楊景煜,顧珈榕，郭 靜，楊 瑞，王文成，李云鳳，徐 平，顧金海

皮膚惡性黑素瘤(CMM)是人類(lèi)皮膚癌中惡性程度最高的腫瘤[1]，發(fā)展快、轉(zhuǎn)移早、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差，目前的總體療效并不理想[2]，亟須進(jìn)一步研究以尋求有效的治療靶點(diǎn)和方法。Zwilch是一種新近才被篩選出來(lái)的致癌基因，在CMM與正常組織之間表達(dá)差異極為顯著，且表達(dá)水平與CMM患者的病理分級(jí)、分期等均顯著相關(guān)，在CMM的臨床診治及預(yù)后評(píng)估方面極具潛在價(jià)值[3]。然而目前關(guān)于Zwilch的報(bào)道較少，作用機(jī)制仍未闡明。本研究以CMM細(xì)胞為對(duì)象，初步探討靶向沉默Zwilch 對(duì)其增殖和凋亡產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：人皮膚惡性黑素瘤細(xì)胞A375購(gòu)自中科院上海細(xì)胞資源中心，在含10%胎牛血清(美國(guó)HyClone)、1×105U/L青霉素(美國(guó)Sigma)、100 mg/L鏈霉素(美國(guó)Sigma)的DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco)中于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)孵育，細(xì)胞系貼壁生長(zhǎng)。分3組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組，常規(guī)條件培養(yǎng)的A375細(xì)胞；sh-NC(sh-Negative Control)組：感染sh-NC慢病毒的A375細(xì)胞；sh-Zwilch組：感染sh-Zwilch慢病毒的A375細(xì)胞。sh-NC、sh-Zwilch慢病毒均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司。感染時(shí)，選擇狀態(tài)良好的A375細(xì)胞，以5×104個(gè)/孔接種于12孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到30%，按照MOI=2.0加入0.9 μL慢病毒，采用Normal+Polybrene的方式感染，培養(yǎng)24 h 后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)感染72 h 后觀察慢病毒上報(bào)告基因GFP 的表達(dá)情況。

1.2 主要試劑材料：兔抗人Zwilch單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，GAPDH 多克隆抗體(AB-P-R 001)購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司。PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司，引物由上海生工合成。Western blotting相關(guān)試劑、Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量LPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：sh-RNA感染A375細(xì)胞72 h 后觀察GFP 熒光率大于80%者分于12孔板中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿(mǎn)后收集細(xì)胞，PBS清洗3次，依據(jù)操作手冊(cè)用TRIzol 試劑盒提取總RNA，用GoScriptTM Reverse Transcription System進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴(kuò)增。Zwilch引物序列：上游為5’-CGTCTCCTTCAGCTGATGTCC-3’，下游為5’-TGGTCCAACATTTTCGCCAGT-3’；GAPDH引物序列：上游為5’- CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游為5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共35個(gè)循環(huán)后再72℃延伸6 min。以2-ΔΔCt值(Ct 代表循環(huán)閾值)表示Zwilch mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5 次。

1.4 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)：sh-RNA感染A375細(xì)胞72 h 后觀察GFP 熒光率大于80%者分于6孔板中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿(mǎn)后收集細(xì)胞，加入預(yù)冷裂解液在冰浴中充分裂解細(xì)胞，提取全蛋白，BCA法分析定量。取10 μg總蛋白樣品，用10%的TrisGlycine膠進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用TBST配制的牛奶封閉1 h，加入一抗(體積稀釋比為1∶3 000)4 ℃ 孵育過(guò)夜。其后用TBST洗膜5 min，用熒光二抗(體積稀釋比為1∶5 000)避光室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min 5次后用奧德賽(ODYSSEY CLx)曝光。掃描灰度并計(jì)算蛋白相應(yīng)的表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5 次。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖：sh-RNA感染A375細(xì)胞72 h 后觀察GFP 熒光率大于80%者分于24孔板接種5×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸液體積為1 mL，在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d 后，每孔加入100 μl CCK-8液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度(D450)。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5 次。

1.6 Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡：sh-RNA感染A375細(xì)胞72 h 后觀察GFP 熒光率大于80%者分于6孔板中培養(yǎng)，長(zhǎng)滿(mǎn)后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，2 000 rpm離心2 min，棄上清，加入500 μl binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V混勻后，再加入5 μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5 次。

2 結(jié)果

2.1 shRNA慢病毒感染對(duì)A375細(xì)胞Zwilch mRNA及蛋白表達(dá)的影響：實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blotting結(jié)果顯示，慢病毒感染72 h后，與對(duì)照組比較，sh-Zwilch組細(xì)胞的Zwilch mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，而sh-NC則無(wú)明顯影響。這表明shRNA慢病毒能夠靶向沉默人CMM 細(xì)胞A375中 Zwilch 的表達(dá)和作用，從而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

2.2 靶向沉默Zwilch對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響：CCK-8結(jié)果顯示，慢病毒感染實(shí)現(xiàn)Zwilch靶向沉默后1 d ，sh-Zwilch組細(xì)胞的活性比對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；其后隨時(shí)間延長(zhǎng)到2～5 d 時(shí)，細(xì)胞活性的降低更加明顯(P<0.05)。這表明靶向沉默Zwilch能夠隨時(shí)間抑制A375細(xì)胞的增殖，從而為后續(xù)以Zwilch為靶點(diǎn)進(jìn)行人皮膚黑素瘤靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.3 靶向沉默Zwilch對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，慢病毒感染實(shí)現(xiàn)Zwilch靶向沉默后，sh-Zwilch組細(xì)胞的凋亡率比對(duì)照組明顯增多(P<0.05)(圖1，目錄后)，表明靶向沉默Zwilch能夠促進(jìn)人CMM 細(xì)胞A375的凋亡，為其機(jī)制研究提供依據(jù)。

3 討論

人皮膚惡性黑素瘤(CMM)是一種轉(zhuǎn)移早、發(fā)展快、治療難、預(yù)后差的高惡性腫瘤，瘤細(xì)胞的異常增殖是其突出的生物學(xué)特性，過(guò)程很復(fù)雜，但歸根結(jié)底是由腫瘤細(xì)胞的異常有絲分裂造成的[4-5]。研究表明，真核生物的細(xì)胞有絲分裂是一個(gè)精巧復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，必須由紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)(SAC)實(shí)時(shí)監(jiān)控才能保證遺傳信息的平均分配[6]。而SAC系統(tǒng)則由主要成分(Mad1/2/3、BubR1、Bub1/3等)、動(dòng)粒蛋白(RZZ復(fù)合體、Ndc80復(fù)合物等)、微管馬達(dá)(dynein、CENP-E等)及效應(yīng)器(cdc20、APC/C等)四部分組成[7]。其中RZZ復(fù)合體主要由Rough Deal(Rod)、Zeste-white 10(Zw10) 和 Zwilch組成，在細(xì)胞有絲分裂中起著募集dynein/dynactin、Mad1-Mad2到著絲粒并促進(jìn)受體結(jié)合，以保證有絲分裂正常進(jìn)行的重要作用[8-11]。目前研究已經(jīng)證實(shí)RZZ復(fù)合體與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[12]。

Zwilch是RZZ復(fù)合體中目前研究最少的一種成分，直到2002年才在果蠅中被發(fā)現(xiàn)[13]。我們的前期研究表明，Zwilch在CMM與正常組織之間表達(dá)差異極為顯著，且其表達(dá)水平與CMM患者的病理分級(jí)、分期等均顯著相關(guān)，在CMM的臨床診治及預(yù)后評(píng)估方面極具潛在價(jià)值[3]。因此本課題對(duì)靶向沉默Zwilch對(duì)CMM細(xì)胞增殖和凋亡的影響進(jìn)行了基礎(chǔ)研究。結(jié)果顯示，通過(guò)shRNA慢病毒感染實(shí)現(xiàn)Zwilch靶向沉默后，A375細(xì)胞的細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯增多(P<0.05)。這些結(jié)果表明，靶向沉默Zwilch能夠抑制人CMM 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，從而為進(jìn)一步研究Zwilch在人CMM發(fā)病中的作用及機(jī)制、以及后續(xù)以Zwilch為靶點(diǎn)進(jìn)行人皮膚黑素瘤靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。