楊成林，黃 超，劉 娟，黃衛(wèi)梅，袁志航，易金娥,2，梁曾恩妮，鄔 靜,2,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.畜禽保健湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125）

霉菌毒素是由霉菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)生霉菌的不同又分為曲霉菌屬毒素、鐮刀菌屬毒素、青霉菌屬毒素等。自然界中，霉菌毒素能夠污染多種農(nóng)作物及農(nóng)產(chǎn)品，進(jìn)而對人類健康和動物福利造成諸多危害[1]。T-2毒素屬于鐮刀菌屬中毒性最強(qiáng)的A型單端孢酶烯族真菌毒素，可通過口腔、腸道、皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體，造成人體免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多種系統(tǒng)受損，導(dǎo)致飲食中毒性白細(xì)胞缺乏癥、大骨節(jié)病等[2]。同時，T-2毒素還可引起動物的慢性或急性中毒，表現(xiàn)為虛脫、惡心、腹痛、血便、休克等癥狀，最終引發(fā)生長遲緩、飼料排斥和胃腸道功能障礙等健康問題[3-4]。大量研究證實肝臟是T-2毒素在體內(nèi)的靶器官之一，低劑量的T-2毒素即可降低抗氧化酶的活性，造成動物肝臟出現(xiàn)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA），引發(fā)肝臟脂質(zhì)過氧化，抑制肝臟蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，可見氧化應(yīng)激在T-2毒素引發(fā)的肝臟損傷過程中起著關(guān)鍵作用[5-7]。

樺木酸（betulinic acid，BA）是一種天然的五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于以樺屬植物白樺為主的多種植物和水果中，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤和抗氧化等多種藥理作用[8-10]。前期研究已證明BA能夠緩解酒精誘導(dǎo)的肝損傷，調(diào)節(jié)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、血清總膽固醇和甘油三酯水平，升高抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，降低MDA含量[11]。BA能夠清除地塞米松誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞產(chǎn)生的ROS，減少細(xì)胞凋亡[12]。在脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷中，BA預(yù)處理能夠升高還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量和CAT活性，降低了MDA含量，表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性[13]。因此推測BA可借助其抗氧化作用成為T-2毒素的潛在解毒劑。此外，鑒于Janus激酶/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中所發(fā)揮的重要作用[14]，本研究以JAK/STAT信號為切入點，探討天然產(chǎn)物BA對T-2毒素所致肝損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)理，為將BA開發(fā)為T-2毒素天然解毒劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

60 只4～5 周齡SPF級健康雄性昆明小鼠（生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004），飼料為M02小鼠普通飼料，均購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物公司。

BA、VE 美國Sigma-Aldrich公司；T-2毒素 青島普瑞邦生物工程有限公司。

ALP、AST、ALT、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulion，GLB）檢測試劑 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司； SOD、CAT、MDA、T-AOC、GSH檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液、TUNEL 試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；β-actin、JAK2、STAT3、Bax、Bcl-2、p-STAT3、p-JAK2、Caspase-3抗體 美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 實驗分組與給藥

60 只昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由采食和飲水， 溫度21～25 ℃、相對濕度50%～70%。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將60 只小鼠隨機(jī)分為6 組，即空白對照組，T-2毒素組，BA低、中、高劑量組（0.25、0.5、 1 mg/kgmbBA+T-2毒素），VE干預(yù)組（100 mg/kgmbVE+ T-2毒素）。BA混懸于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的可溶性淀粉溶液中，每天灌胃1 次，空白對照組和T-2毒素組僅灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的可溶性淀粉溶液，連續(xù)灌胃14 d。灌胃結(jié)束后，空白對照組小鼠按10 mL/kgmb腹腔注射體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）混合液（體積比1∶12.5），其余5 組小鼠均腹腔注射T-2毒素（4 mg/kgmb）誘導(dǎo)肝損傷模型，15 h禁食不禁水處理，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后對小鼠進(jìn)行眼眶采血和處死，解剖采集組織樣本。

1.3.2 組織樣本分離與保存

采集小鼠肝臟，拍照、稱質(zhì)量，切取肝左葉固定于體積分?jǐn)?shù)4%中性甲醛溶液中，其余部分分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采集的血樣放置? ℃保存過夜后，冷凍離心機(jī)3000 r/min離心10 min分離血清，分離的血清置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血清生化指標(biāo)測定

采用檢測試劑和全自動血液生化分析儀對血清中ALP、ALT、AST活力和TP、ALB、GLB質(zhì)量濃度進(jìn)行測定。

1.3.4 肝組織抗氧化能力測定

從及物動詞的內(nèi)部分類看，“買”是只能帶體詞性賓語(名詞、代詞、數(shù)量詞)的動詞；根據(jù)語義的主要特征和與之相關(guān)的語法特征，動詞“買”屬于動作動詞中的弱持續(xù)動詞；從動作行為是有意識的還是無意識的角度看，“買”屬于自主動詞，從語義上說它是能表示有意識的或有心的動作行為的動詞，即“買”這個動作行為是能由動作發(fā)出者做主、主觀決定、自由支配的動作行為。

取肝臟組織研磨、離心（4000 r/min、10 min），吸取上清液，嚴(yán)格遵循試劑盒使用說明，檢測肝組織中T-AOC和CAT、SOD活力以及GSH、MDA含量。

1.3.5 肝臟組織病理學(xué)分析

取固定好的肝臟組織樣本，用雙蒸水沖洗，經(jīng)乙醇脫水后嵌入石蠟，切成厚度5 μm的薄片并置于玻片上，二甲苯和不同體積分?jǐn)?shù)乙醇脫蠟，蘇木精和伊紅染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.3.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

用含有蛋白酶K（20 μg/mL）的PBS清洗石蠟切片，于37 ℃下孵育30 min，進(jìn)行組織修復(fù)，再次用PBS沖洗3 次，隨后添加破膜工作液，常溫孵育20 min，PBS漂洗3 次，將試劑1（末端轉(zhuǎn)移酶）和試劑2（異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的脫氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP））按體積比2∶29的比例進(jìn)行配制，組織避光孵育2 h，4’,6-二脒基-2-苯 基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）標(biāo)記10 min，對細(xì)胞核染色，通過熒光顯微鏡觀察。

1.3.7 Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平

取肝組織加入裂解液后研磨，收集上清液，使用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%分離膠。 電泳結(jié)束轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h，加入β-actin、Bax、Bcl-2、Caspsae-3、STAT3、p-STAT3、JAK2和p-JAK2抗體孵育過夜，TBST沖洗3 次，每次10 min，加入二抗孵育1 h，TBST再次沖洗3 次，每次10 min，將聚偏二氟乙烯膜放置在凝膠成像儀暗室中，加入電化學(xué)發(fā)光試劑，使用Image軟件對目的蛋白條帶灰度值進(jìn)行相對定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA預(yù)處理對T-2毒素致肝損傷小鼠肝臟外觀的影響

圖 1 BA預(yù)處理對T-2毒素誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟外觀的影響Fig. 1 Effect of BA pretreatment on liver appearance in mice with liver injury induced by T-2 toxin

如圖1所示，空白對照組小鼠肝葉、肝邊緣清晰，結(jié)構(gòu)正常。與空白對照組相比，T-2毒素組小鼠肝臟顏色呈粉白色，質(zhì)地堅硬，有黃白色奶酪狀的壞死凸起。與T-2毒素組相比，BA預(yù)處理明顯改善了肝臟的顏色、質(zhì)地，顏色由粉白色逐漸恢復(fù)正常，壞死凸起數(shù)量逐漸減少，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，肉眼觀察BA高劑量組和陽性對照VE干預(yù)組小鼠肝臟外觀沒有明顯差異。以上結(jié)果表明，BA預(yù)處理能夠改善T-2毒素對肝臟的損傷作用。

2.2 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟病理學(xué)的影響

如圖2所示，空白對照組中可見正常的肝索、肝竇結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，無炎癥變化。與空白對照組相比，T-2毒素組肝組織正常結(jié)構(gòu)消失，無明顯的肝索、肝竇，并伴有炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死。與T-2毒素組相比，BA預(yù)處理后，小鼠肝組織中肝索、肝竇等結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，炎性細(xì)胞和壞死細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。以上結(jié)果表明，T-2毒素能夠誘導(dǎo)肝臟損傷，并造成肝結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞壞死等病理變化，而BA預(yù)處理能夠改善這些變化。

圖 2 BA預(yù)處理對T-2毒素誘導(dǎo)小鼠肝臟病理變化的影響Fig. 2 Effect of BA pretreatment on pathological changes of liver tissues induced by T-2 toxin in mice

2.3 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟損傷血清生化指標(biāo)的影響

ALP、ALT、AST活力是臨床中檢測肝損傷的重要指標(biāo)，它們的異常變化表明肝臟受損。如圖3所示，與空白對照組相比，T-2毒素組小鼠血清ALP、ALT、AST活力極顯著升高（P＜0.01），血清TP質(zhì)量濃度、ALB/GLB比值極顯著降低（P＜0.01），表明T-2毒素導(dǎo)致肝損傷。與T-2毒素組相比，中、高劑量的BA預(yù)處理能夠極顯著降低血清ALT、AST活力（P＜0.01）；高劑量的BA預(yù)處理能夠顯著降低血清ALP活力和顯著升高TP質(zhì)量濃度 （P＜0.05）；各劑量BA預(yù)處理均能升高ALB/GLB比值，但與T-2毒素組無顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，BA預(yù)處理能有效緩解T-2毒素引起的血清生化指標(biāo)的異常變化，從而減輕肝損傷。

圖 3 BA預(yù)處理對T-2毒素致肝損傷小鼠肝臟功能相關(guān)血清 生化指標(biāo)的影響Fig. 3 Effect of BA pretreatment on serum biochemical indexes related to liver function in mice with liver injury caused by T-2 toxin

2.4 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的影響

如圖4所示，與空白對照組相比，T-2毒素處理極顯著降低了小鼠肝組織中SOD、CAT、T-AOC以及GSH水平（P＜0.01），極顯著升高了小鼠肝組織中MDA含量（P＜0.01），表明T-2毒素造成小鼠肝臟的氧化損傷。與T-2毒素組相比，中、高劑量BA預(yù)處理極顯著升高了肝組織中T-AOC和SOD活力（P＜0.01）；高劑量BA預(yù)處理極顯著升高肝組織中CAT活力（P＜0.01）；BA預(yù)處理極顯著升高了肝組織中GSH含量，并極顯著降低了MDA含量，呈劑量依賴性。以上結(jié)果表明，BA預(yù)處理能夠通過增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化酶活性降低MDA含量，從而保護(hù)肝臟免受T-2毒素造成的氧化損傷。

圖 4 BA預(yù)處理對T-2毒素誘導(dǎo)小鼠肝臟氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的影響Fig. 4 Effect of BA pretreatment on oxidative damage indexes of liver tissues in mice induced by T-2 toxin

2.5 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響

圖 5 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響Fig. 5 Effect of BA pretreatment on apoptosis of hepatocytes in mice induced by T-2 toxin

細(xì)胞發(fā)生凋亡時會激活DNA內(nèi)切酶，使DNA發(fā)生斷裂，斷裂DNA暴露的3’-OH端能夠在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下被綠色的熒光探針FITC所標(biāo)記，進(jìn)而反映細(xì)胞的凋亡情況。如圖5所示，與空白對照組相比，T-2毒素組綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而BA預(yù)處理后凋亡細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性減少。以上結(jié)果表明，T-2毒素能夠誘導(dǎo)小鼠肝組織中的細(xì)胞凋亡，而BA預(yù)處理能夠減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

2.6 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6.1 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與空白對照組相比，T-2毒素處理極顯著升高了Bcl-2/Bax、剪切型Caspase-3/pro-Caspase-3比值（P＜0.01），表明T-2毒素能夠激活促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并激活Caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。與T-2毒素組相比，BA預(yù)處理呈劑量依賴性極顯著降低Bcl-2/Bax比值（P＜0.01），中、高劑量BA預(yù)處理顯著降低剪切型Caspase-3/pro-Caspase-3比值 （P＜0.05）。以上結(jié)果表明，T-2毒素通過激活Bax和Caspase-3誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，而BA預(yù)處理能夠抑制Bax和Caspase-3的激活，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖 6 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟細(xì)胞Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of BA pretreatment on the expression of Bax, Bcl-2 and caspase-3 proteins in mice induced by T-2 toxin

2.6.2 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟細(xì)胞中JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響

圖 7 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝臟細(xì)胞中JAK2、STAT3 蛋白表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of BA pretreatment on the expression of JAK2 and STAT3 proteins in hepatocytes of mice induced by T-2 toxin

如圖7所示，與空白對照組比，T-2毒素處理升高小鼠肝臟細(xì)胞中p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3比值， 提示T-2毒素激活了JAK2/STAT3信號通路。與T-2毒素組相比，低、高劑量的BA預(yù)處理極顯著降低了 p-JAK2/JAK2比值（P＜0.01）；與T-2毒素組相比，BA呈劑量依賴性降低了p-STAT3/STAT3比值，高劑量時差異極顯著（P＜0.01），表明BA預(yù)處理抑制了JAK2/STAT3信號通路的激活。以上結(jié)果表明，BA緩解T-2毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能與JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。

3 討 論

血清中ALT、AST、ALP活力直接反映肝臟功能狀態(tài)和損傷程度[15-16]，其水平異常是診斷肝臟病變的重要指標(biāo)，ALB/GLB比值對肝臟疾病的臨床診斷和治療同樣具有重要意義[17-18]。有研究顯示，在暴露于T-2毒素的山齒鶉和肉雞肝臟中觀察到壞死和脂肪堆積，同時AST、ALP和ALT水平升高，TP含量降低[19-20]。在本研究中也得到了相似結(jié)果，T-2毒素組小鼠血清ALP、ALT和AST活力極顯著高于空白對照組，TP質(zhì)量濃度和ALB/GLB比值極顯著降低，提示T-2毒素可造成小鼠的肝損傷。而T-2毒素引起中毒的重要機(jī)制是氧化應(yīng)激，通過降低SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性，增加ROS和MDA的產(chǎn)生，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞甚至組織的 損傷[21-23]。在本研究中，T-2毒素極顯著降低小鼠肝臟組織T-AOC，CAT、SOD活力和GSH含量，同時極顯著增加MDA含量；病理剖檢可見肝臟顏色呈粉白色，質(zhì)地較硬且缺少彈性，肝臟邊緣較鈍；切片圖像觀察結(jié)果顯示肝臟中肝索和肝竇消失，炎癥細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死，提示氧化應(yīng)激在T-2毒素引發(fā)的小鼠肝損傷過程中 起著重要作用，這與Deng Yijia等[24]的研究結(jié)果一致。BA作為一種天然產(chǎn)物，不僅可通過增強(qiáng)小鼠抗氧化能力減輕乙醇對小鼠造成的肝臟損傷[25]，也能夠劑量依賴性地修復(fù)T-2毒素引起的人正常肝細(xì)胞（L02）氧化損傷[26]。因此，本研究探討了BA對T-2毒素通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，與T-2毒素組比較，BA預(yù)處理能夠顯著升高小鼠肝組織中T-AOC，SOD、CAT活力和GSH含量，并極顯著降低MDA含量，拮抗由T-2毒素造成的肝臟氧化損傷。此外，BA預(yù)處理后可顯著降低小鼠血清ALT、AST、ALP活力，升高TP水平和 ALB/GLB比值，表明BA預(yù)處理能夠保護(hù)肝臟免受T-2毒素的毒性作用，顯著減少肝臟炎性細(xì)胞的浸潤及壞死細(xì)胞生成，改善肝臟的外觀、色澤和質(zhì)地。

研究發(fā)現(xiàn)，T-2毒素可激活線粒體信號通路中凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)，誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞凋亡[27]。JAK2/STAT3信號通路是多種天然化合物和藥物的有效靶點，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖[28-29]。Zhang Lei等[30]研究發(fā)現(xiàn)，抑制JAK2/STAT3信號通路可以減輕氧化 應(yīng)激，下調(diào)Bax/Bcl-2比值，抑制腎細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。本研究中，TUNEL檢測結(jié)果顯示，T-2毒素誘導(dǎo)了小鼠肝細(xì)胞的凋亡；Western blot檢測結(jié)果顯示，T-2毒素上調(diào)了p-STAT3/STAT3、p-JAK2/JAK2、Bax/Bcl-2比值，以及Caspase-3的表達(dá)，而BA預(yù)處理能夠顯著下調(diào) JAK2/STAT3信號通路和Bax/Bcl-2比值，抑制Caspase-3的激活，提示JAK2/STAT3調(diào)控的細(xì)胞凋亡可能在BA對T-2毒素致肝損傷的保護(hù)過程中發(fā)揮重要作用。

圖 8 BA預(yù)處理對T-2毒素致小鼠肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制Fig. 8 Protective effect of BA pretreatment on liver injury induced by T-2 toxin in mice and its underlying mechanism

本研究結(jié)果表明，BA對T-2毒素通過氧化應(yīng)激所致的小鼠肝臟氧化損傷具有保護(hù)作用，而JAK2/STAT3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能在這一過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用 （圖8），以上結(jié)果為將BA開發(fā)成一種T-2毒素解毒劑提供了關(guān)鍵的實驗依據(jù)。