，健康保健方面可加強(qiáng)與智能手機(jī)的聯(lián)系，將紙芯片推廣進(jìn)日常生活中，為人們帶來更多便利。