龔葭薇 何 梅 閆學(xué)春 孔德麟 梁 洋

(1. 東北林業(yè)大學(xué), 哈爾濱 150040; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所, 哈爾濱 150040)

魚類廣泛存在于自然界, 與人類生活息息相關(guān)。其中斑馬魚(Danio rerio)由于具有發(fā)育快、繁殖周期短、胚體透明、容易飼養(yǎng)及與人類基因組相似度高等特點已經(jīng)作為模式生物被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)等領(lǐng)域[1,2]。而鯉(Cyprinus carpioL.)是目前世界上養(yǎng)殖量最大的淡水魚類之一, 其肉質(zhì)具有高蛋白、低脂肪和人體必需氨基酸含量高等特點。既可以作為人類重要的食物來源, 也可以成為觀賞動物[3], 同時, 近年來鯉也逐漸成為免疫學(xué)、生態(tài)學(xué)、環(huán)境保護(hù)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和生物進(jìn)化等模式動物[4]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)與遺傳圖譜繪制的發(fā)展, 鯉的一些特性, 包括耐寒、體重和血糖含量等性狀已經(jīng)開始被廣泛研究[5], 但是迄今為止, 作為魚類重要經(jīng)濟(jì)性狀的骨骼肌形成分子生物學(xué)機制尚未被完全揭示。

microRNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的非編碼小RNA(長度約22 nt), 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。它們廣泛參與器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖分化及細(xì)胞凋亡等生理過程[6]。在模式動物小鼠和斑馬魚中發(fā)現(xiàn)了多種與肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNAs, 這些富含在心肌和骨骼肌組織中的miRNAs被稱為myomiRs, 其通過對各自靶基因的作用而協(xié)同參與肌肉的發(fā)生、分化和再生等過程[7]。在對禾花鯉和建鯉肌間骨miRNAs的研究中也發(fā)現(xiàn), miRNAs的表達(dá)水平控制成骨過程, 從而維持其肌間骨細(xì)小及柔軟的特性[8]。我們前期通過分析鯉肌肉特異性miRNAs也發(fā)現(xiàn), miR-1、miR-133、miR-206、miR-221、miR-222、miR-181和miR-208等在鯉肌肉發(fā)育中存在差異性表達(dá), 其中miR-1和miR-133在小鼠(Mus musculus)、雞(Gallus gallus)、爪蟾(Xenopus laevis)、斑馬魚和鯉等動物中高度保守[9]。在小鼠中, miR-1和miR-133以基因簇的形式存在, miR-1-1/133a-2位于2號染色體, 而miR-1-2/133a-1基因簇位于18號染色體[10,11]。Liu等[12]在小鼠中研究MEF2對miR-1-2和133a-1調(diào)控時發(fā)現(xiàn), 在小鼠體內(nèi), 編碼miR-1-2和miR-133a-1的基因之間存在一個330 bp的增強子片段, 受肌肉發(fā)育重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MEF2直接調(diào)控。而該區(qū)域約330 bp增強子結(jié)合位點包含一段保守的E-box(CANNTG), 可能是MyoD家族的結(jié)合位點。同時, 通過比較人、大鼠、狗和雞等物種, 表明這一序列對于心臟和骨骼肌的表達(dá)是必要的, 且在脊椎動物中具有高度保守性。據(jù)此, 我們推測在斑馬魚和鯉中miR-1-2和133a-1基因間序列存在類似增強子的調(diào)控序列[12]。

綜上, 本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上, 分析斑馬魚和鯉miR-1-2/133a-1的調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子, 克隆斑馬魚和鯉miR-1-2/133a-1的增強子序列, 探討在魚中miR-1-2/133a-1增強子序列調(diào)控機理; 并通過體外實驗進(jìn)一步分析MyoD對miR-1-2/133a-1的調(diào)控作用, 為完善哺乳動物肌肉發(fā)育機制研究, 及為魚類分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗用載體

Hsp68-lacZ載體系國外友人Dr. Alan Peterson惠贈, 熒光素酶報告載體pGL3-Basic(Promega)、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen)和克隆載體pGEM-T Easy (Promega) 從公司購買。

1.2 實驗動物與細(xì)胞

研究所用鯉魚卵及成體組織均來自中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗站。實驗用斑馬魚魚卵及成體組織系黑龍江水產(chǎn)研究所自繁, 實驗用細(xì)胞實驗室自存。

1.3 實驗方法

總RNA提取 取適量斑馬魚或鯉肌肉組織,液氮研磨, 加入Trizol裂解, 10000 r/min離心5min,取上清, 氯仿和異丙醇抽提, 然后以75%乙醇充分洗滌沉淀。適量無RNA酶的去離子水溶解沉淀, 檢測總RNA濃度和純度, 再利用PolyA聚合酶加尾, 利用接頭引物(Ambion)反轉(zhuǎn)錄成cDNA, ?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

載體構(gòu)建與鑒定(1)Hsp68-GFP報告載體的構(gòu)建: 利用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和HpaⅠ從pEGFP-N3質(zhì)粒上切下GFP片段, 與同樣雙酶切的Hsp68-LacZ載體進(jìn)行連接, 提取質(zhì)粒, 酶切并測序鑒定正確后–20℃保存?zhèn)溆谩?2)pGL3-Hsp68報告載體的構(gòu)建: 利用KpnⅠ和NcoⅠ從上述Hsp68-GFP質(zhì)粒上切下Hsp68片段, 定向插入同樣雙酶切的pGL3-Basic載體構(gòu)建pGL3-Hsp68報告載體, 提取質(zhì)粒, 酶切并測序鑒定正確后–20℃保存?zhèn)溆谩?3)斑馬魚Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68報告載體的構(gòu)建: 通過NCBI查找斑馬魚miR-1-2/133a-1基因間序列(本文中縮寫為dmi), 設(shè)計引物(表 1), 通過PCR以斑馬魚基因組DNA為模板克隆該片段, 測序正確后通過XhoⅠ和SmaⅠ雙酶切分別將其定向插入Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68報告載體, 提取質(zhì)粒, 酶切并測序鑒定正確后?20℃保存?zhèn)溆谩?4)鯉Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68報告載體的構(gòu)建: 通過NCBI查找鯉miR-1-2/133a-1基因間序列(本文中縮寫為cmi), 設(shè)計引物(表 1)通過PCR以鯉基因組DNA為模板克隆該片段, 測序正確后通過ApaⅠ和SmaⅠ雙酶切分別將其定向插入Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68報告載體, 提取質(zhì)粒, 酶切并測序鑒定后–20℃保存?zhèn)溆谩?5)斑馬魚和鯉系列突變載體的構(gòu)建: 通過限制性酶切(酶切位點見圖 1A)及PCR(引物序列見表 1)構(gòu)建不同長度的dmi缺失突變(示意圖見圖 1B), 并分別定向克隆入兩種報告載體。(6)鯉MyoD基因克隆和真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建: 設(shè)計鯉MyoD全長基因引物(表 1), 以肌肉cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增, 將產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接和轉(zhuǎn)化, 提取質(zhì)粒, 經(jīng)測序比對正確后將MyoD序列通過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切轉(zhuǎn)連至pcDNA3.1(+)載體,提取質(zhì)粒, 酶切并測序鑒定正確后?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

圖 1 斑馬魚miR-1-2/133a-1基因間序列酶切位點(A)和系列缺失突變體(B)示意圖Fig. 1 The schematic diagram of Danio rerio mir-1-2/133a-1 intergene sequence restriction site (A) and serial deletion mutant (B)

細(xì)胞復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)NIH 3T3與C2C12細(xì)胞從液氮中取出后置于37℃水浴中快速融化, 轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至15 mL離心管, 加入5倍體積預(yù)熱到37℃的合成培養(yǎng)基, 1000 r/min離心5min, 棄上清, 加入3 mL合成培養(yǎng)基, 溫和吹打使其混勻, 轉(zhuǎn)移到60 mm培養(yǎng)皿中, 置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng), 每天觀察細(xì)胞狀態(tài)。培養(yǎng)條件: 37℃、5%CO2和95%空氣。培養(yǎng)基配方: DMEM高糖培養(yǎng)基, 添加10%胎牛血清(ES-FBS, BI公司), 添加1%雙抗和1% GlutaMAX(100×)。當(dāng)復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時,按照常規(guī)方法, 將細(xì)胞進(jìn)行1∶3傳代培養(yǎng)。C2C12細(xì)胞的分化以2%馬血清誘導(dǎo)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于不含抗生素的培養(yǎng)基中, 細(xì)胞轉(zhuǎn)染密度60%—70%時匯合, 按照Lipofectamine 2000(Invitrogen)說明書程序轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

雙熒光素酶檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后棄去舊培養(yǎng)基, PBS輕輕洗滌細(xì)胞2—3次; 加入通用裂解液,水平搖床室溫?fù)u15min使細(xì)胞充分裂解; 10000r/min離心3min, 取10 μL細(xì)胞裂解液于1.5 mL EP管,加50 μL螢火蟲熒光素酶底物, 熒光光度儀測定螢火蟲熒光素酶的活性值F, 再加50 μL海腎熒光素酶底物, 檢海腎熒光素酶發(fā)光值R, 記錄F值、R值和比值。

魚卵顯微操作顯微操作采用日產(chǎn)IM-4A/B顯微注射器, 玻璃針用日產(chǎn)自由落體式拉針器(PP-83)拉成孔徑為6—8 μm的細(xì)尖。在?90 mm×18 mm平皿上, 鋪一層厚2—3 mm的瓊脂, 在其上挖一些與魚受精卵大小相似的圓孔, 選取質(zhì)量好的魚受精卵固定在孔中, 平皿置在解剖鏡下, 注射針以75度角進(jìn)入受精卵。每個受精卵注射質(zhì)粒體積為1 nL, 注射劑量為50—100 pg, 對照組注射生理鹽水。注射后的魚受精卵于28℃孵化。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚和鯉miR-1-2/133a-1基因間序列分析

通過NCBI分別獲取dmi和cmi序列信息后, 根據(jù)設(shè)計的特異性引物(表 1), 以各自的基因組DNA為模板分別克隆獲得2084和2242 bp目的片段,并進(jìn)行序列比對。同時人、小鼠、斑馬魚和鯉保守區(qū)域的序列比對結(jié)果顯示, 潛在的E-box元件(MyoD調(diào)控位點)在物種間高度保守。

2.2 斑馬魚和鯉基因間序列報告載體的構(gòu)建

為了探究斑馬魚和鯉miR-1-2/133a-1基因間序列增強子的調(diào)控作用, 首先通過酶切和連接等方法分別獲得Hsp68-GFP和pGL3-Hsp68基礎(chǔ)報告載體,并將dmi(2084 bp)和cmi(2242 bp)全長序列分別定向克隆入上述兩種報告載體。

隨后, 按照圖 1所示利用酶切及PCR獲得不同長度的dmi系列缺失突變序列, 并定向克隆入上述兩種報告載體中, 鑒定正確后進(jìn)行斑馬魚增強子活性分析。

2.3 斑馬魚miR-1-2/133a-1基因間序列增強子活性分析

活體實驗分析檢測增強子活性將上述構(gòu)建的dmi-Hsp68-GFP質(zhì)粒注射斑馬魚胚胎, 72h后觀察熒光, GFP呈現(xiàn)肌肉特異性表達(dá)(圖 2A)。進(jìn)一步將上述構(gòu)建的dmi-Hsp68-GFP系列缺失質(zhì)粒注射斑馬魚胚胎(按照從a到i的順序注入胚胎, a為對照),72h后觀察熒光, 缺失片段不同(圖 2B), GFP表達(dá)量也不同, 保留有保守區(qū)域(1116—1432間序列, 縮寫為cr)的載體(圖 2C中b、f和g), 胚胎GFP表達(dá)量明顯高于其他突變體(圖 2C中c、d、e、h和i)。

離體實驗分析增強子活性通過脂質(zhì)體法將上述pGL3-dmi-Hsp68系列質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞中, 并在分化前和分化后分別檢測相對熒光素酶活性(圖 3), 分化后的表達(dá)量均明顯高于分化前,由于其缺失片段不同而導(dǎo)致熒光素酶活性明顯不同, 保留有cr序列的b、f和g組, 在分化后熒光素酶活性顯著高于分化前。

2.4 鯉miR-1-2/133a-1基因間序列增強子活性分析

活體實驗分析基因間序列增強子活性無論活體實驗還是離體實驗, 上述結(jié)果都證明在斑馬魚中cr序列具有增強子活性, 因此推測在鯉中該區(qū)域有相似作用。將上述構(gòu)建的全長cmi-Hsp68-GFP載體質(zhì)粒注射鯉胚胎, 72h后觀察熒光, GFP同樣呈現(xiàn)肌肉特異性表達(dá)(圖 4)。

離體實驗分析基因間序列增強子活性通過脂質(zhì)體法將pGL3-cmi-Hsp68質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞中, 并在分化前和分化后分別檢測相對熒光素酶活性(圖 5), 分化后的表達(dá)量明顯高于分化前, 且cmi的表達(dá)變化大于dmi。

2.5 MyoD調(diào)控miR-1-2/133a-1基因間序列分析

以在NIH-3T3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pGL3-dmi-Hsp68(斑馬魚)、pGL3-cmi-Hsp68(鯉)和保守序列pGL3-cr-Hsp68質(zhì)粒作為對照, 以分別將上述3種質(zhì)粒與pcDNA-MyoD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染作為實驗組, 結(jié)果顯示,無論是斑馬魚還是鯉, 共轉(zhuǎn)染pcDNA-MyoD組熒光素酶活性明顯上調(diào), 說明無論在斑馬魚還是鯉中,miR-1-2/133a-1基因間及保守區(qū)(cr)序列活性均受MyoD調(diào)控(圖 6)。

3 討論

魚類肌肉發(fā)育與脊椎動物類似, 由多核肌纖維組成, 胚胎期經(jīng)歷了復(fù)雜的肌肉發(fā)生過程, 才發(fā)育為不同類型的肌肉[13]。成體骨骼肌有再生潛力, 依靠位于肌肉肌纖維膜和基底膜之間的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞, 在正常條件下衛(wèi)星細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài), 在生理刺激下, 靜止的衛(wèi)星細(xì)胞才被激活, 然后增殖、遷移、分化, 融合形成新的多核肌纖維[14]。同時,激活的一部分衛(wèi)星細(xì)胞返回靜止?fàn)顟B(tài), 通過自我更新補充干細(xì)胞庫。目前大量證據(jù)表明非編碼RNA,包括miRNA、長非編碼RNA(lncRNA)和圓形RNA(環(huán)RNA), 也廣泛參與衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖、自我更新等重要的肌發(fā)生過程[15]。

圖 2 dmi-Hsp68-GFP及突變質(zhì)粒注射斑馬魚胚胎Fig. 2 Danio rerio embryo injected with dmi-Hsp68-GFP and mutated plasmid

圖 3 pGL3-dmi-Hsp68系列質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12熒光素酶活性分析Fig. 3 Luciferase activity analysis of pGL3-dmi-Hsp68 series plasmids transfected with C2C12

圖 4 cmi-Hsp68-GFP質(zhì)粒注射鯉胚胎后熒光分析Fig. 4 Fluorescence analysis of cmi-Hsp68-GFP after injection into carp embryos

圖 5 pGL3-cmi-Hsp68質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C2C12熒光素酶活性分析Fig. 5 Luciferase activity analysis by transfection of C2C12 with pGL3-cmi-Hsp68 plasmid

圖 6 MyoD調(diào)控miR-1-2/133a-1基因間序列活性分析Fig. 6 Activity analysis of the intergene sequence of miR-1-2/133a-1 regulated by MyoD

3.1 斑馬魚和鯉中miR-1-2和miR-133a-1之間存在增強子序列

在模式動物小鼠和斑馬魚中, 與肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA被稱為myomiRs, 這些myomiRs通過對各自靶基因的作用而協(xié)同參與肌肉的發(fā)生、分化和再生等過程。我們前期通過分析鯉肌肉特異miRNAs發(fā)現(xiàn), miR-1和miR-133在小鼠、雞、爪蟾、斑馬魚和鯉等動物中高度保守[9]。

已經(jīng)有研究顯示, 在小鼠中編碼miR-1-2和miR-133a-1的基因之間存在一個330 bp的增強子片段, 受肌肉發(fā)育重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MEF2直接調(diào)控,該增強子具有肌肉特異性[12]。通過比較人、大鼠、狗和雞等物種, 表明這一序列對于心臟和骨骼肌的表達(dá)是必要的, 且在脊椎動物中具有高度保守性[12]。據(jù)此, 我們分析斑馬魚和鯉序列信息, 結(jié)果顯示, 在斑馬魚和鯉miR-1-2和miR-133a-1基因間也存在一段保守序列, 且包含E-box元件。進(jìn)一步分析其是否具有肌肉特異性的增強子活性, 我們選擇了Hsp68為啟動子。熱休克蛋白Hsp68是一個基礎(chǔ)啟動子, 正常情況下的轉(zhuǎn)基因胚胎中檢測不到啟動子活性, 在受到熱激或者外源增強子誘導(dǎo)情況下被激活[16,17]。因此, 在本實驗中, Hsp68作為報告載體的啟動子, 正常情況下幾乎檢測不到啟動子后面GFP的表達(dá), 而在Hsp68啟動子前加入dmi或cmi的miR-1-2和133a-1的基因間序列后, 則顯示GFP表達(dá)升高(圖 2和圖 4), 因此證明miR-1-2/133a-1基因間序列確實具有增強子活性。

無論在斑馬魚還是鯉中, miR-1-2/133a-1基因間序列的增強子活性, 以及MyoD對該序列的調(diào)控作用尚未見到相關(guān)報道。

3.2 增強子活性與保守序列相關(guān)且具有肌肉特異性

進(jìn)一步分析顯示, 這種增強子活性強弱與保守區(qū)域cr有關(guān), 在斑馬魚體內(nèi)利用dmi-Hsp68-GFP系列質(zhì)粒注射胚胎72h后, GFP呈現(xiàn)肌肉特異性表達(dá)。缺失片段不同, 表達(dá)量也不同, 保留有cr(含有E-box)序列的質(zhì)粒注射胚胎后, GFP表達(dá)量明顯高于其他突變體(圖 2), 說明miR-1-2/133a-1基因內(nèi)增強子中的E-box對于骨骼肌的表達(dá)是必要的。

另外, 體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗結(jié)果顯示, 在小鼠C2C12細(xì)胞中, 分化后的表達(dá)量均明顯高于分化前, 且其缺失片段不同其熒光素酶活性明顯不同,保留有cr的序列在分化后熒光素酶活性顯著高于分化前(圖 4和圖 5)。關(guān)于實驗中觀察到無論分化前后熒光素酶活性均有不同程度升高現(xiàn)象, 推測由于3′端的部分片段在肌肉分化前具有抑制子活性, 這種抑制作用在分化中解除, 因此表現(xiàn)為分化后所有熒光素酶活性升高。而具有保守cr序列的熒光素酶活性顯著高于其他實驗組, 進(jìn)一步說明miR-1-2和133a-1基因間序列的增強子活性具有肌肉特異性。

3.3 斑馬魚和鯉中miR-1-2和133a-1增強子序列受到MyoD調(diào)控

根據(jù)已經(jīng)有報道, 小鼠中miR-1-2和miR-133a-1基因之間330 bp增強子區(qū)域包含一段保守的E-box(CANNTG), 可能是MyoD家族的結(jié)合位點[12]。Rao等[18]發(fā)現(xiàn), 在小鼠C2C12細(xì)胞和人類成肌細(xì)胞分化過程中, miR-1-2和miR-133a-1被明顯誘導(dǎo)表達(dá), 通過ChIP實驗證明, MyoD能夠結(jié)合在miR-1-1/133a-2和miR-1-2/133a-1上游頸環(huán)區(qū)域, 提示在小鼠中該區(qū)域受到MyoD的調(diào)控。Liu等[12]在小鼠中也發(fā)現(xiàn)MEF2能調(diào)控miR-1-2/133a-1上游肌肉特異的增強子, 該區(qū)域約330 bp增強子區(qū)域包含一段保守的E-box (CANNTG), 正是MyoD家族的結(jié)合位點。據(jù)此, 分析斑馬魚和鯉序列信息, 也發(fā)現(xiàn)在miR-1-2和miR-133a-1基因間保守序列之間存在類似的E-box元件。

將cmi-Hsp68-GFP質(zhì)粒注射鯉胚胎, 72h后觀察熒光, GFP呈現(xiàn)明顯肌肉特異性表達(dá), 主要表現(xiàn)在生肌節(jié)部位, 與MyoD的表達(dá)相似(圖 4)。進(jìn)一步通過熒光素酶實驗證明, 無論是斑馬魚還是鯉, miR-1-2/133a-1基因間及保守區(qū)(cr)序列活性均受MyoD調(diào)控(圖 6)。

綜上, 本研究發(fā)現(xiàn)無論在斑馬魚或者鯉中,miR-1-2/133a-1基因間序列確實存在可能與MyoD結(jié)合的E-box元件(CANNTG), 通過體內(nèi)外實驗驗證了該區(qū)域的增強子活性, 并通過熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了MyoD對該序列具有調(diào)控作用, 從而暗示在魚類中, miR-1-2和miR-133-a-1可能也是MyoD的下游基因。該研究為探明MyoD與2種重要的myomiRs(miR-1和miR-133)之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系, 完善脊椎動物肌肉發(fā)育調(diào)控機理, 及為鯉分子育種等打下基礎(chǔ)。