薛宏坤，譚佳琪，李 倩,*，唐勁天,*

（1.清華大學(xué)工程物理系，粒子與輻射成像教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2.北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院，北京 100080）

正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝及增殖分化都受機(jī)體嚴(yán)格而有序的調(diào)控，而癌變細(xì)胞則不受機(jī)體控制，會(huì)惡性增殖分化，破壞機(jī)體正常的生理功能，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體死亡。其中，乳腺癌是惡性腫瘤之一，其嚴(yán)重危害女性身體健康，發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位[1]。盡管乳腺癌的綜合治療水平在不斷提高，但其致死率仍然位居女性腫瘤的第2位。目前主要有6 種常見(jiàn)的乳腺癌類型，由于乳腺癌的種類不同，治療手段也不盡相同，但手術(shù)、化療、放療及藥物治療仍作為治療乳腺癌的主要手段。超過(guò)90%的乳腺癌都是非轉(zhuǎn)移的，對(duì)于非轉(zhuǎn)移的乳腺癌，治療方法一般是手術(shù)切除。手術(shù)雖可以局部切除腫瘤，但不能根除腫瘤組織，患者術(shù)后有可能復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)會(huì)導(dǎo)致患者的死亡率顯著提升。因此，僅僅通過(guò)手術(shù)的手段已經(jīng)不能滿足康復(fù)需要；為降低術(shù)后乳腺癌的復(fù)發(fā)率，一般采用放療方法對(duì)局部組織進(jìn)行治療；而對(duì)于轉(zhuǎn)移性病灶主要采用抗腫瘤藥物的治療，其中阿帕替尼、紫杉醇、紫杉烷加曲妥珠單抗和帕妥珠單抗是目前治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的一線藥物[2]。但由于上述的臨床藥物毒副作用較大，患者長(zhǎng)期服用產(chǎn)生諸多的不良反應(yīng)，并且腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)之產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，由于藥物的局限性，使其應(yīng)用受到限制。因此，尋找一種毒副作用小、抗腫瘤活性強(qiáng)的天然抗腫瘤藥物來(lái)預(yù)防或治療乳腺癌已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

原花青素屬于天然黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和綠色植物莖葉中。原花青素是由單體、低聚和高聚合原花青素組成的化合物[3]，其中原花青素B2（procyanidin B2，PCB2）是原花青素二聚體中活性最強(qiáng)和來(lái)源最廣泛的一類化合物，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使PCB2具有強(qiáng)烈的清除體內(nèi)過(guò)量自由基、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等功效[4-5]，對(duì)人體健康十分有益。例如，Kim等[6]研究發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果中PCB2能夠有效清除自由基，同時(shí)具有較強(qiáng)的還原性；Tanaka等[7]研究發(fā)現(xiàn)PCB2通過(guò)下調(diào)T細(xì)胞表達(dá)T盒和視黃酸相關(guān)孤兒受體γt蛋白表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ和白細(xì)胞介素17， 達(dá)到較好的抗炎效果；Gopalakrishnan等[8]的研究結(jié)果 表明，PCB2能抑制癌細(xì)胞中純化蛋白酶體和蛋白酶體的催化活性，但對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有抑制作用，同時(shí)減少前列腺癌細(xì)胞的增殖及降低前列腺癌細(xì)胞裂解物中抗凋亡和血管生成標(biāo)記物的表達(dá)；Feng Jiao等[9]研究發(fā)現(xiàn)PCB2可調(diào)節(jié)人肝星狀細(xì)胞體內(nèi)外血管內(nèi)生長(zhǎng)因子A、低氧誘導(dǎo)因子1α、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、人I型膠原蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制人肝星狀細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。孫思明等[10]研究結(jié)果表明，山楂中PCB2可通過(guò)降低SMMC-7721細(xì)胞中抗氧化酶活力和抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功效。通過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn)，PCB2具有較好的抗炎和抗腫瘤活性，但目前關(guān)于PCB2對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抗腫瘤活性及其分子機(jī)制尚不明確。

圖 1 PCB2化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical formula of PCB2

鑒于此，本研究采用PCB2處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，探究PCB2抗腫瘤活性及其機(jī)制。首先通過(guò)噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法測(cè)定不同濃度PCB2和不同處理時(shí)間對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響；然后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化并觀察Hoechst 33342染色后的細(xì)胞凋亡形態(tài)，同時(shí)利用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率、周期、胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平及線粒體膜電位變化的影響；最后通過(guò)Western blot檢測(cè)不同濃度PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。以期為乳腺癌的治療提供植物源的天然抗腫瘤候選藥物，同時(shí)為功能性食品的開(kāi)發(fā)提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCB2（純度≥99.8%） 鼎瑞化工（上海）有限公司；人乳腺癌MCF-7細(xì)胞 北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；雙抗（青霉素/鏈霉素） 上海源葉生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶消化液 北京百華百匯生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液 深圳市瑞吉特生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 上海盛思生化科技有限公司；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡和周期檢測(cè)試劑盒 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素c、Caspase-3/12和β-actin抗體 美國(guó)CST公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LSM 800激光共聚焦掃描顯微鏡 北京普瑞賽司儀器有限公司；JC-1086C Pro全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀 青島聚創(chuàng)環(huán)保儀器有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；ZE5流式細(xì)胞分析儀 美國(guó) Bio-Rad公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái) 杭州艾普儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-7細(xì)胞接種于含10% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，然后于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)MCF-7細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代，采用對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

將對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）接種于96 孔板中，每孔200 μL。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁時(shí)，棄上清液，換為含PCB2終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L的完全培養(yǎng)液（PCB2實(shí)驗(yàn)組）；同時(shí)將不含PCB2、與實(shí)驗(yàn)組等體積的完全培養(yǎng)基設(shè)為對(duì)照組。每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT培養(yǎng)4 h，棄上清液，然后每孔再加入150 μL DMSO，振蕩15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處吸光度，并計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。按式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率[11]。

式中：A0為對(duì)照組吸光度；A1為不同濃度PCB2實(shí)驗(yàn)組吸光度。

1.3.3 不同濃度PCB2處理MCF-7細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測(cè)

按照細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔將對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞接種于6 孔板，每孔2 mL，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照1.3.2節(jié)給藥方式加入PCB2，同時(shí)設(shè)置對(duì)照，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，然后用PBS重懸細(xì)胞，以 1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入200 μL 4 μg/mL鈣離子熒光探針Fluo-3/AM，在37 ℃下避光孵育1 h，用預(yù)冷的PBS洗滌3 次，然后再加400 μL PBS重懸細(xì)胞，用尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，采用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)樣品綠色熒光強(qiáng)度。Ca2+濃度以綠色熒光強(qiáng)度表示。

1.3.4 不同濃度PCB2處理MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定

利用2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針檢測(cè)不同濃度PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。按照細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔將對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照1.3.2節(jié)給藥方式加入PCB2，同時(shí)設(shè)置對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入終濃度5 μmol/L DCFH-DA熒光探針，避光反應(yīng)20 min，吸取探針，細(xì)胞用PBS洗滌2 次，隨后利用胰蛋白酶消化，離心去除上清液，PBS重懸，并采用流式細(xì)胞分析儀測(cè)定每孔樣品的熒光強(qiáng)度。ROS水平以綠色熒光強(qiáng)度表示。

1.3.5 Hoechst 33342染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

將對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞（2×105個(gè)/孔）接種在蓋玻片6 孔板中，每孔2 mL，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照1.3.2節(jié)給藥方式加入PCB2，同時(shí)設(shè)置對(duì)照，培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌3 次，然后每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液固定1 h，棄去固定液，用預(yù)冷PBS洗滌3 次，然后加入終質(zhì)量濃度為5 mg/L Hoechst 33342染液，37 ℃避光染色15 min，取出蓋玻片，用濾紙吸干蓋玻片底部，將其置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.6 不同濃度PCB2處理MCF-7細(xì)胞凋亡率、周期分布和線粒體膜電位的測(cè)定

將對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6 孔板，每孔2 mL，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，按照1.3.2節(jié)給藥方式加入PCB2，同時(shí)設(shè)置對(duì)照，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，然后用PBS洗滌2 次。分別取2×105個(gè)MCF-7細(xì)胞，每份樣本加入5 μL Annexin V染液和10 μL PI染液，4 ℃避光染色30 min，通過(guò)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡率。

用上述相同方法收集細(xì)胞，分別取1×105個(gè)MCF-7細(xì)胞，在4 ℃條件下采用1 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液固定，靜置過(guò)夜后，1000 r/min離心5 min，除去固定液，用預(yù)冷的PBS洗滌3 次后，加入100 μL 100 μg/mL RNA酶，在37 ℃下消化30 min，然后加入100 μL 50 μg/mL PI染色液，在4 ℃下避光染色30 min，通過(guò)流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞周期分布。

用上述相同方法收集細(xì)胞，然后加入終質(zhì)量濃度為10 μg/mL JC-1染色液，避光孵育30 min，隨后用預(yù)冷的PBS洗滌3 次，再加入PBS重懸細(xì)胞，將其置于流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)每個(gè)樣品線粒體膜電位。線粒體膜電位以JC-1單體與聚合體熒光強(qiáng)度比值表示。

1.3.7 Western bolt測(cè)定不同濃度PCB2處理MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量

將對(duì)數(shù)期MCF-7細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，按照1.3.2節(jié)給藥方式加入PCB2，同時(shí)設(shè)置對(duì)照，培養(yǎng)48 h，隨后加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)量濃度。測(cè)定后取20 μL蛋白樣品上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳凝膠中進(jìn)行分離，冰浴下將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，采用5%脫脂奶粉在25 ℃下?lián)u床封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日換為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h。采用電化學(xué)發(fā)光顯影，然后通過(guò)凝膠成像檢測(cè)Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素c、Caspase-3/12和β-actin的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果采用Image Lab軟件對(duì)相應(yīng)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Statistix8.0軟件對(duì)每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并分析差異顯著性（P＜0.05表示差異顯著）；采用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理時(shí)間下不同濃度PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響

圖 2 不同濃度PCB2和處理時(shí)間對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of PCB2 at different concentrations and treatment times on the survival rate of MCF-7 cells

由圖2可知，當(dāng)處理時(shí)間分別為24、48 h和72 h時(shí)，MCF-7細(xì)胞存活率均隨PCB2濃度增加呈顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05），并呈濃度依賴性。當(dāng)PCB2濃度在10～80 μmol/L范圍時(shí)，用相同濃度的PCB2處理MCF-7細(xì)胞，處理24 h后MCF-7細(xì)胞存活率顯著低于處理48 h和72 h（P＜0.05），而處理48 h和處理72 h相比，MCF-7細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。因此，對(duì)PCB2處理MCF-7細(xì)胞48 h組作進(jìn)一步分析。通過(guò)計(jì)算得到PCB2處理24、48 h和72 h對(duì)MCF-7細(xì)胞存活率的IC50分別為114.82、57.15 μmol/L和55.64 μmol/L，表明處理時(shí)間越長(zhǎng)，IC50越小，對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷能力越強(qiáng)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCB2能有效抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.2 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響

圖 3 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度變化的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of PCB2 on the change of Ca2+ concentration in MCF-7 cells

機(jī)體在正常情況下，Ca2+具有維持線粒體膜通透性的作用。Ca2+失衡會(huì)造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常轉(zhuǎn)運(yùn)被破壞，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致胞內(nèi)過(guò)量ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素c，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12-13]。由圖3可知，與對(duì)照組相比，不同濃度PCB2處理MCF-7細(xì)胞48 h后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著上升（P＜0.05），呈濃度依賴性。結(jié)果表明，PCB2處理會(huì)造成MCF-7細(xì)胞內(nèi)Ca2+失衡，破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤效果。

2.3 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

線粒體是ROS產(chǎn)生的主要細(xì)胞器，機(jī)體在正常狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，適量ROS不僅能提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，而且能顯著提高機(jī)體的免疫能力[14-15]。但細(xì)胞受到外界應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體膜電位發(fā)生變化，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+失衡，進(jìn)而誘發(fā)大量ROS產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸造成氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16-17]。由圖4可知，與對(duì)照組相比，不同濃度PCB2處理48 h后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P＜0.05），且PCB2濃度越大，MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高。結(jié)果表明，PCB2能顯著提高M(jìn)CF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平，過(guò)量ROS釋放到胞質(zhì)中破壞MCF-7細(xì)胞，從而抑制MCF-7細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

圖 4 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig. 4 Effect of different concentrations of PCB2 on ROS levels in MCF-7 cells

2.4 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

圖 5 共聚焦顯微鏡觀察不同濃度PCB2作用下MCF-7細(xì)胞 凋亡形態(tài)的變化（×100）Fig. 5 Changes in apoptosis morphology of MCF-7 cells treated with different concentrations of PCB2 under confocal microscope (× 100)

PCB2能使MCF-7細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著上升，同時(shí)顯著提高胞內(nèi)ROS水平。大量研究表明Ca2+失衡和過(guò)量的ROS均會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18-19]。為從另一方面進(jìn)一步驗(yàn)證PCB2是否能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Hoechst 33342染色法觀察MCF-7細(xì)胞凋亡形態(tài)。由圖5可知，隨PCB2濃度（10～80 μmol/L）的增加，細(xì)胞數(shù)量相較于對(duì)照組明顯減少，不規(guī)則細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞核藍(lán)色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，并伴有凋亡小體的產(chǎn)生，且具有濃度依賴效應(yīng)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PCB2可通過(guò)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)。

2.5 不同濃度處理PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響

圖 6 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Fig. 6 Effect of different concentrations of PCB2 on apoptosis of MCF-7 cells

大量研究已表明PCB2具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力[20-21]，對(duì)癌細(xì)胞的增殖同樣具有顯著的抑制作用，可加速癌細(xì)胞的凋亡[22-23]。因此，本實(shí)驗(yàn)在MTT和Hoechst 33342染色法觀察MCF-7細(xì)胞凋亡形態(tài)的基礎(chǔ)上，采用流式分析儀進(jìn)一步探究不同濃度PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響。由圖6可知，隨PCB2濃度的增加，MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），且呈濃度依賴效應(yīng)。當(dāng)PCB2濃度為10、20、40、80 μmol/L 時(shí)，MCF-7細(xì)胞凋亡率分別為（12.85±0.65）%、（16.71±0.57）%、（21.43±1.12）%和（42.29±2.15）%；與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率分別提高了4.69%、8.55%、13.27%和34.13%。結(jié)果表明PCB2可通過(guò)抑制MCF-7細(xì)胞增殖加速細(xì)胞凋亡，且濃度越大效果越顯著。Miura[24]和Yin Wenbin[25]等的研究同樣發(fā)現(xiàn)PCB2能顯著提高癌細(xì)胞凋亡率，其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平和下調(diào)凋亡抑制因子，從而加速癌細(xì)胞凋亡。

2.6 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞周期分布的影響

圖 7 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞周期分布的影響Fig. 7 Effect of different concentrations of PCB2 on cell cycle distribution of MCF-7 cells

為闡明PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是否與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，本研究分析不同濃度PCB2對(duì)細(xì)胞周期分布規(guī)律的影響，采用細(xì)胞同期檢測(cè)試劑盒并通過(guò)流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行檢測(cè)。由圖7可知，當(dāng)PCB2濃度在10～80 μmol/L范圍內(nèi)，處理MCF-7細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量隨PCB2濃度的增加呈顯著增加的趨勢(shì)（P＜0.05），且具有濃度依賴性；而S期和G2/M 期的細(xì)胞數(shù)量均隨PCB2濃度的增加呈顯著降低的趨勢(shì)（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞周期有阻滯作用，并將周期阻滯在G0/G1期，從而達(dá)到抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。

2.7 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖 8 不同濃度PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig. 8 Effect of different concentrations of PCB2 on mitochondrial membrane potential in MCF-7 cells

線粒體對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化起著至關(guān)重要的作用，作為細(xì)胞能量工廠，一些抗腫瘤藥物在發(fā)揮其抗腫瘤作用時(shí)，通常會(huì)激活線粒體凋亡通路[26-27]。由圖8可知，與對(duì)照組相比，采用不同濃度PCB2處理48 h后，MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性。結(jié)果表明PCB2可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

2.8 不同濃度PCB2處理對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

在真核生物中，線粒體作為能量和代謝的中心，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供必要的基礎(chǔ)能量[28]，同時(shí)也作為細(xì)胞凋亡的控制中心，當(dāng)細(xì)胞受到外界抗癌藥物刺激時(shí)會(huì)造成線粒體功能損失，引起B(yǎng)ax/Bak形成低聚物復(fù)合體，復(fù)合體插入到線粒體外膜孔隙，導(dǎo)致Ca2+濃度和滲透壓發(fā)生變化[29]，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失以及線粒體膜電位崩潰，促使細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)[30]， 細(xì)胞色素c與細(xì)胞凋亡激活因子結(jié)合形成凋亡復(fù)合體從而激活Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，誘導(dǎo)凋亡的活化片段進(jìn)入細(xì)胞核激活磷酸內(nèi)切酶，進(jìn)而使DNA裂解導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[26-27]。為進(jìn)一步探究PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞抗腫瘤作用的分子機(jī)制，本研究采用Western Bolt測(cè)定不同濃度PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。

圖 9 不同濃度PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞蛋白條帶（A）及蛋白Bax（B）、 Bcl-2（C）、細(xì)胞色素c（D）、Caspase-12（E）和Caspase-3（F） 相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 9 Effect of PCB2 at different concentrations on protein bands (A) and the protein relative expression levels of Bax (B), Bcl-2 (C), cytochrome c (D), caspase-12 (E) and caspase-3 (F) in MCF-7 cells

由圖9可知，與對(duì)照組相比，不同濃度PCB2處理48 h后，MCF-7細(xì)胞中Bax、細(xì)胞色素c、Caspase-12和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），且呈濃度依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCB2能激活線粒體介導(dǎo)的凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，下調(diào)凋亡抑制相關(guān)蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制MCF-7細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞凋亡，從分子機(jī)制方面進(jìn)一步證明PCB2具有抗腫瘤的作用。

綜合以上研究結(jié)果可知，當(dāng)MCF-7細(xì)胞受到PCB2干預(yù)后，首先打破Ca2+平衡，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能被破壞，引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，過(guò)量的ROS誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡形態(tài)發(fā)生變化，在Hoechst 33342染色下可觀察到經(jīng)PCB2處理后MCF-7細(xì)胞核呈現(xiàn)較強(qiáng)的藍(lán)色熒光，并且PCB2濃度越大，細(xì)胞核熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，同時(shí)伴有凋亡小體的產(chǎn)生；通過(guò)細(xì)胞流式分析儀進(jìn)一步分析可知，與對(duì)照組相比，不同濃度的PCB2處理均顯著增加MCF-7細(xì)胞凋亡率，同時(shí)PCB2對(duì)MCF-7細(xì)胞周期有阻滯作用，并將其細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，達(dá)到抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的效果；另外，Ca2+濃度呈上升趨勢(shì)，造成線粒體滲透壓發(fā)生改變，線粒體膜電位隨PCB2濃度的增加呈顯著增加趨勢(shì)，結(jié)果說(shuō)明PCB2能改變線粒體膜電位，進(jìn)一步驗(yàn)證PCB2可能通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步探究PCB2的抗腫瘤作用機(jī)制，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PCB2能上調(diào)Bax、細(xì)胞色素c、Caspase-12和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知PCB2具有抗腫瘤作用，其機(jī)制與激活線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路、周期阻滯和細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高有關(guān)，其凋亡途徑如圖10所示。

圖 10 PCB2誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑Fig. 10 PCB2 induces apoptosis-related pathways of MCF-7 cells

3 結(jié) 論

通過(guò)上述研究結(jié)果可知，PCB2可通過(guò)破壞Ca2+平衡，增加胞內(nèi)ROS水平和MCF-7細(xì)胞凋亡率，改變MCF-7細(xì)胞凋亡形態(tài)，并將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，其內(nèi)在機(jī)制為通過(guò)上調(diào)Bax、細(xì)胞色素c、Caspase-12和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平來(lái)達(dá)到抗腫瘤效果。該研究結(jié)果為天然抗乳腺癌藥物的開(kāi)發(fā)提供重要的物質(zhì)資源和理論參考。