陰宏婕，鞠化鵬，鐘利敏，孫 娜，林松毅,*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；2.贛州市全標(biāo)生物科技有限公司，江西 贛州 341100）

核黃素，即VB2，是一種水溶性維生素。它在生物氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞功能和生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)面發(fā)揮很重要的作用。核黃素是黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸的前體物質(zhì)[1-2]。這兩種物質(zhì)是核黃素主要的生物活性形式，也是合成還原酶、氧化酶和脫氫酶的主要形式[3]。人體自身不能合成核黃素，必須通過小腸從飲食中獲取[4]。核黃素缺乏在年輕和老年人群中普遍存在，甚至在發(fā)達(dá)國(guó)家也是如此[5]。核黃素的缺乏會(huì)引起很多人體的不良反應(yīng)和疾病，如生長(zhǎng)遲緩、貧血、皮膚損傷、腎臟損害和神經(jīng)退行性病變[6]。

核黃素結(jié)合蛋白作為黃素-蛋白相互作用的模型已被研究多年。Rhodes等[7]最先從雞蛋清中發(fā)現(xiàn)核黃素結(jié)合蛋白。之后研究者相繼在原核生物和真菌中發(fā)現(xiàn)核黃素結(jié)合蛋白[8-9]。有研究報(bào)道稱，核黃素在人體內(nèi)通過核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（human riboflavin transporter，hRFVT）1、hRFVT-2和hRFVT-3被腸道吸收[10-12]。近年來(lái)，核黃素與蛋白之間的相互作用也得到進(jìn)一步研究。Zhao Hongwei等[13]的研究表明，核黃素可以與人血清白蛋白和牛血清白蛋白結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)為色氨酸殘基；Sengupta等[14]利用穩(wěn)態(tài)熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)核黃素與人血清白蛋白的色氨酸214殘基結(jié)合。然而，關(guān)于核黃素與肽之間相互作用的研究尚鮮見報(bào)道。

核黃素可與蛋白多肽鏈中的色氨酸發(fā)生相互作用而結(jié)合，且色氨酸具有抗氧化能力，可以提高多肽清除自由基的能力[15]。本課題組前期研究通過酶解、Sephadex凝膠G-25過濾柱層析法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法從分子質(zhì)量3～10 kDa的松仁粕蛋白中提取并純化得到一種新型松子肽Ac-QWFCT，該新型松子肽具有良好的抗氧化活性[16]。本實(shí)驗(yàn)采用松子肽Ac-QWFCT與核黃素相互作用制備核黃素結(jié)合肽。用掃描電子顯微鏡觀察核黃素結(jié)合肽的微觀結(jié)構(gòu)；基于RAW264.7細(xì)胞研究肽Ac-QWFCT、核黃素以及核黃素結(jié)合肽對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性、中性紅吞噬率和NO釋放率的影響；通過測(cè)定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽(yáng)離子自由基清除率評(píng)價(jià)核黃素結(jié)合肽抗氧化活性；利用熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜和核磁共振氫譜研究肽Ac-QWFCT與核黃素的相互 作用；通過翻轉(zhuǎn)腸囊法研究核黃素結(jié)合肽在大鼠腸道的吸收特性。本研究可為新型VB2補(bǔ)充劑的開發(fā)提供理論參考和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供；Wistar雄性大鼠（體質(zhì)量180～220 g；生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001）購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)前于大連工業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（使用許可證號(hào)：SYXK（遼）2017-0005）適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

肽Ac-QWFCT 合肥賽曼諾生物科技有限公司；核黃素、DPPH、ABTS、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜、重水（純度99.8%） 美國(guó)Sigma公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素混合液、L-谷氨酰胺、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國(guó)Gibco公司；中性紅檢測(cè)試劑盒、NO檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甲醇 北京化工廠；乙腈、甲酸 美國(guó)Fisher公司；溴化鉀 天津光復(fù)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

JSM-7800F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)博騰儀器有限公司；AVANCE III 400 MHz型核磁共振波譜儀 德國(guó) Bruker公司；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；ACQUITY UPLC H-Class PLUS超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；BT125D電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核黃素結(jié)合肽的制備

稱取一定量的肽Ac-QWFCT與核黃素，溶解于蒸餾水中。將肽溶液與核黃素溶液按照物質(zhì)的量比10∶1混合。配制的混合溶液在室溫下避光磁力攪拌3 h。樣品經(jīng)真空冷凍干燥成粉末，放置在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

參照J(rèn)in Yan等[17]的方法，利用掃描電子顯微鏡觀察肽Ac-QWFCT、核黃素和核黃素結(jié)合肽的微觀結(jié)構(gòu)。 將10 μL樣品溶液滴加在矩形銅塊上的圓形凹槽內(nèi)。將銅塊浸入液氮中預(yù)冷抽真空，然后將樣品置于15 mA電流下鍍金90 s。最后將樣品置于5 kV加速器電位下拍照。

1.3.3 免疫活性檢測(cè)

1.3.3.1 RAW264.7細(xì)胞活性檢測(cè)

細(xì)胞處理：參照Yuan Qingxia等[18]的方法，將指數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞密度2×105個(gè)/mL，每孔接種100 μL。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液，分別加入終質(zhì)量濃度為12.5、25、50 μg/mL的肽Ac-QWFCT、核黃素和核黃素結(jié)合肽溶液；以不含樣品溶液的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，加入含終質(zhì)量濃度25 μg/mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照。

在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2 次，加入150 μL二甲基亞砜。室溫放置10 min后用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度。細(xì)胞存活率按式（1）計(jì)算。

式中：A樣品為樣品組溶液A490nm；A對(duì)照為空白對(duì)照組溶液A490nm。

1.3.3.2 RAW264.7細(xì)胞中性紅吞噬率和NO釋放率測(cè)定

中性紅吞噬率：細(xì)胞處理方法同1.3.3.1節(jié)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸取50 μL上清液備用，用PBS清洗3 次，向每孔加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.075%的中性紅溶液，培養(yǎng)4 min。棄掉中性紅溶液，用PBS清洗2 次，再向每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液（1 mol/L無(wú)水乙醇-乙酸，1∶1，V/V），室溫下裂解30 min。用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度。中性紅吞噬率按式（2）計(jì)算。

式中：A樣品為樣品組溶液A540nm；A對(duì)照為空白對(duì)照組溶液A540nm。

NO釋放率：細(xì)胞處理方法同1.3.3.1節(jié)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸取50 μL細(xì)胞上清液，按照NO檢測(cè)試劑盒說明書操作步驟，每孔分別加入50 μL Griess I試劑和50 μL Griess II試劑。用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度。以溶液吸光度為縱坐標(biāo)，NO濃度為橫坐標(biāo)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝0.0128X+0.0426（R2＝0.9995）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞內(nèi)NO濃度。

1.3.4 抗氧化活性檢測(cè)

DPPH自由基清除率測(cè)定：參照Yang Ruiwen等[16]的方法，將一定質(zhì)量濃度的樣品溶液、甲醇溶液和DPPH-甲 醇溶液各取100 μL，加入96 孔板中，空白組用甲醇代替樣品溶液。室溫下避光30 min后，用酶標(biāo)儀于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)體系溶液吸光度。DPPH自由基清除率按 式（3）計(jì)算。

式中：A樣品為樣品組反應(yīng)體系溶液517 nm波長(zhǎng)處吸光度；A空白為空白組反應(yīng)體系溶液517 nm波長(zhǎng)處吸光度。

ABTS陽(yáng)離子自由基清除率測(cè)定：參照Liang Rong等[19]的方法，將ABTS用蒸餾水配制成濃度7 mmol/L的溶液，室溫下避光放置12～16 h。用蒸餾水稀釋ABTS溶液直至其在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度為0.70±0.02。將50 μL一定質(zhì)量濃度的樣品溶液和150 μL稀釋后的ABTS溶液加入96 孔板中，室溫下避光反應(yīng)60 min。用酶標(biāo)儀于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)體系溶液吸光度。以相同體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液替代樣品溶液為空白組。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率按式（4）計(jì)算。

式中：A樣品為樣品組反應(yīng)體系溶液734 nm波長(zhǎng)處吸光度；A空白為空白組反應(yīng)體系溶液734 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.3.5 熒光光譜測(cè)定

參照Duurkens等[20]描述的實(shí)驗(yàn)方法，將3 mL樣品溶液置于1 cm四通石英比色皿中，在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定300～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。激發(fā)和發(fā)射光譜狹縫寬度均為5 nm。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定

采用Sun Na等[21]的方法，取200 mg干燥后的溴化鉀（130 ℃下干燥8 h以上）和2 mg樣品在研缽中研磨成均勻粉末，壓成薄片，進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜測(cè)定。波數(shù)掃描范圍4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.7 核磁共振氫譜分析

參照Xing Jie等[22]的方法，將5 mg核黃素、肽Ac-QWFCT 和核黃素結(jié)合肽粉末溶解在500 μL重水中，將不同樣品溶液置于5 mm核磁管中。檢測(cè)探頭為BBFO探頭（5 mm），脈沖寬度13 μs、抽樣延遲時(shí)間6 s、采樣頻率32。

1.3.8 大鼠外翻腸囊研究樣品吸收特性

將Wistar雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行大鼠外翻腸囊研究。參照Wang Liying等[23]的方法，大鼠禁食12～18 h后，腹腔注射2 mL巴比妥鈉麻醉。切開腹部，迅速收集小腸并放置于冰Kreb-Ringer緩沖液中，用細(xì)玻璃棒將腸腔翻轉(zhuǎn)，用Kreb-Ringer緩沖液沖洗腸內(nèi)容物。用絲線將一端系緊，從另一端灌入1 mL Kreb-Ringer緩沖液。將腸囊置于7 mL、37 ℃的核黃素、肽Ac-QWFCT以及核黃素結(jié)合肽溶液中，溶液中通入95% O2和5% CO2。2 h后從漿膜側(cè)收集樣液，用0.22 μm濾膜過濾，進(jìn)行超高效液相色譜分析。

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液；流動(dòng)相B：純乙腈；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；進(jìn)樣體積5 μL；流速0.3 mL/min。洗脫條件：0 min，95%流動(dòng)相A、5%流動(dòng)相B；3.5 min，25%流動(dòng)相A、75%流動(dòng)相B。以核黃素標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算漿膜側(cè)樣液核黃素濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所得結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用SPSS Statistics 20軟件中最小顯著性差異法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。利用MestReCv 4.9.9.6軟件分析采集到的核磁圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 核黃素結(jié)合肽的微觀形態(tài)特征

圖 1 掃描電子顯微鏡觀察核黃素（A）、肽Ac-QWFCT（B） 和核黃素結(jié)合肽（C）的微觀結(jié)構(gòu)（×5000）Fig. 1 Microstructures of riboflavin (A), peptide Ac-QWFCT (B) and riboflavin-binding peptide (C) observed by scanning electron microscope (× 5000)

由圖1可知，核黃素分子呈現(xiàn)大小不均一的顆粒狀分布（圖1A），肽Ac-QWFCT分子在微觀下呈現(xiàn)連續(xù)均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖1B），肽-核黃素復(fù)合物呈現(xiàn)不規(guī)則的絮狀分布（圖1C）。掃描電子顯微鏡圖像顯示，肽與核黃素相互作用后，微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，表明生成了核黃素結(jié)合肽。

2.2 核黃素結(jié)合肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞免疫活性的影響

圖 2 核黃素、肽Ac-QWFCT和核黃素結(jié)合肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力（A）、中性紅吞噬率（B）和NO釋放率（C）的影響Fig. 2 Effect of riboflavin, peptide Ac-QWFCT and riboflavin-binding peptide on cell viability (A), phagocytosis (B) and production of NO (C) in RAW264.7 cells

采用MTT法檢測(cè)核黃素、肽Ac-QWFCT和核黃素結(jié)合肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞是否具有細(xì)胞毒性，結(jié)果如圖2A所示。在質(zhì)量濃度12.5～50 μg/mL范圍內(nèi)，3 種樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞均不具有細(xì)胞毒性。因此可以選擇12.5、25、50 μg/mL這3 種質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

巨噬細(xì)胞的吞噬作用是免疫反應(yīng)中的主要作用[24]，吞噬率的增加是巨噬細(xì)胞活化最主要的特征之一[25]。采用中性紅法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞的吞噬作用，結(jié)果如 圖2B所示。與空白對(duì)照組相比，核黃素、肽Ac-QWFCT和核黃素結(jié)合肽處理后，RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力明顯增強(qiáng)，但明顯低于陽(yáng)性對(duì)照（25 μg/mL LPS）組。核黃素結(jié)合肽處理組RAW264.7細(xì)胞吞噬能力明顯高于核黃素與肽Ac-QWFCT處理組。此外，核黃素結(jié)合肽在質(zhì)量濃度25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞中性紅吞噬率達(dá)到最大， 為（47.53±1.72）%。結(jié)果表明，核黃素、肽Ac-QWFCT和核黃素結(jié)合肽均可以增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，且核黃素結(jié)合肽表現(xiàn)出更好的活性。

NO是一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì)，具有廣泛的免疫學(xué)意義。NO參與一系列生理和病理代謝，影響巨噬細(xì)胞內(nèi)其他細(xì)胞因子的分泌，在活化巨噬細(xì)胞的免疫保護(hù)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[26]。由圖2C可知，在質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL 和25 μg/mL時(shí)，3 個(gè)處理組巨噬細(xì)胞中的NO濃度均高于空白對(duì)照組，說明核黃素、肽Ac-QWFCT和核黃素結(jié)合肽可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中NO的產(chǎn)生；而當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，核黃素處理組細(xì)胞中NO濃度低于空白對(duì)照組。所有樣品處理組的NO濃度均低于陽(yáng)性對(duì)照（25 μg/mL LPS）組。在實(shí)驗(yàn)所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，核黃素結(jié)合肽處理組細(xì)胞內(nèi)NO濃度均顯著高于核黃素和肽Ac-QWFCT組（P＜0.05），且在質(zhì)量濃度25 μg/mL時(shí)，NO濃度達(dá)到最大，為（40.03±0.46）μmol/L。綜上所述，相比于核黃素與肽Ac-QWFCT，核黃素結(jié)合肽可以更有效地提高RAW264.7細(xì)胞的NO釋放量。

2.3 核黃素結(jié)合肽的抗氧化能力分析結(jié)果

圖 3 核黃素、肽Ac-QWFCT和核黃素結(jié)合肽對(duì)DPPH自由基（A） 和ABTS陽(yáng)離子自由基（B）的清除能力Fig. 3 DPPH radical (A) and ABTS cation radical (B) scavenging capacity of riboflavin, peptide Ac-QWFCT and riboflavin-binding peptide

肽Ac-QWFCT是由谷氨酰胺、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸組成。苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸具有提高多肽清除自由基的能力[15]； 半胱氨酸在還原反應(yīng)中可以提供巰基基團(tuán)，也具有抗氧化活性[27-28]。由圖3A可知，在質(zhì)量濃度0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，核黃素的DPPH自由基清除能力沒有明顯變化，而肽Ac-QWFCT、核黃素結(jié)合肽的DPPH自由基清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)；此外，在相同質(zhì)量濃度下，核黃素結(jié)合肽的DPPH自由基清除能力均顯著高于核黃素與肽Ac-QWFCT（P＜0.05）。由圖3B可知，在質(zhì)量濃度0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，核黃素的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力均顯著低于肽Ac-QWFCT和核黃素結(jié)合肽，且不隨質(zhì)量濃度的改變而發(fā)生明顯變化；在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 和0.2 mg/mL時(shí)，核黃素結(jié)合肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力顯著高于肽Ac-QWFCT（P＜0.05）；在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL和1 mg/mL時(shí)，肽Ac-QWFCT與核黃素結(jié)合肽的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力沒有顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，肽Ac-QWFCT與核黃素的結(jié)合明顯地提高了二者的DPPH自由基清除能力，而在低質(zhì)量濃度下，核黃素結(jié)合肽表現(xiàn)出更高的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力。

2.4 核黃素與肽Ac-QWFCT相互作用的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

熒光發(fā)射光譜是研究小分子與生物大分子相互作用的一種重要方法[29]，因此，采用熒光光譜分析核黃素與肽Ac-QWFCT相互作用后引起的肽的結(jié)構(gòu)變化。圖4為在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm、發(fā)射波長(zhǎng)300～450 nm處肽Ac-QWFCT與核黃素相互作用的熒光光譜圖。肽Ac-QWFCT在發(fā)射波長(zhǎng)358 nm處熒光強(qiáng)度達(dá)到最大（51.46），而核黃素 結(jié)合肽在發(fā)射波長(zhǎng)357 nm處熒光強(qiáng)度達(dá)到最大（44.15），表明核黃素的加入使肽Ac-QWFCT發(fā)生了熒光猝滅，肽Ac-QWFCT與核黃素分子之間存在相互作用。這一現(xiàn)象表明肽-核黃素復(fù)合物的形成，并導(dǎo)致芳香族熒光團(tuán)的熒光猝滅。Bangaru等[30]利用熒光光譜法研究核黃素和雞核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)核黃素的絡(luò)合可以導(dǎo)致蛋白發(fā)生熒光猝滅，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖 4 肽Ac-QWFCT與核黃素結(jié)合肽的熒光光譜圖Fig. 4 Fluorescence spectra of peptide Ac-QWFCT and riboflavinbinding peptide

圖 5 肽Ac-QWFCT與核黃素結(jié)合肽的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 5 FTIR spectra of peptide Ac-QWFCT and riboflavin-binding peptide

由圖5可知，肽Ac-QWFCT與肽-核黃素復(fù)合物的傅里葉變換紅外光譜存在明顯差異。在3296 cm-1處的吸收峰歸屬于O-H的伸縮振動(dòng)[31]，核黃素的加入使該峰的位置藍(lán)移至3352 cm-1處。在肽Ac-QWFCT傅里葉變換紅外光譜中，1676 cm-1處的吸收峰歸屬于酰胺I帶（C＝O）的伸縮振動(dòng)，加入核黃素后，1676 cm-1處吸收峰消失。1572 cm-1處的吸收峰歸屬于酰胺II帶（C-N和N-H）的伸縮振動(dòng)。傅里葉變換紅外光譜吸收峰在酰胺I帶和酰胺II帶的變化可以反映肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[32]。706 cm-1和636 cm-1處的吸收峰主要是苯環(huán)中C-H的振動(dòng)吸收引起[33]， 表明核黃素與肽Ac-QWFCT的結(jié)合使肽上芳香環(huán)所處微環(huán)境發(fā)生改變。研究表明，生物活性肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變與其抗氧化活性之間存在密切聯(lián)系[16]。二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)導(dǎo)致多肽鏈上芳香族氨基酸更多地暴露于溶劑分子中，暴露更多的活性位點(diǎn)從而增強(qiáng)了其抗氧化活性。核黃素與肽Ac-QWFCT結(jié)合引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化可能導(dǎo)致更多芳香族殘基在溶液中暴露，從而導(dǎo)致自由基清除能力和抗氧化活性的增強(qiáng)。此外，二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變也可能會(huì)影響多肽的免疫調(diào)節(jié)活性。芳香族殘基的暴露會(huì)對(duì)多肽的疏水性造成影響，而有報(bào)道稱疏水性與免疫調(diào)節(jié)活性相關(guān)，可能會(huì)增強(qiáng)肽與細(xì)胞膜的相互作用，從而改善免疫調(diào)節(jié)[34]。因此，核黃素與肽Ac-QWFCT結(jié)合后，疏水氨基酸色氨酸和苯丙氨酸可能在提高核黃素結(jié)合肽的免疫調(diào)節(jié)活性中發(fā)揮重要作用。

本研究進(jìn)一步采用核磁共振技術(shù)研究肽Ac-QWFCT與核黃素相互作用后化學(xué)基團(tuán)的變化，結(jié)果如圖6所示。在低場(chǎng)區(qū)域，位于苯丙氨酸芳香環(huán)上的氫核磁峰（δ7.00～7.30）在與核黃素發(fā)生相互作用后展寬，位移至δ7.20，同時(shí)伴隨峰強(qiáng)度的增強(qiáng)。而在色氨酸殘基上，位于緊鄰吡啶環(huán)的苯環(huán)上的氫核磁峰（δ7.35～7.53）消失。這可能是由于肽-核黃素復(fù)合物的形成使肽 Ac-QWFCT上的苯環(huán)處于疏水環(huán)境中。在高場(chǎng)和中場(chǎng)區(qū)域核磁峰的變化尤為明顯。在δ3.50～3.80之間峰強(qiáng)度增加但化學(xué)位移沒有發(fā)生改變，這一區(qū)域的峰代表了肽氨基酸側(cè)鏈上的亞甲基。而位于δ1.82處代表乙?；霞谆姆鍙?qiáng)度降低，峰發(fā)生展寬并從δ1.80向低場(chǎng)位移至δ1.88處。此外，在δ0.90～1.15之間，代表蘇氨酸殘基上甲基的峰合并為一個(gè)峰，并發(fā)生明顯地展寬和強(qiáng)度的增加。這些結(jié)果表明，肽Ac-QWFCT上的芳香族氨基酸殘基可能通過疏水相互作用與核黃素發(fā)生絡(luò)合。在晶體結(jié)構(gòu)中，核黃素的異氧嘧啶部分與肽Ac-QWFCT中色氨酸、苯丙氨酸殘基具有疏水性。在核黃素與肽Ac-QWFCT相互作用時(shí)，核黃素的異氧嘧啶部分堆積在色氨酸 和苯丙氨酸殘基側(cè)鏈的平行芳香環(huán)之間，通過疏水相互作用與肽結(jié)合。熒光光譜中肽Ac-QWFCT的熒光猝滅也可能是異氧嗪環(huán)和芳香族殘基的堆積所致。

圖 6 肽Ac-QWFCT的結(jié)構(gòu)式及核黃素、肽Ac-QWFCT和核黃素結(jié)合肽的核磁共振氫譜Fig. 6 Structural formula of peptide Ac-QWFCT and 1H-NMR spectra of riboflavin, peptide Ac-QWFCT, and riboflavin-binding peptide

圖 7 肽Ac-QWFCT（A）、肽Ac-QWFCT-核黃素（B）的同核化學(xué)位移相關(guān)譜Fig. 7 1H-1H COSY spectra of peptide Ac-QWFCT(A) and riboflavin-binding peptide (B)

為進(jìn)一步研究核黃素與肽Ac-QWFCT的反應(yīng)機(jī)制，本研究測(cè)定肽Ac-QWFCT、核黃素及其復(fù)合物的同核

化學(xué)位移相關(guān)譜。由圖7可知，與肽Ac-QWFCT相比，肽-核黃素復(fù)合物的同核化學(xué)位移相關(guān)譜中出現(xiàn)了4 處關(guān)聯(lián)信號(hào)的變化，表明苯環(huán)的關(guān)聯(lián)信號(hào)發(fā)生展寬，此結(jié)果揭示核黃素并沒有引起肽中氨基酸側(cè)鏈上苯環(huán)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，而是使苯環(huán)周圍的微環(huán)境發(fā)生變化。這也說明核黃素通過疏水相互作用與肽Ac-QWFCT發(fā)生結(jié)合。此外，代表亞甲基（（4.36，2.72）、（4.39，2.72）、（4.48，2.72）和（4.52，3.02））和甲基（4.20，1.04）的相關(guān)峰消失，這可能是由于核黃素與肽Ac-QWFCT結(jié)合后使芳香環(huán)發(fā)生堆積，從而使肽分子內(nèi)形成了氫鍵。由以上結(jié)果推測(cè)，核黃素是與肽Ac-QWFCT上帶有芳香環(huán)的色氨酸殘基和苯丙氨酸殘基相互作用。

2.5 翻轉(zhuǎn)腸囊法分析核黃素結(jié)合肽在大鼠小腸內(nèi)的吸收行為

圖 8 核黃素與核黃素結(jié)合肽在大鼠翻轉(zhuǎn)腸囊中的核黃素吸收量Fig. 8 Absorption of riboflavin and riboflavin-binding peptide in the rat everted gut sac

外翻腸囊技術(shù)被廣泛用于預(yù)測(cè)人體藥物吸收[35]。通過外翻腸囊后，測(cè)定漿膜側(cè)核黃素濃度，由圖8可知，單獨(dú)的核黃素的吸收濃度為（0.07±0.01）μmol/mL，而核黃素結(jié)合肽的核黃素的吸收濃度為（0.12±0.01）μmol/mL， 差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，核黃素與肽 Ac-QWFCT的結(jié)合能夠促進(jìn)小腸對(duì)核黃素的吸收。然而，小腸對(duì)核黃素結(jié)合肽的吸收機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以松子肽Ac-QWFCT和核黃素為原料，制備核黃素結(jié)合肽，并對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)、生物活性、結(jié)構(gòu)特征以及吸收特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，與核黃素結(jié)合后，肽Ac-QWFCT的微觀結(jié)構(gòu)由網(wǎng)狀變?yōu)樾鯛睢Ｔ谙嗤|(zhì)量濃度下，核黃素結(jié)合肽的免疫活性明顯高于肽 Ac-QWFCT和核黃素；而在低質(zhì)量濃度下，核黃素結(jié)合肽的抗氧化活性明顯高于肽Ac-QWFCT和核黃素。與核黃素的結(jié)合會(huì)引起肽Ac-QWFCT發(fā)生熒光猝滅。肽 Ac-QWFCT上的色氨酸和苯丙氨酸殘基通過疏水相互作用與核黃素進(jìn)行結(jié)合。除此之外，相比于核黃素，核黃素結(jié)合肽可以促進(jìn)核黃素在大鼠腸道內(nèi)的吸收。本研究結(jié)果可為新型VB2補(bǔ)充劑的開發(fā)提供理論參考。