黃天姿，梁 錦，王 丹，張 璐，李瑞娟，楊淑霞，羅安偉*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

獼猴桃（Actinidia chinensis）以其良好的口感、豐富的營養(yǎng)價值以及保健功能而深受消費者青睞，素有水果之王的稱號。然而，獼猴桃是典型的呼吸躍變型水果，且皮薄汁多，易受機械損傷和微生物侵染而腐爛[1]。獼猴桃采后貯運期間發(fā)生的病害有軟腐病、灰霉病、青霉病等。灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的科學研究重要性在十大植物病原真菌中排名第二[2]，由其引起的灰霉病是獼猴桃采后的主要病害之一[3]。

電子束輻照作為一種新型綠色的物理冷加工技術，其電離輻射在食品中所產生的輻射化學和輻射生物學效應具有抑制生理代謝、延緩后熟衰老、抑制發(fā)芽、殺蟲滅菌和改進品質等效果[4]。電子束輻照可以顯著降低紅辣椒粉中的總需氧微生物數[5]，完全消除真空包裝煙熏鴨肉的總需氧細菌和大腸桿菌[6]，顯著降低柑橘中的酵母和霉菌數以及總需氧微生物數[7]。張婷[8]用2.0 kGy以上電子束輻照灰葡萄孢菌分生孢子，發(fā)現電子束輻照可以顯著抑制灰葡萄孢菌分生孢子的萌發(fā)及芽管伸長，延遲其萌發(fā)時間，導致芽管畸形，降低其致病力。

目前，國內外電子束輻照在果蔬保鮮方面的研究主要集中在保鮮機理及其對活性成分的影響上。在 藍莓[4]、柑橘[7]、草莓[8]、蘋果[9]、櫻桃[10]等果蔬上有一定研究，如代守鑫[10]研究表明，電子束輻照能減少甜櫻桃的爛果率，抑制細菌生長，保持花青素、總酚、可溶性固形物以及總糖含量。而電子束在獼猴桃保鮮方面的研究較少，周慧娟等[11]研究證明電子束輻照有效地控制了紅陽獼猴桃采后的軟化衰老進程，能減少其貯藏期間的腐爛變質，保持果實的外觀色彩和果肉色澤。電子束處理對獼猴桃灰霉病相關的胞外抗性酶活性及抗病系統(tǒng)的影響還鮮見報道。本實驗以接種B. cinerea模擬‘海沃德’獼猴桃被該病菌侵染，再以不同劑量電子束輻照處理，分析比較獼猴桃在冷藏過程中的品質變化，以及輻照對抗性相關酶過氧化物酶（peroxidase，POD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力及抗病物質多酚、類黃酮和膜脂過氧化產物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影響，評價高能電子束輻照對獼猴桃貯藏品質影響及對灰霉病的抑制效果，為電子束輻照技術在獼猴桃防腐保鮮上的應用提供理論與技術依據。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

灰葡萄孢菌菌種由西北農林科技大學食品科學與工程 學院果蔬貯藏與加工實驗室從冷庫中腐爛的獼猴桃上分離得到，并經分子生物學鑒定。

獼猴桃為‘海沃德’品種，產地為陜西省周至縣獼猴桃基地，于2018年10月采收成熟度一致（可溶性固形物（total soluble solids，TSS）質量分數6.0%～6.5%）、大小均一、無病蟲害、無機械傷的果實，采收后立即運回實驗室，散去田間熱后，備用。

沒食子酸、H2O2、NaOH 天津市天力化學試劑有限公司；蘆丁 廣東光華科技股份有限公司；昆布多糖 北京博奧拓達科技有限公司；福林-酚試劑 美國 Sigma公司；聚乙烯基聚吡咯烷酮（polyethylene polypyrrolidone，PVPP） 北京索萊寶科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ESS-010-03電子直線加速器 陜西省方圓輻照有限公司；N6000雙光束紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；TA.XT PLUS物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；T-203電子天平 北京科普爾科技發(fā)展有限公司；DK-98-11-A電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；PAL-1數顯糖度計 日本愛拓有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備與接種

B. cinerea菌懸液制備：使用前將B. cinerea菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基上進行活化，用無菌水配制成懸浮液備用，菌液濃度為1×106CFU/mL。

接種：將獼猴桃果實用體積分數2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，無菌水沖洗2～3 次，自然晾干。試樣分為4 組，每組200 個，均在果實赤道部位均勻取4 個點，用直徑1 mm的消毒牙簽扎深度為4 mm的小孔，用注射器分別在小孔中注入1×106CFU/mL孢子懸浮液15 μL[12]。

1.3.2 電子束輻照處理獼猴桃

電子束輻照處理：輻照裝置為ESS-010-03電子直線加速器（額定能量為10 MeV、功率10 kW、掃寬800 cm、束流2 mA）。將4 組果實裝入0.03 mm厚的聚乙烯袋中，單層擺放于輻照托盤中，置于傳送帶上送入輻照室進行輻照處理，輻照劑量分別為0（對照）、0.4、0.8、1.2 kGy；將不同劑量輻照處理的獼猴桃貯藏于0～1 ℃、相對濕度（relative humidity，RH）90%～95%的冷庫中備用。貯藏期間，每15 d隨機取樣，測定各項指標，每個處理重復3 次。以果肉硬度低于0.5 kg/cm2時結束實驗，此時果實已軟化至可食用或腐爛，以此為標準，對照組貯藏期為90 d，各輻照處理組貯藏期為75 d。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 質量損失率測定

稱量獼猴桃果實初始及貯藏后質量，質量損失率按下式進行計算。

1.3.3.2 果肉硬度測定

物性測定儀穿刺法測定果肉硬度，在TPA模式下，隨機取5 個果實進行測定，在獼猴桃果實赤道部位均勻取3 點，削去果實表皮，重復3 次。探頭為P2（直徑為0.5 cm），測試模式為Messure Force in Compression，參數設置為：預壓速率1.00 mm/s、下壓速率5.00 mm/s、壓后上行速率5.00 mm/s、兩次壓縮中間停頓5.00 s，硬度單位為kg/cm2。

1.3.3.3 TSS、可滴定酸質量分數測定

隨機取4 個獼猴桃果實，去皮后切除果心處的果肉，用榨汁機研磨榨汁。用蒸餾水將數顯糖度計調零后測定TSS質量分數，單位為%。

可滴定酸（titrable acidity，TA）質量分數測定參照曹建康等[13]的酸堿中和法，TA以檸檬酸計，重復3 次。

1.3.3.4 多酚、類黃酮含量測定

多酚、類黃酮含量的測定參照謝敏[14]的方法并略有改動。稱取2 g果肉，加少許預冷過的體積分數1%鹽酸-甲 醇溶液，冰浴充分研磨，轉移到20 mL容量瓶中，用體積分數1%鹽酸-甲醇溶液定容，在冰箱中放置20 min，7500 r/min離心20 min，取上清液分別在765、510 nm波長處測定吸光度，分別用于多酚、類黃酮含量的計算。

1.3.3.5 POD、PAL、GLU活力及MDA含量測定

POD、PAL、GLU活力及MDA含量測定參考曹建康等[13]的方法。取3 g冷凍（-80 ℃）果肉，分別加入3 mL對應提取緩沖液，冰浴研磨成勻漿，10000 r/min冷凍離心30 min，提取出粗酶液用于POD、PAL、GLU活力的測定。以每分鐘每克鮮組織酶促反應體系在470 nm波長處吸光度增加1為1 個POD活力單位（U）；以每小時每克鮮組織酶促反應體系在290 nm波長處吸光度增加0.01為1 個PAL活力單位（U）；以每克鮮質量組織每秒形成1 μmol葡萄糖為1 個GLU活力單位（U）。

取1 g冷凍果肉，加入5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，冰浴研磨至勻漿，10000 r/min冷凍離心20 min，上清液用于MDA含量的測定。單位為mmol/g，結果以鮮質量計。

1.4 數據處理與分析

所有指標測定平行3 次，結果表示為平均值±標準差，采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，用Duncan法進行多重比較，P＜0.05表示存在顯著性差異。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 電子束輻照對侵染B. cinerea的獼猴桃質量損失率、硬度的影響

圖 1 電子束輻照對侵染灰葡萄孢菌‘海沃德’獼猴桃質量損失率（A）、硬度（B）的影響Fig. 1 Effect of electron beam irradiation on mass loss rate (A) and hardness (B) of ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

質量損失率是評價水果采后品質變化的重要指標。質量損失是水果活躍的新陳代謝作用加速果實呼吸消耗和蒸騰失水所致[15]。如圖1A所示，隨著貯藏時間延長，果實質量損失率增加，電子束輻照處理能明顯降低獼猴桃貯藏過程中的質量損失率，貯藏75 d時0.8 kGy輻照組的質量損失率比對照組低20%，但不同輻照組之間的質量損失率整體上差異不顯著（P＞0.05），說明電子束輻照可以減少獼猴桃的呼吸消耗和水分流失，即抑制呼吸代謝和蒸騰作用從而達到保鮮的效果，但與輻照劑量無關。Gomes等[16]用不同劑量（0、1、2、3 kGy）電子束輻照西藍花，再將西藍花于4 ℃、RH 95%條件下貯藏14 d，其質量損失率隨貯藏時間延長顯著 增加（P＜0.05），但劑量對質量損失率的影響不顯著（P＞0.05），與本實驗結果一致。

獼猴桃果實后熟軟化是貯藏期品質變化的顯著表現。如圖1B所示，果肉硬度隨貯藏時間延長呈下降趨勢，0～15 d硬度迅速下降，之后緩慢下降。貯藏期內，對照組果實的硬度整體上最高，15 d時對照組硬度為6.42 kg/cm2，顯著高于各輻照處理組（P＜0.05）， 說明接種B. cinerea后進行電子束輻照處理會對獼猴桃 果肉硬度產生一定的負面影響，加快軟化進程。除60 d時1.2 kGy輻照組硬度顯著大于0.4、0.8 kGy輻照組外，其他時間輻照組之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

Kheshti等[9]用377 Gy和1148 Gy電子束輻照‘富士’蘋果后將其先冷藏7 d再于室溫下貯藏7 d，結果發(fā)現與對照組相比，兩個劑量處理均使果肉硬度下降，且1148 Gy輻照組果肉硬度顯著低于對照組，說明不適宜劑量的電子束輻照會對硬度產生不良影響。B. cinerea能產生果膠酶、纖維素酶等多種細胞壁降解酶，導致硬度降低，且這些酶與該菌的致病作用有一定的相關性，在侵入和定植寄主組織中發(fā)揮著重要的作用。陳召亮等[17]的研究結果表明，2.0 kGy以上電子束輻照可以顯著抑制B. cinerea聚甲基半乳糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性，降低該菌菌絲對草莓細胞壁的穿透能力，導致侵染致病活性下降，有效減輕采后草莓灰霉病的發(fā)生，維持果實硬度。由于本研究中采用的輻照劑量均低于2.0 kGy，可能導致接種B. cinerea后，在灰霉菌和輻照處理的共同影響下，輻照組果肉硬度低于對照組。

2.2 電子束輻照對侵染B. cinerea的獼猴桃TSS、TA 質量分數的影響

圖 2 電子束輻照對侵染灰葡萄孢菌的‘海沃德’獼猴桃TSS（A）、TA（B）質量分數的影響Fig. 2 Effect of electron beam irradiation on total soluble solids (A) and titratable acid (B) contents in ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

如圖2A所示，果實TSS質量分數在整個貯藏期呈上升趨勢。在15～60 d，對照組TSS質量分數高于輻照組，其中30～45 d對照組TSS質量分數顯著高于輻照組 （P＜0.05），75 d時對照組TSS質量分數最低，其中0.4 kGy輻照組的TSS質量分數顯著高于其他3 組 （P＜0.05）。因此，適宜劑量的輻照處理能抑制TSS質量分數在貯藏前期的上升與貯藏后期的下降，延緩后熟衰老進程，保持果實的品質。周慧娟等[11]用高能電子束輻照‘紅陽’獼猴桃，整個貯藏期內500 Gy處理組TSS質量分數顯著高于對照組。白婷等[18]用0.2 kGy電子束輻照龍眼，在30 ℃下貯藏6 d，輻照組TSS質量分數顯著高于對照組，說明輻照處理能有效延緩龍眼果實貯藏過程中營養(yǎng)物質的損失，保持果實的品質。

TA是呼吸作用的底物之一，是果蔬采后生命活動的物質基礎，采后冷藏期間，TA作為呼吸底物被消耗[11]。 圖2B顯示，貯藏期內，各組果實TA質量分數呈下降趨勢。除60 d外，3 個輻照處理組中至少有一組的TA質量分數高于對照組，表明輻照處理可以抑制獼猴桃的呼吸等生理代謝，從而抑制TA質量分數的下降。60 d時對照組TA質量分數顯著高于輻照組（P＜0.05）。60、75 d輻照組中1.2 kGy處理組TA質量分數最低，說明高劑量處理組獼猴桃TA消耗更快。除15、75 d外，0.4、0.8 kGy處理組TA質量分數差異不顯著，故整體來看，貯藏期內適宜輻照劑量（0.4 kGy和0.8 kGy）對TA質量分數影響無顯著差異，這與Nam等[7]研究發(fā)現0.4 kGy和1.0 kGy電子束輻照柑橘TA質量分數不受輻照劑量影響以及Ramakrishnan等[19]發(fā)現0.4 kGy和1.0 kGy的電子束輻照不會改變葡萄柚的TA質量分數結果類似。

2.3 電子束輻照對侵染B. cinerea的獼猴桃多酚、類黃酮含量的影響

圖 3 電子束輻照對侵染灰葡萄孢菌的‘海沃德’獼猴桃多酚（A）、類黃酮（B）含量的影響Fig. 3 Effect of electron beam treatment on the contents of polyphenols (A) and flavonoids (B) in ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

多酚是重要的植物次生代謝產物，其本身及其氧化產物均具有抗菌功能，可提高植物抗病性[20]。其含量是評價果實對病害抗性的指標之一。如圖3A所示，貯藏期內，各輻照組的多酚含量呈下降趨勢，對照組呈先下降再上升后下降趨勢，75 d時出現最高峰。 15 d時0.4 kGy輻照組多酚含量比對照組高15.09% （P＜0.05），其他組與對照組無顯著差異，可能是低劑量電子束處理對多酚的誘導效應強于高劑量；30～75 d時對照組多酚含量高于輻照組，且在60、75 d時具有顯著差異（P＜0.05）。貯藏期內B. cinerea的生長繁殖會誘導體內多酚生成，這是果實受到病菌侵害時的自我免疫機制之一；而輻照處理一定程度會抑制B. cinerea的生長，從而使誘導的多酚含量減少，故輻照組多酚含量低于對照組，且0.4 kGy輻照處理對維持多酚含量效果較好。Tejedor-Calvo等[21]用電子束輻照黑松露，輻照組多酚含量低于對照組，且低劑量組的多酚含量高于高劑量組；de Jesús Ornelas-Paz等[22]用γ射線（150、400 Gy和1000 Gy）輻照柑桔，多酚含量增加且1000 Gy輻照組多酚含量最高，但某些單體酚含量下降；輻照對多酚含量的影響存在差異，這與植物種類、多酚組成等諸多因素有關[23]。

類黃酮含量也是評價果實對病害抗性強弱的指標之一。如圖3B所示，貯藏期內，類黃酮含量總體呈先上升后下降的趨勢，且輻照處理使類黃酮含量最高峰提前出現15～30 d；前45 d對照組類黃酮含量顯著低于0.4 kGy輻照組的類黃酮含量，且0.4 kGy輻照組在45 d時出現最高峰，含量峰值大于其他3 組最高峰峰值，與對照組相比，含量最高峰峰值升高25.52%。綜上可知，適宜劑量的電子束輻照可以顯著提高侵染B. cinerea的‘海沃德’在貯藏期的類黃酮含量，從而提高果實抗病性。這與 Reyes等[24]用1.0～3.1 kGy電子束輻照芒果，發(fā)現抗性物質黃酮含量升高的研究結果相似。

2.4 電子束輻照對侵染B. cinerea的獼猴桃POD、PAL 活力的影響

獼猴桃的生理組織結構和生化抗性可在一定程度上抵抗病原菌的侵染。生化抗性主要是由真菌感染引起的植物代謝變化，引起植物抗毒素、酚類化合物含量和抗性酶活力的變化[25]。B. cinerea作為一種生物因子、高能電子束作為一種物理因子，均可使獼猴桃產生一定的誘導抗性，激活果實自身的抗病防御系統(tǒng)從而有效抵御或殺死病原菌[8]，而果實往往通過增強抗性相關酶活力來增強自身抗病性，因此獼猴桃POD、PAL和GLU等防御酶活力一定程度上可以反映獼猴桃果實的抗病性。

POD通過將H2O2轉化為H2O和O2以清除細胞內活性氧、將酚類物質氧化成醌以及參與木質素的合成達到抑制病原菌和延緩果實衰老的作用[26]?？赏ㄟ^POD活力衡量系統(tǒng)清除自由基的能力。從圖4A可知，輻照處理組的POD活力整體上呈先上升后下降的趨勢，對照組呈 上升-下降、再上升-下降的趨勢。在0～30 d，輻照處理組POD活力整體上顯著高于對照組（P＜0.05），且活力最高峰提前15～30 d出現。0.4 kGy輻照組貯藏15 d達到POD活力峰值，比另兩個劑量輻照組提前15 d，且POD活力峰值高于其他3 組的活力最高峰峰值，其中比對照組活力最高峰峰值增加2.36%，說明適宜劑量的輻照處理可提高侵染B. cinerea獼猴桃的抗衰老能力及抗病性。 Pan Liuyi等[27]用0.1 mmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理接種葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的獼猴桃，結果表明MeJA處理顯著增強了獼猴桃的POD活力；Luo Anwei等[28]在0 ℃下用79.44 mg/kg 氣態(tài)臭氧分別處理接種擴展青霉和灰葡萄孢霉浸染的獼猴桃，發(fā)現果實的POD活力顯著提高；郭葉[29]用1-甲基環(huán)丙烯對獼猴桃進行保鮮，發(fā)現保鮮組POD活力顯著高于對照組，且出峰時間晚于對照組。綜上所述，不同的激發(fā)子可以有效誘導POD等植物防御相關酶的活力升高，從而增強其對真菌的抗感染能力。電子束輻照獼猴桃，可以誘導果實抗性相關酶POD活力增加，同時活力最高峰出現時間提前，果實提前產生抗性。

圖 4 電子束輻照對侵染灰葡萄孢菌的‘海沃德’獼猴桃POD（A）、PAL（B）活力的影響Fig. 4 Effect of electron beam treatment on the activity of POD (A) and PAL (B) in ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

PAL是催化苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶和限速酶[30]， 其活力與抗病性成正相關。如圖4B所示，貯藏期內PAL活力基本呈先升高后降低的趨勢，且輻照組PAL活力顯著高于對照組（P＜0.05），0.4、0.8 kGy和1.2 kGy輻照組活力最高峰峰值較對照組分別高27.92%、44.35%、45.94%，說明電子束輻照可顯著增強抗性酶PAL的活力，使獼猴桃誘導抗病性增強。張婷[8]用0～3.0 kGy的電子束輻照接種B. cinerea的草莓，發(fā)現1.0 kGy的電子束輻照可以顯著提高PAL等抗性相關酶的活力。說明電子束輻照能夠顯著增強接種B. cinerea果實的PAL活力，誘導果實產生抗病性。

2.5 電子束輻照對侵染B. cinerea的獼猴桃GLU活力、MDA含量的影響

圖 5 電子束輻照對侵染灰葡萄孢菌的‘海沃德’獼猴桃GLU活力（A）、MDA含量（B）的影響Fig. 5 Effect of electron beam treatment on GLU activity (A) and MDA content (B) in ‘Hayward’ kiwifruit infected with gray mold

GLU是重要的病程相關蛋白質，可以分解病原菌的細胞壁或菌絲體，對病原菌有直接的殺傷作用[31]，可由病原菌、紫外照射、機械損傷等多種生物和非生物因子誘導產生，以增強抗病力。從圖5A可看出，輻照處理提高了果實的GLU活力，且各輻照組GLU活力峰值均明顯高于對照組，0.8、1.2 kGy輻照組首次GLU活力峰出現時間提前30 d。0.4、0.8 kGy和1.2 kGy輻照組活力最高峰峰值較對照組分別高5.01%、24.01%、27.51%。Jin Peng等[32]的研究結果表明，熱空氣處理接種B. cinerea的草莓，GLU活力顯著升高，草莓的誘導抗病性增強；Cheng Lilin等[33]以接種灰葡萄孢菌和鏈格孢菌的獼猴桃為材料進行研究，結果發(fā)現單獨或聯合使用拮抗性酵母與β-氨基丁酸可誘導幾丁質酶和GLU活力增強，與本實驗的結果一致。

活性氧引起的脂質過氧化是植物組織中膜損傷的主要機制，并且產生多種副產物，MDA就是其中之一[34]，其含量可以衡量果肉細胞受到損傷的程度[35]。圖5B顯示，貯藏期內輻照處理組MDA含量均高于對照組，表明輻照處理對獼猴桃果肉細胞產生了一定程度的損傷，導致細胞膜受損，引起膜脂過氧化反應。輻照處理組中，0.8 kGy輻照處理組的MDA含量整體上最低，膜脂質過氧化程度較低，對獼猴桃損傷較小。

3 結 論

通過對不同劑量電子束輻照侵染B. cinerea的‘海沃德’獼猴桃貯藏期品質和生理指標的變化研究，發(fā)現電子束輻照處理能降低獼猴桃的質量損失率，抑制TA質量分數的下降。同時，與對照組相比，經電子輻照處理后的獼猴桃抗性物質類黃酮含量最高峰峰值升高，抗性相關酶POD、PAL、GLU活力整體上升高，且0.8、1.2 kGy輻照組GLU活力首次出現峰值的時間提前。研究結果表明，電子束輻照可以通過提高抗性相關酶活力，提高類黃酮含量來增強果實自身抗性，減輕采后灰霉病的發(fā)生。本研究所選用的3 個劑量中，0.4 kGy處理能較好地保持獼猴桃品質，在30～60 d質量損失率最低、60～75 d TSS質量分數最高，且類黃酮含量和POD活力的最高峰峰值最大，故0.4 kGy電子束輻照可以在保證品質的同時，作為獼猴桃采后灰霉病的新型有效防治手段。

綜合來看，電子束輻照對果實病害的防治作用，不僅與輻照破壞菌絲體內蛋白有關，還與輻照誘導果實防御酶活力升高，增強果實本身抗病性有關。本實驗為電子束防腐保鮮技術在獼猴桃中的應用提供了理論依據，為探求綠色、高效的防腐保鮮技術提供了參考。