王 丹

（白銀市白銀區(qū)獸醫(yī)站，甘肅 白銀 730900）

鵝副黏病毒病是一種急性和高度傳染性的鵝感染，由I型鵝衍生的副黏病毒（Avian Paramyxovirus Serotype-1，APMV-1）引起的接觸性傳染病。病原為鵝副黏病毒（APMV），屬于副黏病毒科、腮腺炎病毒屬，病毒核酸為帶有負(fù)鏈的單鏈RNA。APMV有9種血清型，其中APMV-1是家禽中最重要的病原體，在世界許多國家引起家禽的發(fā)病和死亡[1]。以前，人們認(rèn)為鵝不會(huì)感染禽副黏病毒，國外至今未見禽副黏病毒感染鵝的報(bào)道[2]。1997年揚(yáng)州大學(xué)王永坤教授在江蘇省首次發(fā)現(xiàn)該病[3]，并做了流行病學(xué)調(diào)查：該病對(duì)所有年齡段的鵝都造成傷害，死亡率和發(fā)病率跟年齡成反比，雛鵝發(fā)病后常引起死亡。該病主要通過呼吸道和消化道傳播，其流行沒有明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，常引起地方流行。

2019年1月甘肅某鵝場(chǎng)出現(xiàn)青年鵝不明原因死亡，死亡率約為40%，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病鵝初期精神不振，縮頭垂翅，采食、飲水減少，拉白色水樣稀糞。走路時(shí)虛弱，拒絕入水，在水面上游泳，在地面總躺下?；疾〉某赡犍Z有時(shí)會(huì)將頭埋在翅膀下，常見口腔流出水樣液體。稍后階段，患病的鵝變得非常虛弱，渾身發(fā)抖，眼睛流淚，眼窩和周圍的羽毛被淚水打濕，鼻孔冒出來黃色黏液。死鵝整個(gè)消化道黏膜均有不同程度的腫脹、充血、出血等病變。初步懷疑是鵝副黏病毒感染。為了確診，采集病鵝、死鵝的脾臟和大腦，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒的分離和初步鑒定。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料

病料采集于甘肅地區(qū)疑似鵝副黏病毒感染的鵝場(chǎng)。采集死鵝的脾臟、肝臟、肺臟和大腦，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 雞胚

9～11日齡非新城疫免疫雞胚，由楊凌綠方生物工程有限公司提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康雞。3日齡小公雞購自西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院畜牧教學(xué)試驗(yàn)基地種雞場(chǎng)。

1.4 試驗(yàn)試劑及儀器

3.8%的枸櫞酸鈉，pH 7.2、0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（P B S）由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室配制。新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽/陰性血清購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。青霉素和鏈霉素由河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司提供。

12#針頭，1 ml注射器，96孔聚乙烯塑料“V”型血凝反應(yīng)板，微量移液器及槍頭，移液管，剪刀，鑷子，青霉素瓶，石蠟，酒精棉，照蛋器，離心管，離心機(jī)，37℃恒溫培養(yǎng)箱等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 1%雞紅細(xì)胞懸液的制備

首先，選取健康大公雞1只，翅靜脈采集抗凝血。其次，離心洗滌紅細(xì)胞。將采集的抗凝血放入離心管中，加入適量PBS洗滌液，1 500 r/min，離心10 min。反復(fù)離心洗滌3～5次。最后，配制1%紅細(xì)胞懸液。用移液管吸取洗滌后的紅細(xì)胞1 ml，加入99 ml PBS液中，4℃靜置保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 病料處理

先取采集病鵝的脾臟、肝臟和大腦稱重，研磨，用PBS做1∶5稀釋，反復(fù)凍融3次以上。然后取凍融后液體，5 000 r/min離心15 min，取上清液加雙抗4℃作用6 h以上，加入的青霉素濃度為1 000 IU/ml，加入的鏈霉素濃度為1 000 μg/ml。最后取雙抗處理后的液體用0.22 μm微孔濾膜過濾，選取濾液，通過細(xì)菌學(xué)檢測(cè)為陰性，當(dāng)作病毒分離液。

2.3 雞胚接種

從患病鵝中分離無菌病毒接種到10枚10日齡非新城疫免疫雞胚尿囊腔中，每胚接種0.2 ml，每12 h照蛋1次。

2.4 血凝試驗(yàn)（HA）

在96孔聚乙烯塑料“V”型血凝反應(yīng)板中進(jìn)行。用微量移液器每孔加入50 μlpH 7.2、0.01 mol/L的PBS液，用微量移液器吸取收集的尿囊液50 μl，從第1孔起依次倍比稀釋，至第11孔棄去50 μl稀釋液。每孔加入50 μl1%雞紅細(xì)胞懸液，設(shè)立不加紅細(xì)胞的對(duì)照孔。把所加的液體搖勻后，將反應(yīng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，30 min左右觀察結(jié)果。血凝試驗(yàn)操作術(shù)式見表1。

表1 血凝試驗(yàn)操作術(shù)式

2.5 4單位抗原的配制

準(zhǔn)備好配制4單位抗原所需的材料，包括病毒抗原、PBS緩沖液、1%雞紅細(xì)胞、單道和多道移液器及吸頭、20 ml青瓶及塞子、96孔微量血凝板等。

需要4單位抗原總量20 ml，利用公式（抗原原液×64（稀釋倍數(shù)）=20 ml）求出抗原原液的體積為0.312 ml，需要PBS緩沖液約19.7 ml。取PBS緩沖液19.7 ml，加入20 ml的小青瓶中，取0.312 ml的病毒抗原液，加入緩沖液中，蓋上塞子并充分混勻，4單位抗原配制完成。

2.6 血凝抑制試驗(yàn)（HI）

在96孔聚乙烯塑料“V”型血凝反應(yīng)板中進(jìn)行。用加樣槍每孔加25 μl PBS稀釋液，取新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清25 μl，從第1孔起依次倍比稀釋，置第10孔棄取25 μl稀釋液。每孔再加入25 μl配制好的4單位抗原，加到第11孔。培養(yǎng)10 min后，最后每孔加入50 μl1%紅細(xì)胞懸液。將反應(yīng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，30 min左右觀察結(jié)果。血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定術(shù)式如表2所示。

表2 血凝抑制試驗(yàn)測(cè)定術(shù)式

2.7 動(dòng)物試驗(yàn)

將收集的雞胚尿囊液肌肉注射給3日齡小公雞（10只），每只雞注射0.2 ml，設(shè)立對(duì)照組，共5只小公雞，每只肌肉注射0.2 ml無菌生理鹽水。飼養(yǎng)觀察。

3 結(jié)果與分析

雞胚接種情況和血凝試驗(yàn)：10枚雞胚有1枚24 h內(nèi)死亡，5枚雞胚48 h內(nèi)死亡，剩余雞胚72 h全部死亡。收集雞胚的尿囊液并分裝做血凝試驗(yàn)，血凝試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 血凝試驗(yàn)結(jié)果

將收集的尿囊液配制4單位病毒抗原，血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果為4單位抗原的血凝性能被新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制。

接種尿囊液的小公雞于接種后48 h發(fā)病，72～120 h小公雞陸續(xù)死亡（72～98 h死亡約2/3，98～120 h死亡約1/3）。死亡小雞全身黏膜和漿膜出血，其中以呼吸道和消化道出血較為明顯，由小腸到盲腸和直腸黏膜有大小不等的出血點(diǎn)。腺胃黏膜水腫，其乳頭或乳頭間有出血點(diǎn)。心冠脂肪有針尖大的出血點(diǎn)，盲腸扁桃體出血。有神經(jīng)癥狀的小雞剖檢可見腦膜充血或出血，腦實(shí)質(zhì)無眼觀變化，類似于發(fā)病鵝的病理變化。對(duì)照組小雞無發(fā)病死亡情況。

由于血凝價(jià)均大于23，證明所分離的病毒有血凝性。4單位抗原的血凝性能被新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制，結(jié)果證明所分離的病毒為鵝副黏病毒。從動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果可以看出分，離出的病毒在雞中具有高致病性。

4 討論

國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料表明，禽副黏病毒Ⅰ型不感染水禽，即使有病毒，但癥狀也不會(huì)表現(xiàn)得特別明顯。任濤[4]報(bào)告中說，新城疫毒力強(qiáng)的菌株已被用于抗擊28日齡的鵝，但它并未引起耐受鵝的疾病或死亡。自王永坤[5]教授于1997年報(bào)道鵝中存在副黏病毒以來，上海、吉林、黑龍江、江西、河南、安徽、貴州、遼寧、廣西、廣東、浙江等地區(qū)的鵝均已報(bào)告該病爆發(fā)流行。據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，鵝副黏病毒病感染率為40%～100%，平均為60%，死亡率為30%～100%，平均為40%。其中，15日齡雛鵝的發(fā)病率和死亡率均為100%?；疾※Z群年齡越小，發(fā)病率和死亡率就越高。鵝副黏病毒病的流行已對(duì)鵝產(chǎn)業(yè)造成了巨大破壞，并嚴(yán)重威脅著鵝產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

近年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鵝副黏病毒病在規(guī)模化養(yǎng)鵝場(chǎng)普遍存在[6]。本次試驗(yàn)所采集的病料來自一個(gè)養(yǎng)殖數(shù)量約30 000只的鵝場(chǎng)。試驗(yàn)用非新城疫免疫雞胚從采集的病料中分離到了病毒。分離毒株傳代的雞胚尿囊液具有較高的HA效價(jià)，并且能被新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抑制，不能被新城疫陰性血清抑制，說明分離的病毒為鵝副黏病毒。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，建議鵝場(chǎng)立即采用鵝副黏病毒高免血清對(duì)鵝群進(jìn)行緊急預(yù)防治療，對(duì)病情嚴(yán)重的鵝及早淘汰。鵝場(chǎng)連夜從成都空運(yùn)鵝副黏病毒高免血清對(duì)鵝進(jìn)行治療，治療第2天鵝發(fā)病數(shù)量明顯減少，1周后鵝場(chǎng)沒有鵝再發(fā)病和死亡。治療結(jié)果又證明了所分離的病毒為鵝副黏病毒。

鵝場(chǎng)如果出現(xiàn)類似癥狀的鵝應(yīng)先確診。確診后立即將沒有出現(xiàn)癥狀的鵝隔離出飼養(yǎng)場(chǎng)地，除了處理死鵝并對(duì)其進(jìn)行無害化處理以及對(duì)家庭和設(shè)備進(jìn)行徹底消毒外，還必須采取以下步驟：幼鵝、青年鵝、成年鵝肌肉內(nèi)或皮下注射滅活疫苗。通常接種疫苗1周可控制發(fā)病率和死亡率，注射滅活疫苗1個(gè)月后可以使用疫苗的射油乳劑進(jìn)行免疫[7]?？梢越o鵝注射高免疫血清或高免疫蛋黃，但在6～7 d左右應(yīng)注射油乳劑滅活苗免疫。在應(yīng)用疫苗或抗體免疫時(shí)可以適量應(yīng)用廣譜抗生素和維生素。