陳希海，胡世洋，寧艷春，徐友海，于國(guó)強(qiáng)

(1.吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林 吉林 132101；2.中國(guó)石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021；3.白山市科學(xué)技術(shù)研究所，吉林 白山 134300)

目前，國(guó)內(nèi)主要燃料乙醇生產(chǎn)廠家均采用傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝(分步糖化發(fā)酵)即先糖化、后發(fā)酵的工藝，發(fā)酵成熟醪中φ(乙醇)≈12%，乙醇得率92%～93%，淀粉利用率高于90%，發(fā)酵時(shí)間少于60 h。而美國(guó)主要燃料乙醇生產(chǎn)廠家均采用同步糖化發(fā)酵工藝，即將液化后的液化醪與糖化酶混合后，接入酵母進(jìn)行發(fā)酵[1-2]。同步糖化發(fā)酵不經(jīng)過(guò)單獨(dú)糖化過(guò)程，這樣不但省去了糖化過(guò)程，節(jié)省了糖化裝置及相關(guān)的附屬配套設(shè)備投資，減少了動(dòng)力、水、人工、維修等方面的消耗，還可以消除糖化過(guò)程中產(chǎn)物的抑制，糖濃度高易引起雜菌生長(zhǎng)等問(wèn)題[3-7]。

同步糖化發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝最大的不同在于將糖化過(guò)程和發(fā)酵過(guò)程2個(gè)工序結(jié)合在一起，沒(méi)有經(jīng)過(guò)58～62 ℃的糖化過(guò)程，避免了在此溫度下雜菌的產(chǎn)生，也避免了發(fā)酵醪液中由于糖濃度過(guò)高而引起對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)生的抑制作用，保證了發(fā)酵的產(chǎn)量與質(zhì)量。另外，同步糖化過(guò)程簡(jiǎn)化了反應(yīng)過(guò)程，縮減了生產(chǎn)周期，降低了能耗[8-21]。因此，作者以燃料乙醇生產(chǎn)裝置的液化醪為原料，基于燃料乙醇公司生產(chǎn)現(xiàn)狀開(kāi)展同步糖化發(fā)酵技術(shù)研究，篩選出影響同步糖化發(fā)酵效果的顯著性因素和較優(yōu)的同步糖化發(fā)酵工藝條件，為燃料乙醇公司工藝優(yōu)化提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與儀器

玉米液化醪：w(固)=28%(DE值為18%～26%)，液化醪液初始ρ(葡萄糖)=214 g/L，液化醪低于-50 ℃冷凍保存?zhèn)溆?，吉林燃料乙醇公司；安琪超?jí)釀酒活性干酵母：酵母細(xì)胞總數(shù)(億個(gè)/g)≥200，安琪酵母股份有限公司；植酸酶：酶活10萬(wàn)U/mL，山東隆大生物工程有限公司；酸性蛋白酶：酶活10萬(wàn)U/mL，杰能科中國(guó)生物工程有限公司；糖化酶：酶活20萬(wàn)U/mL，諾維信中國(guó)生物技術(shù)有限公司；酵母促進(jìn)劑：安琪酵母股份有限公司。

高效液相色譜儀：LC-20A plus，日本島津公司；潔凈工作臺(tái)：W-CJ-1FDS，上海昕?jī)x公司；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：3870ELVC-D，以色列騰氏公司；高速冷凍離心機(jī)：Sigma3-30K，德國(guó)Sigma公司；立式振蕩培養(yǎng)箱全溫?fù)u床：ZQPL-200，天津萊玻特瑞公司；微孔板光譜儀：Plus384，美國(guó)美谷分子公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

發(fā)酵：在300 mL搖瓶(裝液量為100 mL)中，以玉米液化醪液為原料，發(fā)酵溫度為26～38 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，發(fā)酵周期為48～72 h，定期取樣(取樣量1 mL)分析醪液中主要成分變化情況。

1.3 還原糖、葡萄糖及乙醇含量的測(cè)定方法

發(fā)酵成熟醪液中ρ(葡萄糖)<0.7 g/L作為發(fā)酵終點(diǎn)指標(biāo)。葡萄糖和乙醇采用液相色譜(NREL/TP-510-42623 January 2008)進(jìn)行測(cè)定。首先，將待測(cè)樣品1 mL放入2.0 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，將上清液稀釋10倍后用0.22 μm的水系濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中。再用HPLC(檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；色譜柱：HPX-87H；流速：0.6 mL/min；流動(dòng)相：0.005 mol/L硫酸；柱溫：55 ℃)進(jìn)行樣品成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 同步糖化溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響

在搖瓶發(fā)酵條件下，研究同步糖化溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵效果的影響。以w(固)=28%玉米液化醪液為原料，在t=26、28、30、32、36、38 ℃條件下，開(kāi)展同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。添加量分別為糖化酶120 u/g，酵母0.03 g/L，酸性蛋白酶20 μL/L，發(fā)酵周期為24、48 h。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 同步糖化溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響 ρ/(g·L-1)

由表1可知，以發(fā)酵成熟醪液ρ(葡萄糖)<0.7 g/L作為發(fā)酵終點(diǎn)指標(biāo)時(shí)，t=26～38 ℃，發(fā)酵24 h，隨著同步糖化發(fā)酵溫度的提高發(fā)酵速率逐漸升高，t=36 ℃，乙醇發(fā)酵速率達(dá)到最高，ρ(乙醇)=72.23 g/L。發(fā)酵48 h，t=32～36 ℃，ρ(乙醇)≈103 g/L，ρ(葡萄糖)<0.7 g/L。結(jié)果表明，同步糖化發(fā)酵適宜溫度為t=32～36 ℃。

2.2 利用Placket-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響同步糖化發(fā)酵效果的顯著性因素

開(kāi)展PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以植酸酶、酸性蛋白酶、糖化酶、酵母和酵母促進(jìn)劑添加量為條件因素，考察對(duì)同步糖化發(fā)酵效果的影響。以w(固)=28%的玉米液化醪為原料，t=32 ℃，開(kāi)展同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。利用Minitab 16軟件中的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析功能，對(duì)影響同步糖化發(fā)酵效果的植酸酶、酸性蛋白酶、糖化酶、酵母、酵母促進(jìn)劑的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，分別以發(fā)酵24 h的ρ(葡萄糖)及ρ(乙醇)為相應(yīng)值考察各因素的P值(P≤0.05時(shí)具有顯著性影響)情況。結(jié)果見(jiàn)表2～表4。

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的同步糖化發(fā)酵情況

表3 植酸酶、酸性蛋白酶、糖化酶、酵母、酵母促進(jìn)劑對(duì)葡萄糖的PB分析

表4 植酸酶、酸性蛋白酶、糖化酶、酵母、酵母促進(jìn)劑對(duì)乙醇的PB分析

由表3和表4可知，植酸酶P值分別為0.927和0.695，酸性蛋白酶P值分別為0.031和0.001，糖化酶P值分別為0和0.486，酵母P值分別為0.015和0.003，酵母促進(jìn)劑P值分別為0.427和0.183。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，酸性蛋白酶、糖化酶和酵母是影響同步糖化發(fā)酵效果的顯著性因素。

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定中心復(fù)合設(shè)計(jì)中糖化酶、酸性蛋白酶及酵母用量的中心點(diǎn)及步長(zhǎng)

開(kāi)展最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，以酸性蛋白酶、糖化酶和酵母用量為條件因素，考察對(duì)同步糖化發(fā)酵效果的影響。以w(固)=28%的玉米液化醪為原料，t=32 ℃，開(kāi)展同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的同步糖化發(fā)酵情況1)

由表5可知，當(dāng)以發(fā)酵醪液中ρ(葡萄糖)<0.7 g/L作為控制指標(biāo)時(shí)，同步糖化發(fā)酵合理的添加量為糖化酶110～145 u/g，酸性蛋白酶15～30 μL/L，酵母0.02～0.03 g/L，發(fā)酵周期為48～66 h。依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定了添加量中心點(diǎn)分別為酸性蛋白酶20 μL/L，步長(zhǎng)6 μL/L；糖化酶120 u/g，步長(zhǎng)15 u/g；酵母0.025 g/L，步長(zhǎng)0.005 g/L。

1) “-”表示未檢出，下同。

2.4 通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定各因子之間的交互作用及較優(yōu)的同步糖化發(fā)酵工藝條件

開(kāi)展響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以酸性蛋白酶、糖化酶、酵母為研究對(duì)象，考察對(duì)同步糖化發(fā)酵效果的影響。以w(固)=28%的玉米液化醪為原料，t=32 ℃，采用已確定的中心點(diǎn)及步長(zhǎng)開(kāi)展同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵周期為48～72 h。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表6，各因子間的交互關(guān)系見(jiàn)表7，建立了同步糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化模型。

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的同步糖化發(fā)酵情況

續(xù)表

表7 發(fā)酵24 h乙醇含量與酸性蛋白酶、糖化酶及酵母用量的交互關(guān)系

由表6和表7可知，當(dāng)以發(fā)酵醪液中的ρ(葡萄糖)<0.7 g/L作為控制指標(biāo)時(shí)，添加量分別為糖化酶95～145 u/g，酸性蛋白酶14～30 μL/L，酵母0.017～0.033 g/L，發(fā)酵周期為48～72 h。其中，發(fā)酵24 hφ(乙醇)估計(jì)回歸系數(shù)分別為S=1.213 55，PRESS=89.254 5，R-Sq=93.51%，R-Sq預(yù)測(cè)=60.67%，R-Sq調(diào)整=87.67%。

2.5 同步糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化模型的驗(yàn)證

對(duì)同步糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化模型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，在優(yōu)化的各因子濃度范圍內(nèi)隨機(jī)選取6個(gè)條件，以w(固)=28%的玉米液化醪為原料，t=32 ℃，開(kāi)展同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8可知，添加量分別為酸性蛋白酶14～26 μL/L，糖化酶95～110 u/g，酵母0.02～0.03 g/L，發(fā)酵24 h，發(fā)酵實(shí)際測(cè)量值與模型預(yù)測(cè)的φ(乙醇)值的誤差為-4.78%～1.27%。

表8 驗(yàn)證同步糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化模型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性

3 結(jié) 論

確定同步糖化發(fā)酵適宜溫度為32～36 ℃。通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)影響同步糖化發(fā)酵效果的植酸酶、酸性蛋白酶、糖化酶、酵母和酵母促進(jìn)劑因素中，篩選出酸性蛋白酶用量、糖化酶用量、酵母用量是顯著性因素。利用響應(yīng)曲面回歸建立了實(shí)驗(yàn)室小試同步糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化模型。上述實(shí)驗(yàn)為建立工業(yè)化應(yīng)用的同步糖化發(fā)酵工藝優(yōu)化模型奠定了基礎(chǔ)。