王惠娜 卞 瑤 丁媛媛 李晶蕊 劉 婧 王宏偉

(1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 大連 116081; 2. 遼寧省植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)實(shí), 大連 116081)

隨著DNA分子序列分析在藻類分類中的廣泛應(yīng)用, 藻類分類學(xué)進(jìn)入了分子分析的紀(jì)元, 分子分析與精細(xì)的形態(tài)學(xué)觀察相結(jié)合糾正了早期因只根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)依據(jù)導(dǎo)致的分類錯(cuò)誤。2000年Wang等[1]對(duì)蜈蚣藻中空變型G. filicinavar.lomentariaHowe、蜈蚣藻節(jié)莢變型G. filicinavar.porraceaf.lomentaria(Howe) Okamura和管型藻Sinotibimorpha porracea(Martens ex Kützing) Li et Ding進(jìn)行了形態(tài)觀察和rbcL基因序列分析, 結(jié)果表明此3種藻類均不是蜈蚣藻G. filicina的變型也不是新種, 而是蜈蚣藻屬Grateloupia中的一個(gè)獨(dú)立的種,即鏈狀蜈蚣藻Grateloupia catenataYendo, 因此將蜈蚣藻中空變型、蜈蚣藻節(jié)莢變型及管型藻作為鏈狀蜈蚣藻的同物異名。Kawaguchi等[2]通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和基因序列分析, 發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自亞洲的蜈蚣藻與產(chǎn)自意大利的模式種蜈蚣藻[G. filicina(Lamouroux) C. Agardh]存在一定程度的序列差異, 因此認(rèn)為產(chǎn)自亞洲的蜈蚣藻可作為一個(gè)新種而獨(dú)立存在,并將其命名為: 亞洲蜈蚣藻(G.asiaticaKawaguchi et Wang)。2016年, 李芳等[3]通過(guò)形態(tài)觀察和rbcL基因序列分析, 認(rèn)為帚狀蜈蚣藻G. fastigiataLi et Ding與亞洲蜈蚣藻G.asiatica為同一種, 將帚狀蜈蚣藻G. fastigiata作為亞洲蜈蚣藻G.asiatica的同物異名。2017年, 劉芳等[4]運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察與rbcL基因序列相結(jié)合的方法, 對(duì)對(duì)枝蜈蚣藻G. didymecladiaLi et Ding進(jìn)行分析, 認(rèn)為對(duì)枝蜈蚣藻與亞櫛狀蜈蚣藻為同一種, 并將對(duì)枝蜈蚣藻作為亞櫛狀蜈蚣藻的同物異名。由此可見(jiàn), 在藻類分類學(xué)的研究中,分子分析為區(qū)分外部形態(tài)相似, 易造成混淆的藻類提供重要的判斷依據(jù)。其中, 最為常用的分子序列為rbcL基因和COⅠ基因。

本研究的縊基蜈蚣藻記載于《中國(guó)海藻志》(夏邦美主編)第二卷第三冊(cè)中, 是基于簡(jiǎn)單的形態(tài)、結(jié)構(gòu)等特征建立的新種, 該種的主要特征為:藻體叢生, 紫紅色, 主枝圓形、橢圓形或亞扁形, 高5—10 cm, 寬1—1.5 mm。1—2回羽狀分枝, 一般分枝基部縊縮或漸細(xì), 小分枝對(duì)生、互生或偏生, 呈棍棒狀或長(zhǎng)錐形。關(guān)于縊基蜈蚣藻(G. constricataLi et Ding)的研究?jī)H限于《中國(guó)海藻志》中簡(jiǎn)單的外部形態(tài)記載, 而關(guān)于它的詳細(xì)的生殖器官的結(jié)構(gòu)、發(fā)育及分子分析等方面的研究均是空白, 因此本研究對(duì)縊基蜈蚣藻G. constricata的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、孢子早期發(fā)育和DNA分子分析進(jìn)行詳細(xì)的研究, 從而判斷縊基蜈蚣藻G. constricata作為新種是否成立, 明確縊基蜈蚣藻G. constricata在蜈蚣藻屬(GrateloupiaC. Agardh)中的分類地位。本研究將為我國(guó)蜈蚣藻屬的分類修訂、物種多樣性及《中國(guó)海藻志》的再版提供新信息、新資料。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理

標(biāo)本的采集: 縊基蜈蚣藻樣本于2017年6月5日, 由王惠娜和丁媛媛采自模式標(biāo)本產(chǎn)地山東省青島市的第一海水浴場(chǎng)、魯迅公園和麥島。

標(biāo)本的處理: 將采集的海藻去除雜質(zhì)和附生藻類。少數(shù)雌配子體和四分孢子體置于解剖鏡下仔細(xì)觀察, 反復(fù)清理至藻體干凈后, 置于滅菌的海水中備用; 其余的海藻進(jìn)行編號(hào)(表 1), 制成臘葉標(biāo)本,用于觀察外部形態(tài)結(jié)構(gòu); 新鮮標(biāo)本制成冰凍切片,用于觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu); 硅膠干燥標(biāo)本, 提取DNA, 用于后續(xù)的分子分析。

表 1 縊基蜈蚣藻的標(biāo)本號(hào)、采集地點(diǎn)和基因登錄號(hào)Tab. 1 Specimen No., collection information and GenBank accession number

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

外部形態(tài)的觀察: 對(duì)標(biāo)本的外部形態(tài)特征進(jìn)行詳細(xì)的觀察和記錄, 并用Canon EOS 650D拍攝照片。選取合適的臘葉標(biāo)本制成臨時(shí)裝片, 置于光學(xué)顯微鏡和解剖鏡下觀察生殖結(jié)構(gòu)。

內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察: 選取具備生殖器官(囊果或四分孢子囊)的新鮮標(biāo)本, 一般切割為1 cm左右的小段置于冰凍切片機(jī)(YD-335Ⅲ)的刀臺(tái)上, 用OCT包埋劑(SAKURA Tissue-Tek O.C.T. Compound 4583)使其完全被包埋, 制作成冰凍切片, 觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

培養(yǎng)方法: 首先, 用75%的酒精浸泡脫脂棉, 清潔玻璃培養(yǎng)容器并用脫脂棉擦拭, 晾干后用滅菌的海水沖洗3次。而后, 在玻璃培養(yǎng)容器底部鋪一層載玻片(7個(gè)), 將之前備用的雌配子體或四分孢子體及滅菌的空氣泵放入容器中, 加入滅菌的海水, 至海水沒(méi)過(guò)藻體?？諝獗猛? 待孢子釋放。對(duì)光照培養(yǎng)箱(LRH-250-GB)的培養(yǎng)條件進(jìn)行設(shè)置: 溫度20℃, 光照強(qiáng)度80 μmol/(m2·s), 光周期(Light∶Dark)12L∶12D。24h后, 對(duì)載玻片進(jìn)行觀察, 孢子的釋放量為15—30時(shí)(10×10倍視野), 將這些載玻片置于配置好的培養(yǎng)液中, 放入光照培養(yǎng)箱(LRH-250-GB)。每天觀察孢子萌發(fā)情況, 我們采用了Olympus BX53熒光顯微鏡觀察萌發(fā)管中原生質(zhì)體的流動(dòng)方向, 并拍照記錄, 每2天更換1次培養(yǎng)液。使用的培養(yǎng)液為20 mL PES培養(yǎng)液, 2 mg GeO2, 980 mL滅菌海水。

基因序列分析: 使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIAGEN, Valencia, CA, Beijing)提取藻體樣本的DNA, 并進(jìn)行rbcL和COⅠ基因擴(kuò)增, 具體實(shí)驗(yàn)流程參考王宏偉等[5]改進(jìn)的方法, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 檢測(cè)后由上海生工生物公司代為純化和測(cè)序(表 1)。引物設(shè)計(jì):rbcL基因引物組合為 F29-R1150, F765-R1381, 共4個(gè)引物,2對(duì)組合;COⅠ基因引物組合為 COIF1-COIR1, 2個(gè)引物, 1對(duì)組合。系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建: 從GenBank網(wǎng)站下載并選取蜈蚣藻屬40個(gè)種[6—11]及2個(gè)外群種的rbcL基因序列, 15個(gè)種[12,13]及2個(gè)外群種的COⅠ基因序列。(外群選取的原則是選取與內(nèi)群具最近親緣關(guān)系的物種[5])將兩組基因序列分別與本研究中得到的8個(gè)縊基蜈蚣藻的rbcL和COⅠ基因序列進(jìn)行對(duì)比。序列比對(duì)和校正軟件采用Clustalx(1.83)[14], 堿基差異度的分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建使用軟件PAUP 4.0[15]和MEGA 5.0[16]; 算法為Maximum likelihood(ML)法, 計(jì)算遺傳距離的模型為Number of differences和Kimura 2-Parameter, Bootstrap值為1000。

2 結(jié)果

2.1 縊基蜈蚣藻的外部形態(tài)

圖 1為縊基蜈蚣藻的外部形態(tài), 顏色呈紅褐色或紫紅色, 叢生, 直立, 高10—30 cm, 質(zhì)地黏滑, 軟骨質(zhì), 主枝扁平; 1—3回羽狀分枝, 對(duì)生、互生或偏生, 小羽枝生長(zhǎng)在主枝上或主枝邊緣, 基部縊縮(圖 2A)。囊果近球形, 分布于藻體的主枝和小枝,稍突出藻體表面(圖 2B)。

2.2 縊基蜈蚣藻的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)

縊基蜈蚣藻橫切面觀, 厚300—400 μm。如圖 3A所示, 皮層位于橫切面兩端, 厚80—120 μm, 共由7—10層細(xì)胞組成, 包括外皮層和內(nèi)皮層。外皮層細(xì)胞略小, 通常3—5層細(xì)胞; 與外皮層相連的內(nèi)皮層, 細(xì)胞較大, 呈不規(guī)則的星形或長(zhǎng)橢圓形, 通常4—5層細(xì)胞。中央絲狀區(qū)域?yàn)樗璨? 由細(xì)長(zhǎng)的髓絲細(xì)胞組成, 排列不規(guī)則(圖 3A、3B)。

圖 1 縊基蜈蚣藻的外部形態(tài)Fig. 1 External morphology of G. constricata Li et Ding

2.3 縊基蜈蚣藻的生殖結(jié)構(gòu)

雌配子體的生殖結(jié)構(gòu)由其內(nèi)皮層細(xì)胞形成。果胞枝生殖枝叢與輔助細(xì)胞生殖枝叢符合典型的Grateloupia(6cpb-5auxb)型。果胞枝生殖枝叢生長(zhǎng)在較大的支持細(xì)胞上, 與藻體表面相鄰處連接一條受精絲, 受精絲位于藻體外側(cè), 呈伸直或彎曲狀, 該受精絲與果胞枝生殖枝叢中的壺形果胞相連。果胞周圍有6個(gè)細(xì)胞, 包括下位細(xì)胞、亞下位細(xì)胞、基細(xì)胞及3個(gè)圓形細(xì)胞。6個(gè)細(xì)胞均帶有一條側(cè)枝,形成果胞枝生殖枝叢, 即瓶狀體(圖 3C)。輔助細(xì)胞生殖枝叢的基底細(xì)胞為輔助細(xì)胞, 成熟的輔助細(xì)胞呈圓球形(圖 3E—F)。在其周圍可觀察到5個(gè)細(xì)胞,每個(gè)細(xì)胞均帶有一條側(cè)枝, 當(dāng)側(cè)枝完全發(fā)育并且擴(kuò)大, 直到輔助細(xì)胞易于識(shí)別時(shí), 每條側(cè)枝的長(zhǎng)度可達(dá)10—12個(gè)細(xì)胞, 這5條側(cè)枝將輔助細(xì)胞包圍在中心, 形成輔助細(xì)胞生殖枝叢, 即瓶狀體。

縊基蜈蚣藻雄配子體精子囊(圖 3D)中的精母細(xì)胞由表皮細(xì)胞分化而來(lái), 表皮細(xì)胞首先縱向分裂然后伸長(zhǎng), 隨后它們橫向分裂形成末端精子。精子經(jīng)雌配子體表面的受精絲進(jìn)入果胞中, 與果胞結(jié)合,受精后, 二倍體細(xì)胞核可能通過(guò)聯(lián)絡(luò)絲從果胞枝生殖枝叢進(jìn)入到瓶狀體的輔助細(xì)胞中, 輔助細(xì)胞和其兩個(gè)相鄰的瓶狀體細(xì)胞之間發(fā)生細(xì)胞融合, 形成融合復(fù)合體。該復(fù)合體上產(chǎn)生三級(jí)聯(lián)絡(luò)絲和一個(gè)初級(jí)產(chǎn)孢絲指向藻體表面, 在產(chǎn)孢絲發(fā)育的晚期階段,發(fā)育中的產(chǎn)孢絲附近的髓絲最終通過(guò)次生紋孔連接交織并互連, 形成致密的囊果皮。完全發(fā)育成熟的產(chǎn)孢絲由一至兩個(gè)產(chǎn)孢瓣組成, 并且大多數(shù)產(chǎn)孢絲轉(zhuǎn)化為球形的囊果, 成熟囊果直徑范圍為190—230 μm, 果孢子囊上有囊果孔, 果孢子經(jīng)囊果孔逸出(圖 3H)。

四分孢子體表面較大的突起為四分孢子囊, 由孢子體內(nèi)皮層細(xì)胞產(chǎn)生(圖 4A)。四分孢子囊在主枝與小枝上均有分布。四分孢子囊母細(xì)胞 (圖 4B)經(jīng)減數(shù)分裂形成成熟的四分孢子囊(圖 4C), 為長(zhǎng)橢圓形(長(zhǎng)36—52 μm×寬14—20 μm)。

2.4 縊基蜈蚣藻孢子的早期發(fā)育

雌配子體成熟囊果中的果孢子經(jīng)囊果孔逸出,附著在載玻片上(圖 5A和5B)。果孢子為球形或橢圓形, 呈淺紅色, 直徑約15 μm。將果孢子培養(yǎng)24h后, 開(kāi)始萌發(fā)。通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到, 果孢子的一端凸起, 形成萌發(fā)管, 萌發(fā)管伸長(zhǎng), 果孢子中的原生質(zhì)體全部進(jìn)入萌發(fā)管中(圖 5C), 并在萌發(fā)管與原處的半透明膠狀物質(zhì)連接處形成一道隔膜。萌發(fā)管內(nèi)細(xì)胞開(kāi)始不斷分裂(圖 5D—F), 隨后,形成盤狀體, 最大的盤狀體直徑可達(dá)310 μm左右(圖 5F)。盤狀體與臨近的多個(gè)盤狀體相互融合(圖 5G),其臨近中心部位分化產(chǎn)生1—5個(gè)突起, 形成直立芽體(圖 5H)。再經(jīng)30d左右, 直立芽體分化成直立枝(圖 5I)。繼續(xù)培養(yǎng), 直立枝發(fā)育成幼苗。

圖 2 縊基蜈蚣藻囊果Fig. 2 Branches of G. constricata Li et Ding

圖 3 縊基蜈蚣藻內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig. 3 The internal structure of G. constricata Li et Ding

圖 4 縊基蜈蚣藻四分孢子體內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig. 4 The internal structure of tetrasporophyte of G. constricata Li et Ding

圖 5 縊基蜈蚣藻果孢子的萌發(fā)過(guò)程Fig. 5 The development of carpospores in G. constricata

四分孢子的早期發(fā)育過(guò)程與果孢子的完全一致。

2.5 縊基蜈蚣藻的rbcL和COⅠ基因序列分析結(jié)果

rbcL基因序列分析 縊基蜈蚣藻的8個(gè)rbcL基因序列長(zhǎng)度均為1244 bp, 比對(duì)校正后為1198 bp。序列比對(duì)(MAGE5)結(jié)果顯示如圖 6, 8個(gè)縊基蜈蚣藻的基因序列間無(wú)堿基差異, 與青島、大連的亞洲蜈蚣藻均無(wú)堿基差異, 與韓國(guó)的亞洲蜈蚣藻堿基差異為2 bp (0.17%), 與日本的亞洲蜈蚣藻堿基差異為3 bp (0.25%), 它們位于獨(dú)立的發(fā)育枝中?？O基蜈蚣藻與舌狀蜈蚣藻(G. livida)堿基差異為17 bp(1.42%), 與頂狀蜈蚣藻(G. acuminate)堿基差異為34 bp (2.84%), 與美國(guó)蜈蚣藻(G.americana)堿基差異為34 bp (2.84%), 與伸展蜈蚣藻(G. patens)堿基差異為42 bp (3.51%), 與史氏蜈蚣藻(G. schmitziana)堿基差異為47 bp (3.92%), 與叉枝蜈蚣藻(G. divaricata)堿基差異為70 bp (5.84%)。與蜈蚣藻(G. filicina)的堿基差異為87 bp (7.26%), 均屬于種間差異。與作為外群的海膜屬(HalymeniaC. Agardh)的H. floresia和海柏屬(PolyopesJ. Agardh)的P. constrictus的堿基差異分別為119 bp (9.93%)、124 bp(10.35%)。

圖 6 縊基蜈蚣藻基于rbcL基因的ML系統(tǒng)樹(shù)Fig. 6 Maximum likelihood tree based on rbcL gene of G. constricata

COⅠ基因序列分析縊基蜈蚣藻的8個(gè)COⅠ基因序列長(zhǎng)度均為629 bp, 比對(duì)校正后為616 bp。序列比對(duì)(MAGE5)結(jié)果顯示如圖 7, 8個(gè)縊基蜈蚣藻的基因序列間沒(méi)有堿基差異, 與韓國(guó)的亞洲蜈蚣藻無(wú)堿基差異, 它們位于獨(dú)立的發(fā)育枝中?？O基蜈蚣藻與蜈蚣藻(G. filicina)的堿基差異為65 bp(10.55%)。與作為外群的海膜屬(HalymeniaC.Agardh)的H. floresii和海柏屬(PolyopesJ. Agardh)的P. affinis的堿基差異分別為81 bp (13.15%)、89 bp(14.45%)。

圖 7 縊基蜈蚣藻基于COⅠ基因的ML系統(tǒng)樹(shù)Fig. 7 Maximum likelihood tree based on COI gene of G. constricata

3 討論

對(duì)縊基蜈蚣藻的外形及生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行觀察, 發(fā)現(xiàn)其與亞洲蜈蚣藻在藻體顏色、大小、質(zhì)地等方面完全一致(圖 8A), 僅兩者的分枝類型存在差異:前者為1—3回羽狀分枝; 后者為二叉分枝(表 2),可能由于同種海藻因緯度、采集期及生態(tài)環(huán)境等不同, 導(dǎo)致二者在分枝上略有差異。1970年, Chiang[17]根據(jù)輔助細(xì)胞的位置及在其周圍聯(lián)絡(luò)絲形成的輔助細(xì)胞瓶狀體的特點(diǎn), 將Grateloupia型的輔助細(xì)胞生殖枝叢結(jié)構(gòu)作為蜈蚣藻的重要鑒別特征。Gargiulo等[18]認(rèn)為, 根據(jù)構(gòu)成輔助細(xì)胞生殖枝叢和果胞枝生殖枝叢主枝的細(xì)胞在數(shù)量上的區(qū)別, 可將Grate-loupia型分為三種類型, 包括6cpb-5auxb型、5cpb-4auxb型和4cpb-3auxb型, 并且指出亞洲蜈蚣藻為典型的Grateloupia(6cpb-5auxb)型。本研究發(fā)現(xiàn), 縊基蜈蚣藻為Grateloupia(6cpb-5auxb)型, 與亞洲蜈蚣藻為同一類型。二者僅在藻體分枝部分有較小的區(qū)別: 縊基蜈蚣藻1—3回羽狀分枝, 小枝對(duì)生、互生或偏生, 基部縊縮; 亞洲蜈蚣藻主枝為二叉分枝, 小枝為羽狀分枝, 小枝分布較稀疏(表 2)。由于同一種海藻的外部形態(tài)也因生態(tài)環(huán)境、海域及采集時(shí)間等不同而變異很大, 由此導(dǎo)致二者在外部形態(tài)上略有差異。

圖 8 亞洲蜈蚣藻的外部形態(tài)(A)和《中國(guó)海藻志》中縊基蜈蚣藻的模式標(biāo)本(B)Fig. 8 External morphology of G. asiatica Kawaguchi et Wang (A) and typical specimen of G. constricata Li et Ding in Flora Algarum Marinarum Sinicarum (B)

表 2 縊基蜈蚣藻和亞洲蜈蚣藻的形態(tài)比較Tab. 2 Comparison of morphological features between G. constricata and G. asiatic

本研究中詳細(xì)觀察并記錄了縊基蜈蚣藻孢子的早期發(fā)育及生活史?？O基蜈蚣藻的孢子發(fā)育類型為“間接盤狀體”型, 過(guò)程為: 在孢子逸出后, 萌發(fā)形成萌發(fā)管, 萌發(fā)管內(nèi)細(xì)胞發(fā)生分裂, 進(jìn)入盤狀體時(shí)期。該結(jié)果與亞洲蜈蚣藻孢子發(fā)育及生活史的研究結(jié)果一致[19]。近幾年的序列分析分別研究了不同基因序列在種內(nèi)的遺傳范圍, 為藻類學(xué)分類提供了直觀的證據(jù), 研究指出COⅠ基因序列分析種內(nèi)遺傳變異范圍為0.0—1.6%。李芳等[2]在帚狀蜈蚣藻的修訂研究中認(rèn)為rbcL基因序列在蜈蚣藻屬的種內(nèi)的遺傳變異范圍為0.0—1.0%?；贒NA分子分析結(jié)果顯示, 8個(gè)縊基蜈蚣藻樣本之間均無(wú)堿基差異, 它們與大連亞洲蜈蚣藻無(wú)堿基差異,與日本和韓國(guó)的亞洲蜈蚣藻的堿基差異屬于種內(nèi)差異, 因此認(rèn)為縊基蜈蚣藻與亞洲蜈蚣藻為同一種。

圖 8B為《中國(guó)海藻志》中縊基蜈蚣藻模式標(biāo)本, 李偉新等僅根據(jù)藻體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生殖結(jié)構(gòu)特征建立一個(gè)新種不具有說(shuō)服力。本研究通過(guò)對(duì)縊基蜈蚣藻外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察、早期發(fā)育及DNA分子分析的研究, 確定縊基蜈蚣藻與亞洲蜈蚣藻為同一種。根據(jù)優(yōu)先法則, 將縊基蜈蚣藻修訂為亞洲蜈蚣藻。本研究將為我國(guó)蜈蚣藻屬的分類修訂、物種多樣性及《中國(guó)海藻志》的再版提供新資料。