王 鳳，肖楚翔，劉淑珍，王鳳舞*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

人口老齡化已成為全球最為關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，有報(bào)道稱(chēng)預(yù)計(jì)再過(guò)30 年全球?qū)?huì)迎來(lái)21億老年人口，因此“衰老”和“抗衰老”成為多數(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。 β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）是老年斑的重要組分，其過(guò)度產(chǎn)生和聚集會(huì)誘使氧化穩(wěn)態(tài)失衡，產(chǎn)生大量的自由基和過(guò)氧化物，使得機(jī)體表現(xiàn)出氧化和衰老癥狀。天然產(chǎn)物可從調(diào)控衰老基因、抗氧化、減少蛋白質(zhì)沉積等方面抗衰老及治療衰老相關(guān)疾病[2]，如有學(xué)者確定了半枝蓮的黃酮類(lèi)物質(zhì)可上調(diào)抗氧化基因mRNA表達(dá)水平，從而達(dá)到抗衰老的效果[3]；有學(xué)者確定了地黃花通過(guò)提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性來(lái)加強(qiáng)抗氧化作用，從而延緩衰老[4]；還有學(xué)者確定了六味地黃丸乙醇提取物能夠通過(guò)減少Aβ沉積緩解氧化、延緩衰老[5]等。

榴蓮風(fēng)味獨(dú)特，被稱(chēng)為“南洋水果之王”，其具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，經(jīng)常食用可以強(qiáng)身健體、健脾補(bǔ)氣、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、活血散寒[6]。目前對(duì)榴蓮的研究主要集中在果肉和果殼上，已有研究者在榴蓮果殼中提取得到了總黃酮[7-9]。黃酮類(lèi)化合物種類(lèi)和數(shù)量眾多，其中黃酮和黃酮醇最為常見(jiàn)，含量最多的槲皮素對(duì)氧化衰老具有較強(qiáng)的生物活性。目前對(duì)榴蓮核的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)榴蓮核進(jìn)行了黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取和延緩衰老效果的初探，以期對(duì)榴蓮的全面開(kāi)發(fā)和藥用價(jià)值的利用提供參考。

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)又稱(chēng)秀麗線(xiàn)蟲(chóng)，是一種身體通透、非寄生、全長(zhǎng)約1 mm、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、繁殖力強(qiáng)、以細(xì)菌為食且培養(yǎng)成本低的模式生物[10]；其生命周期短，卵在常溫下發(fā)育為成蟲(chóng)只需3～4 d[11]；其生命力強(qiáng)，逆境條件下可進(jìn)入Dauer狀態(tài)，待外界條件滿(mǎn)足生存需求時(shí)便可直接從Dauer期進(jìn)入到L4期；其遺傳背景清晰，是第一個(gè)被闡明全部基因組序列的真核多細(xì)胞生物[12]；且已被鑒定出有60%～80%的基因同人類(lèi)基因同源[13-14]。由于秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)具有以上多種優(yōu)勢(shì)，其作為模式生物已被廣泛應(yīng)用于人類(lèi)復(fù)雜疾病的研究并發(fā)展成為藥物開(kāi)發(fā)的工具。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究最佳提取工藝條件下榴蓮核黃酮提取物的體外抗氧化性以及體內(nèi)對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的影響，探討榴蓮核黃酮抗氧化衰老的作用效果，以期為活性物質(zhì)的篩選研究提供依據(jù)，也為榴蓮的全面認(rèn)識(shí)和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榴蓮購(gòu)于青島城區(qū)大潤(rùn)發(fā)超市，取榴蓮核備用；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉 英國(guó)OXOID公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市巴斯夫化工有限公司；膽固醇、硫酸鎂、氯化鈣 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)公司；秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)株系CL4176和大腸桿菌株系OP50（尿嘧啶滲漏突變株） 美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)線(xiàn)蟲(chóng)遺傳中心。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1D-80冷凍干燥機(jī) 美國(guó)SIM公司；KQ-500TDE型高頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司； WFZUV-2000分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司； LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9032型電熱恒溫培養(yǎng)箱 龍口市先科儀器 公司；生物顯微鏡 日本Olympus株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

榴蓮核洗凈，瀝干，切片后冷凍干燥3 d，研磨，過(guò)60 目篩，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 榴蓮核中總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g榴蓮核粉末，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液和0.5 g硫酸銨形成雙水相[15-17]，浸泡30 min后在350 W功率下超聲70 min，然后6000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL容量瓶中用乙醇溶液定容，備用。

1.3.3 榴蓮核中總黃酮提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確量取待測(cè)液10 mL于25 mL比色管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后靜置6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻后靜置6 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉溶液10 mL，然后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液定容到25 mL，混勻后靜置15 min；采用紫外分光光度法測(cè)定其510 nm波長(zhǎng)處的吸光度[18-19]。

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程（Y＝0.0118X-0.0034，決定系數(shù)R2＝0.999，其中Y代表吸光度，X代表蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度/（μg/mL）） 可以得出樣品提取液中的蘆丁含量，按照下列公式計(jì)算出待測(cè)液中總黃酮的提取率。

式中：ρ為將總黃酮提取液所測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程所對(duì)應(yīng)的總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為測(cè)定總黃酮含量時(shí)的取樣體積/mL；V1為總黃酮提取液的體積/mL；V2為測(cè)定總黃酮含量時(shí)的定容體積/mL；m為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g樣品于6 支錐形瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液5、10、15、20、25、30 mL，參照1.3.2節(jié)方法，考察料液比對(duì)榴蓮核總黃酮提取率的影響。并參照上述步驟，考察超聲時(shí)間（40、50、60、70、80、90 min）、超聲功率（250、300、350、400、450 W）、硫酸銨用量（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g）以及乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80 %）對(duì)榴蓮核總黃酮提取率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行4因素3水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳提取工藝條件[20]，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表 1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Code and level of independent variables used for L9 (34) orthogonal array design

1.3.6 體外抗氧化活性的測(cè)定

采用分光光度法、鄰二氮菲-Fe2+氧化法和鄰苯三酚自氧化法分別測(cè)定榴蓮核黃酮提取物對(duì)DPPH自由基、羥自由基以及超氧陰離子自由基的清除能力，具體測(cè)定方法分別參考文獻(xiàn)[21-23]。

1.3.7 線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)和同期化

線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)使用線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM），其上涂布有大腸桿菌OP50作為線(xiàn)蟲(chóng)的食物，于16 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.8 線(xiàn)蟲(chóng)壽命的測(cè)定

壽命的測(cè)定主要是用來(lái)判斷黃酮提取物在抗氧化的同時(shí)是否會(huì)延長(zhǎng)或縮短線(xiàn)蟲(chóng)的壽命。將產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)挑至涂有黃酮提取物的培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵同期化，待線(xiàn)蟲(chóng)孵化生長(zhǎng)至L4期后升溫至23 ℃，升溫培養(yǎng)可加速線(xiàn)蟲(chóng)衰老，縮短生命周期，28 h后開(kāi)始觀察秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的存活狀態(tài)，通過(guò)更換培養(yǎng)基的方式每天計(jì)數(shù)死亡、丟失和存活線(xiàn)蟲(chóng)的條數(shù)，直至空白組和樣品組的線(xiàn)蟲(chóng)死亡完全[25-26]。

1.3.9 運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)將線(xiàn)蟲(chóng)頭部擺動(dòng)次數(shù)作為秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的衡量標(biāo)準(zhǔn)，以此判斷黃酮提取物在抗氧化的同時(shí)，是否會(huì)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力造成影響。將產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)挑至涂有黃酮提取物的培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵同期化，待線(xiàn)蟲(chóng)孵化生長(zhǎng)至L4期后升溫至23 ℃，28 h后將秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)挑取至未涂大腸桿菌OP50的空白NGM培養(yǎng)基上，使其在爬行過(guò)程中除掉蟲(chóng)身黏附的菌，再將線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至另一空白培養(yǎng)基，記錄1 min內(nèi)線(xiàn)蟲(chóng)頭部擺動(dòng)的次數(shù)，每天記錄運(yùn)動(dòng)次數(shù)，直至運(yùn)動(dòng)能力喪失[27]。將線(xiàn)蟲(chóng)頭部從一側(cè)擺回另一側(cè)，再擺動(dòng)回來(lái)定義為一次頭部擺動(dòng)。每組至少測(cè)定20 條秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)。

1.3.10 生殖能力測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)生殖能力的測(cè)定主要是通過(guò)判斷黃酮提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)子代數(shù)目的影響從而來(lái)評(píng)判樣品在抗氧化的同時(shí)是否會(huì)對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的子代產(chǎn)生抑制作用。具體處理方法同1.3.8節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)壽命測(cè)定。每組挑取2 條線(xiàn)蟲(chóng)單獨(dú)飼養(yǎng)，每天觀察線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵情況，產(chǎn)第一顆卵的時(shí)間記為生殖能力實(shí)驗(yàn)第1天。每24 h將線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)至新板，直至生殖能力喪失。16 ℃下孵育產(chǎn)卵板，48 h后計(jì)數(shù)子代數(shù)目。

1.3.11 癱瘓緩解實(shí)驗(yàn)

翻譯要求分析：校園宣傳語(yǔ)具有啟發(fā)教育性、藝術(shù)審美性等特點(diǎn)，校園宣傳語(yǔ)語(yǔ)體也有其自身的語(yǔ)體風(fēng)格和修辭藝術(shù)。以簡(jiǎn)明優(yōu)美的語(yǔ)言打動(dòng)人，以新穎形象的創(chuàng)意吸引人，以真摯生動(dòng)的情感感染人。翻譯過(guò)程中，譯者如果只是考慮譯文要忠實(shí)于源文，而忽略受眾、語(yǔ)體、修辭手法等因素，譯文有可能無(wú)法滿(mǎn)足這些要求，翻譯往往缺乏充分性。

將產(chǎn)卵期的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)挑至涂有黃酮提取物的培養(yǎng)基上進(jìn)行產(chǎn)卵同期化，待線(xiàn)蟲(chóng)孵化生長(zhǎng)至L4期后升溫至23 ℃，28 h后開(kāi)始觀察秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)是否癱瘓，每2 h計(jì)數(shù)一次癱瘓條數(shù)，直至全部癱瘓[28-30]。癱瘓的判斷依據(jù)：線(xiàn)蟲(chóng)狀態(tài)活躍，可正常運(yùn)動(dòng)計(jì)為正常；機(jī)械性刺激線(xiàn)蟲(chóng)尾部不再做曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)，身體不能移動(dòng)，僅做頭部擺動(dòng)計(jì)為癱瘓。培養(yǎng)28 h后用1 mL的M9緩沖液將平板上的線(xiàn)蟲(chóng)沖洗并收集至EP管中，4200 r/min離心2 min，棄上清液，并加入150 μL含有體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L pH 7.4），于4 ℃固定24 h后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，加入150 μL含有體積分?jǐn)?shù)5%β-巰基乙醇、體積分?jǐn)?shù)1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的125 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl， 于37 ℃孵育24 h后漂洗，用0.125%硫黃素T-50%乙醇染色2 min，再用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液脫色制片后便可在熒光顯微鏡下對(duì)Aβ沉積情況進(jìn)行觀察分析。

1.3.12 體內(nèi)抗氧化酶活力測(cè)定

將同期化并升溫處理后的線(xiàn)蟲(chóng)用M9緩沖液沖洗并收集至EP管中，1000r/min離心10 min，棄上清液，然后用磷酸鹽緩沖液重懸，冰上勻漿，最終制成體積分?jǐn)?shù)5%線(xiàn)蟲(chóng)勻漿。按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)勻漿液中SOD活力、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析并作圖，采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)間的差異顯著性。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析結(jié)果

通過(guò)圖1A可以看出，榴蓮核總黃酮的提取率隨料液比的增加而增加，但到達(dá)一定的比值時(shí)，提取率趨于平穩(wěn)?？赡艿脑蚴?，榴蓮核中總黃酮的溶出率隨溶劑的增加而增大，當(dāng)溶劑達(dá)到一定量時(shí)，總黃酮全部溶出，含量達(dá)到最大。通過(guò)圖1B可以看出，榴蓮核總黃酮的提取率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但超過(guò)一定的時(shí)間，提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)反而下降。原因可能是延長(zhǎng)超聲時(shí)間可提高榴蓮核中總黃酮的析出，但當(dāng)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，溶出的總黃酮發(fā)生分解從而提取率下降。通過(guò)圖1C可以看出，榴蓮核總黃酮的提取率隨超聲功率的增加而逐漸增加，但超過(guò)一定的超聲功率其提取率反而下降。這可能是由于超聲對(duì)植物細(xì)胞有很好的破碎功能，隨著功率的增加，加大了榴蓮核細(xì)胞的破碎程度，所以增加了總黃酮的溶出量。但是當(dāng)超聲功率過(guò)大時(shí)，又會(huì)造成總黃酮的分解或氧化，從而造成提取率下降。通過(guò)圖1D可以看出，榴蓮核總黃酮的溶出量隨著硫酸銨用量的增加而增加，當(dāng)硫酸銨達(dá)到一定用量時(shí)，其提取率趨于平穩(wěn)。這可能是因?yàn)榱蛩徜@起到的作用是與乙醇構(gòu)成雙水相體系，對(duì)提取榴蓮核中總黃酮起到協(xié)同作用。通過(guò)圖1E可以看出，榴蓮核總黃酮隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，但當(dāng)乙醇超過(guò)一定體積分?jǐn)?shù)時(shí)，其提取率反而下降。這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加使得溶劑極性增強(qiáng)，有利于總黃酮的超聲提取，從而提高了總黃酮的提取率。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，榴蓮核中一些脂溶性物質(zhì)的溶出量也會(huì)隨之增加，反而抑制了總黃酮的溶出。綜上，單因素試驗(yàn)中最佳料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、硫酸銨用量和乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為1∶200、70 min、350 W、0.5 g以及40%。

圖 1 各因素對(duì)榴蓮核總黃酮提取率的影響Fig. 1 Effect of various factors on the extraction rate of total flavonoids from durian seeds

2.2 正交試驗(yàn)分析結(jié)果

由表2可知，不同的工藝條件對(duì)榴蓮核總黃酮的提取率存在一定的差異，其中最高提取率是最低提取率的1.33 倍。通過(guò)極差分析可以得知，各因素對(duì)榴蓮核 總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)槌暪β剩疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞料液比，榴蓮核總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比為1∶220、超聲時(shí)間為70 min、超聲功率為400 W。在最優(yōu)條件下進(jìn)行5 次重復(fù)試驗(yàn)，平均提取率為（9.25±0.05）%。表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理可行，數(shù)據(jù)可靠，適合榴蓮核中總黃酮的提取。

表 2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9 (34) orthogonal array design with experimental results

2.3 榴蓮核總黃酮提取物體外抗氧化活性

由表3可知，榴蓮核中的總黃酮提取物具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力（92.6%），相同質(zhì)量濃度下，效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照VC（73.1%）；具有相對(duì)較高的羥自由基清除率（79.4%），相同質(zhì)量濃度下，效果與陽(yáng)性對(duì)照VC（87.5%）相當(dāng)；且對(duì)超氧陰離子自由基也有一定的清除效果（27.0%）。結(jié)果表明榴蓮黃酮提取物具有很高的體外抗氧化能力，因此進(jìn)一步考察其是否具有體內(nèi)延緩衰老的功效。

表 3 榴蓮核總黃酮對(duì)自由基的清除率Table 3 Free radical scavenging rates of total flavonoids from durian seeds

2.4 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)氧化衰老的影響

2.4.1 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命是14～21 d，由圖2可知，升溫培養(yǎng)加速了線(xiàn)蟲(chóng)的衰老，縮短了線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)周期。但黃酮提取物樣品組與只喂食大腸桿菌OP50空白組線(xiàn)蟲(chóng)的壽命不同，樣品能使線(xiàn)蟲(chóng)生存曲線(xiàn)右移，生命周期較空白組延長(zhǎng)了約20%，這說(shuō)明榴蓮核黃酮提取物能明顯延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)的壽命。

圖 2 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響 Fig. 2 Effect of flavonoids extract from durian seeds on the lifespan of C. elegans

圖 3 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig. 3 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the mobility of C. elegans

2.4.2 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響由圖3可知，兩組線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，這是因?yàn)榫€(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)氧化程度超出了自身的清除能力，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡使線(xiàn)蟲(chóng)逐步達(dá)到衰老狀態(tài)，進(jìn)而使其運(yùn)動(dòng)能力被削弱。但是黃酮提取物組秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的頭部擺動(dòng)頻率均高于只喂食大腸桿菌OP50空白組，且與空白組相比，樣品組隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)出效果逐漸明顯的趨勢(shì)。這說(shuō)明在一定時(shí)間范圍內(nèi)黃酮提取物能夠緩解運(yùn)動(dòng)能力下降程度，即黃酮提取物在延緩線(xiàn)蟲(chóng)衰老、提高運(yùn)動(dòng)能力方面具有重要潛力。

2.4.3 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力的影響

圖 4 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生殖能力的影響Fig. 4 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the fertility of C. elegans

本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)每天計(jì)數(shù)子代數(shù)目評(píng)判黃酮提取物起抗氧化作用的同時(shí)對(duì)子代的影響。由圖4可知， 線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)卵期一般持續(xù)4 d左右，且第2天為產(chǎn)卵高峰期。只喂食大腸桿菌OP50空白組與喂食黃酮提取物樣品組線(xiàn)蟲(chóng)相比，后者在第1天和第2天的產(chǎn)卵量要高于前者，兩者無(wú)顯著差異；在第3天時(shí)，空白組和樣品組線(xiàn)蟲(chóng)的產(chǎn)卵量均明顯下降；在第4天時(shí)，兩組線(xiàn)蟲(chóng)均完成產(chǎn)卵，總產(chǎn)卵量均為220 個(gè)左右，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這說(shuō)明榴蓮核黃酮提取物在緩解氧化損傷、延緩衰老的同時(shí)并不會(huì)對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的生殖能力造成顯著傷害。

2.4.4 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)癱瘓緩解能力的影響

一方面，升溫培養(yǎng)加速了線(xiàn)蟲(chóng)的氧化和衰老且縮短了其生長(zhǎng)周期，使實(shí)驗(yàn)得以較快、較準(zhǔn)確的完成；另一方面，升溫可誘導(dǎo)模式生物秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)CL4176體內(nèi)表達(dá)Aβ，Aβ為氧化衰老反應(yīng)的產(chǎn)物，其在體內(nèi)聚集使得線(xiàn)蟲(chóng)出現(xiàn)癱瘓表型，所以可通過(guò)觀察癱瘓表型的變化判斷榴蓮核黃酮提取物能否緩解或抑制Aβ毒性，緩解氧化損傷。由圖5可知，在癱瘓緩解能力測(cè)定中，通過(guò)對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)癱瘓率的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在第1天時(shí)空白組和樣品組均未出現(xiàn)癱瘓現(xiàn)象；在第2～5天時(shí)，兩組均持續(xù)癱瘓但喂食榴蓮核黃酮提取物組秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的癱瘓率明顯低于空白組。由圖6可知，黃酮提取物能夠明顯改善線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)Aβ沉積情況。這說(shuō)明，榴蓮核黃酮提取物能夠緩解Aβ毒性，降低線(xiàn)蟲(chóng)CL4176癱瘓率。

圖 5 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)癱瘓緩解能力的影響Fig. 5 Effect of flavonoid extract from durian seeds on the paralysis relief of C. elegans

圖 6 線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)Aβ沉積情況Fig. 6 Aβ aggregation in C. elegans

2.4.5 榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化酶活力的影響

鑒于榴蓮核黃酮提取物能夠緩解線(xiàn)蟲(chóng)氧化損傷病癥，進(jìn)一步分析其對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶的影響。 由圖7A可知，在線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化酶活力的測(cè)定中，喂食榴蓮核黃酮提取物的線(xiàn)蟲(chóng)組具有更高的SOD活力，較空白組線(xiàn)蟲(chóng)而言，樣品組顯著提高了27.91%（P＜0.05）。由圖7B可知，在CAT活力測(cè)定中，空白組和樣品組線(xiàn)蟲(chóng)的CAT活力分別為163.00 U/g和177.72 U/g，樣品組較空白組提高了8.28%。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的一種天然產(chǎn)物，被廣泛應(yīng)用為脂質(zhì)氧化的指標(biāo)，由圖7C可知，喂食榴蓮核黃酮提取物的線(xiàn)蟲(chóng)組具有更低的MDA含量，較空白組線(xiàn)蟲(chóng)的MDA含量而言，樣品組極顯著降低了30.77%（P＜0.01）。表明榴蓮核黃酮提取物在一定程度上能夠提高線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)抗氧化能力，緩解氧化損傷，緩解線(xiàn)蟲(chóng)衰老。

圖 7 榴蓮核黃酮提取物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)SOD活力（A）、CAT活力（B）和MDA含量（C）的影響 Fig. 7 Effect of flavonoid extract from durian seeds on SOD activity (A), catalase activity (B) and MDA content (C) in C. elegans

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)確定榴蓮核黃酮提取物的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比為1∶220、超聲時(shí)間為70 min、超聲功率為400 W。在最優(yōu)條件下進(jìn)行5 次重復(fù)試驗(yàn)，榴蓮核總黃酮平均提取率可達(dá)（9.25±0.05）%。

最優(yōu)條件下獲得的榴蓮核黃酮提取物具有一定的體外抗氧化活性，其具有很強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力以及較高的羥自由基清除率，對(duì)超氧陰離子自由基也有較好的清除效果，清除率分別達(dá)到92.6%、79.4%和27.0%。

榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的氧化損傷和衰老具有一定的保護(hù)作用。黃酮提取物樣品組與空白組的線(xiàn)蟲(chóng)相比，樣品組線(xiàn)蟲(chóng)的生存曲線(xiàn)右移，即黃酮提取物對(duì)延緩衰老、延長(zhǎng)壽命起到了積極的作用；樣品組線(xiàn)蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力均高于空白組，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)樣品效果趨于顯著，即黃酮提取物在一定程度上能夠延緩衰老、提高運(yùn)動(dòng)能力；線(xiàn)蟲(chóng)的生殖期為4 d左右，這段時(shí)間內(nèi)兩組線(xiàn)蟲(chóng)呈現(xiàn)出不同的產(chǎn)卵量，但兩組總產(chǎn)卵量均在220 個(gè)左右，即榴蓮核黃酮提取物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的后代不會(huì)產(chǎn)生顯著影響，對(duì)提取物的功效可進(jìn)一步的研究與運(yùn)用；樣品組的線(xiàn)蟲(chóng)癱瘓率要低于空白組，表示榴蓮核黃酮提取物能夠減少Aβ沉積，緩解氧化損傷；而且樣品組線(xiàn)蟲(chóng)的體內(nèi)抗氧化相關(guān)酶活力高于空白組，表示榴蓮核黃酮提取物具有較好的體內(nèi)抗氧化效果。

綜上，本實(shí)驗(yàn)為榴蓮核黃酮提取物的抗氧化、抗衰老研究提供參考，同時(shí)有助于對(duì)榴蓮的全面認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)。