呂俊平 折雨亭 劉 洋 劉旭東 馮 佳 謝樹蓮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006)

作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分, 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)為世界各地人口提供了重要的食物來源。餌料投放是水產(chǎn)養(yǎng)殖最為基礎(chǔ)且關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。然而, 餌料中只有大約9%和17%的氮磷被魚類吸收[1], 其余未被吸收的部分進(jìn)入水體。此外, 魚類的排泄物也富含氮磷。因此, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中餌料的投放及魚類排泄均會(huì)向養(yǎng)殖水體輸入大量氮磷, 對水體造成嚴(yán)重污染[2,3]。

對于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理, 傳統(tǒng)方法包括物理法和化學(xué)法。其中, 物理法對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中懸浮顆粒物質(zhì)(例如, 殘餌和魚類排泄物)有較佳的去除效果, 但是難以去除氮磷等溶解性污染物[4]?；瘜W(xué)法具有較好的處理效果, 然而由于處理成本高且易對水質(zhì)造成危害, 因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖中難以大規(guī)模推廣應(yīng)用[5]。

作為水生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級(jí)生產(chǎn)者, 藻類在水環(huán)境治理方面發(fā)揮著重要作用[6]。運(yùn)用微藻處理廢水, 一方面可以凈化廢水, 另一方面可獲得高附加值產(chǎn)品[6,7]。藻類能夠高效地去除廢水中氮磷等污染物, 同時(shí)處理工藝的建設(shè)和運(yùn)行成本較低、維護(hù)簡單, 因而受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[8]。張繼平等[9]發(fā)現(xiàn)小球藻能顯著降低南美白對蝦養(yǎng)殖廢水中亞硝氮的含量。王榮霞等[10]研究了羽毛藻對石斑魚養(yǎng)殖廢水中氮和磷的吸收特性。顯然, 藻類處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水是可行的。然而, 已有的報(bào)道更多的關(guān)注光照強(qiáng)度、光質(zhì)和碳氮比等因子對微藻處理污水效果的影響。相比較而言, 起始接種濃度對微藻處理污水效果的影響較少被關(guān)注。

綠藻門的藻種是污水處理優(yōu)質(zhì)藻種的重要來源之一[11]。本課題組前期篩選獲得一株綠球藻(Chlorococcum sphacosumGD)被證實(shí)可用于市政污水和牛場污水等的處理[12]。然而, 該藻株對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水凈化效果如何還不清楚。因此, 本研究以該藻株為材料, 通過設(shè)置藻液的起始接種濃度, 測定藻體生長狀況和水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中污染物的降解情況, 為選取適宜的接種濃度和評價(jià)微藻處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的能力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

藻種來源本研究所用藻種為綠球藻(Chlorococcum sphacosumGD), 從山西省關(guān)帝山八水溝風(fēng)景區(qū)落葉松林下的苔蘚中分離純化獲得[13]。BG11培養(yǎng)基用于該藻種的擴(kuò)大培養(yǎng)。

水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水取自山西省太原市魚種場。為了去除廢水中較大的懸浮顆粒物, 降低其對微藻培養(yǎng)的影響, 在使用之前將廢水靜置1h后取上清使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

藻種預(yù)培養(yǎng)綠球藻接種至裝有BG11培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中, 然后置于光照培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為: 光照強(qiáng)度3000 lx, 光暗比12h∶12h,溫度25℃, 靜置培養(yǎng), 每天早中晚手動(dòng)各搖動(dòng)1次,使藻細(xì)胞呈均勻懸浮狀態(tài), 至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

藻種接種及培養(yǎng)取處于對數(shù)生長期的綠球藻培養(yǎng)液離心后(5000 r/min, 5min)接種至含有500 mL水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的錐形瓶中, 設(shè)置6個(gè)接種濃度梯度: 0、25、50、100、200和400 mg/L。其中,0為對照組, 25—400 mg/L為實(shí)驗(yàn)組, 每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行組。然后, 將錐形瓶至于搖床上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為: 光照強(qiáng)度3000 lx, 光暗比12h∶12h,溫度25℃, 搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。在培養(yǎng)周期內(nèi), 每天取樣用于相關(guān)指標(biāo)的測試分析。

微藻生物質(zhì)濃度測定采用干重法測定微藻生物質(zhì)濃度[14]。利用公式(1)和(2)分別計(jì)算微藻的比生長速率和倍增時(shí)間:

式中,T為培養(yǎng)時(shí)間(d),NT2、NT1為第T2天和T1天的微藻生物質(zhì)濃度(mg/L),μ為微藻的比生長速率(/d),Td為倍增時(shí)間(d)。

水質(zhì)參數(shù)的測定采用納氏試劑光度法(GB 7479-87)測定氨氮含量, 采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法(GB 7493-87)測定亞硝氮含量, 采用紫外分光光度法(HJ/T 346-2007)測定硝氮含量, 采用鉬銻抗分光光度法(GB 11893-89)測定磷含量, 采用重鉻酸鹽法(GB 11914-89)測定COD。

葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定參照Mera等[15]的方法測定葉綠素含量。藻液離心(4500 r/min, 15min)后棄清液, 于沉淀中加入95%乙醇并混勻。然后, 將樣品于黑暗條件下4℃放置24h, 然后離心獲得上清液(8000 r/min, 10min)。于649和665 nm波長下, 采用紫外可見光分光光度計(jì)(TU-1810 DAPC,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司, 中國)測定上清液的吸光度值, 用95%乙醇溶液作為空白對照。利用公式(3)和(4)分別計(jì)算葉綠素a和葉綠素b含量:

參照Markou等[16]的方法測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。取藻液3 mL于黑暗條件下處理30min, 然后于避光條件下采用手持式葉綠素?zé)晒鉁y量儀(捷克,AquaPen-C AC100)獲取Fv/Fm和Fv/Fo值。

數(shù)據(jù)處理測量值采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3)。在0.05的置信水平下, 采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析, 比較各處理組間生長指標(biāo)的差異。采用SPSS 19.0中的相關(guān)性分析模塊來研究不同初始接種濃度與生長指標(biāo)間的關(guān)系, 同時(shí)建立相應(yīng)的回歸方程,P＜0.05時(shí)呈顯著相關(guān)。利用Origin 8.5做圖。

2 結(jié)果

2.1 不同起始接種濃度下綠球藻的生長特性

如圖 1所示, 綠球藻的生長未出現(xiàn)遲滯, 表明不同接種濃度下該藻株均能適應(yīng)水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水。經(jīng)過5d的培養(yǎng), 綠球藻各實(shí)驗(yàn)組的生物質(zhì)濃度分別增加至135、180、255、320和500 mg/L, 分別較初始接種時(shí)增加了1.42、1.5、1.5、1.19和1.06倍。相比于高起始接種濃度(200—400 mg/L), 較低起始接種濃度(25—100 mg/L)下綠球藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中生物量積累速度較快。此外, 我們分析了該藻株的生長速率和倍增時(shí)間(表 1)。當(dāng)起始接種濃度由25 mg/L增加至100 mg/L時(shí), 綠球藻的比生長速率由0.087/d增加至0.1/d, 倍增時(shí)間由7.89d下降至6.84d。繼續(xù)增加接種濃度至400 mg/L后, 綠球藻的比生長速率降低至0.015/d, 倍增時(shí)間上升至44.8d。回歸分析結(jié)果顯示, 微藻的初始接種濃度與比生長速率呈顯著負(fù)相關(guān)(r=?0.927,P＜0.05, 圖 2a), 與倍增時(shí)間均呈極顯著正相關(guān)(r=0.965,P＜0.01, 圖 2b),說明隨著初始接種濃度的增加, 比生長速率降低,倍增時(shí)逐漸增加, 較低的起始接種濃度有利于綠球藻的生長。

圖 1 不同起始接種濃度下綠球藻的生長特征Fig. 1 The biomass concentration of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

表 1 不同起始接種濃度下綠球藻的比生長速率和倍增時(shí)間(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab. 1 The specific growth rate and doubling time of C.sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater (Mean±SEM, n=3)

2.2 不同起始接種濃度下綠球藻的污染物降解特性

在本研究中, 用于處理的魚種場來源污水中COD、氨氮、亞硝氮、硝氮和總磷濃度分別的32.4、6.25、24.65、0.35和1.83 mg/L。將不同濃度綠球藻接種于污水后, 經(jīng)過3d培養(yǎng), 污染物濃度均大幅度降低(圖 3)。其中, 接種濃度為100 mg/L時(shí),污染物去除效率最高, COD、氨氮、亞硝氮、硝氮和總磷的去除率分別為88.89%、94.08%、97.44%、82.86%和 91.8%。在培養(yǎng)結(jié)束后(第5天), 不同接種濃度下的綠球藻對COD的去除率為87.69%—96.92%,氨氮的去除率為65.6%—98.08%, 亞硝氮的去除率為59.28%—98.67%, 硝氮的去除率為57.14%—91.42%, 總磷的去除率為78.14%—98.36%(表 2)。盡管不同接種濃度下污染物濃度均呈下降趨勢, 但是污染物最終去除效率對起始接種濃度呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)。起始接種濃度為100 mg/L時(shí), 綠球藻對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中COD、氨氮、亞硝氮、硝氮和總磷的去除效果要顯著優(yōu)于其他接種濃度下綠球藻的去除效果(P＜0.05, 表 2)。

2.3 不同起始接種濃度對綠球藻的葉綠素含量及葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊?/h3>

如圖 4所示, 在培養(yǎng)周期結(jié)束后, 綠球藻的葉綠素a濃度分別從0.48、0.98、1.98、3.75和6.28 mg/L增加至1.13、2.31、2.63、4.2和7.59 mg/L。葉綠素b濃度在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)上升至0.26、0.7、0.88、1.59和3.17 mg/L。顯然, 綠球藻細(xì)胞葉綠素含量隨著接種濃度的增加而逐漸升高。

此外, 我們也分析了這葉綠素?zé)晒鈪?shù)對起始接種生物質(zhì)濃度的響應(yīng)。如圖 5所示, 在所有接種濃度下, 綠球藻的葉綠素?zé)晒饣钚暂^好。經(jīng)過5d的培養(yǎng), 綠球藻各實(shí)驗(yàn)組的Fv/Fm值維持在0.53—0.78,較初始接種時(shí)輕微的增長。而且, 在本研究的接種濃度范圍內(nèi), 高接種濃度下綠球藻的葉綠素?zé)晒饣钚暂^好。Fv/Fo的變化趨勢類似于Fv/Fm。

圖 2 綠球藻的接種濃度與生長特性的相關(guān)分析Fig. 2 The regression analysis between initial inoculation concentration and growth characteristics of C. sphacosum GD

3 討論

通過培養(yǎng)微藻的方式處理廢水是水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理的一種可供選擇的方案。前人的一些研究工作發(fā)現(xiàn)微藻處理養(yǎng)殖廢水時(shí)展現(xiàn)出了優(yōu)秀的性能[17,18]。在本研究中, 不論綠球藻的起始接種濃度如何變化, 綠球藻的生長均未出現(xiàn)遲滯, 表明該藻株能夠適應(yīng)水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水, 具有良好的生長狀況。盡管如此, 當(dāng)起始接種濃度為25—100 mg/L時(shí), 綠球藻的比生長速率為0.087—0.1/d。然而, 起始接種濃度上升至400 mg/L后, 比生長速率降低至0.015/d。Guerrero-Cabrera等[19]的研究發(fā)現(xiàn), 小球藻、柵藻和單針藻在羅非魚養(yǎng)殖廢水中的比生長速率為0.006—0.018/d, 其低于本研究中低接種濃度下綠球藻的比生長速率, 但是和高接種濃度下綠球藻的比生長速率處于同一水平。王偉偉等[20]的研究發(fā)現(xiàn), 湛江等邊金藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中的比生長速率達(dá)到0.235/d, 其顯著高于本研究中所有接種濃度下綠球藻的比生長速率。上述這些差異可能源自于藻種及培養(yǎng)條件等的不同[19,20]。更為重要的是, 我們的研究結(jié)果表明, 起始接種濃度影響了綠球藻的生長。Pelizer等[21]研究發(fā)現(xiàn), 以低接種濃度(50 mg/L)培養(yǎng)螺旋藻時(shí)其生長速度最快。Nasir等[22]的研究表明, 相較于40%、50%和60%的起始接種濃度, 以10%、20%和30%的起始接種量培養(yǎng)的小球藻具有更高的生長潛力。顯然, 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果基本一致。由于本研究采用批次模式培養(yǎng)綠球藻, 因此在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)廢水中的營養(yǎng)物是有限的。當(dāng)微藻起始接種濃度超過一定的閾值后, 由于藻濃度過高導(dǎo)致藻細(xì)胞之間潛在的營養(yǎng)競爭加劇, 這可能是高接種濃度抑制微藻異養(yǎng)生長的一個(gè)重要原因[23]。為了使綠球藻在養(yǎng)殖廢水中達(dá)到一個(gè)較好的生長狀態(tài), 在本研究的培養(yǎng)條件下,建議以低起始接種濃度(100 mg/L)接種綠球藻用于該藻株的培養(yǎng)。

圖 3 不同接種濃度下綠球藻去除污染物的特征Fig. 3 Pollutants removal of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

表 2 不同接種濃度對綠球藻去除污染物效率的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab. 2 The performance on pollutants removal efficiency of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations(Mean±SEM, n=3)

圖 4 不同起始接種濃度下綠球藻的葉綠素含量Fig. 4 Chlorophyll concentration of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

圖 5 不同起始接種濃度下綠球藻的葉綠素?zé)晒馓卣鳒y定Fig. 5 Chlorophyll fluorescence characteristics of C. sphacosum GD with different initial inoculation concentrations in aquaculture wastewater

微藻處理水產(chǎn)養(yǎng)殖污水的效率是本研究的一個(gè)重要關(guān)注點(diǎn)。有關(guān)微藻處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的相關(guān)研究已有報(bào)道。陳春云等[24]的研究結(jié)果顯示, 小球藻能夠去除對蝦養(yǎng)殖廢水中80%的氨氮和85%的磷。栗越妍等[25]選用蛋白核小球藻、斜生柵藻、月牙藻和螺旋魚腥藻處理羅非魚養(yǎng)殖廢水。這些藻種能夠去除廢水中30.2%—60.9%的氮和22.7%—76.1%的磷。許云等[26]選用雙眉藻和等鞭金藻處理幼蝦養(yǎng)殖廢水, 其對廢水中總磷的去除率為30.9%和70.9%, 對硝氮的去除率為72%和85.7%。馬紅芳等[27]的報(bào)道稱, 柵藻能夠去除養(yǎng)魚場換排廢水中85.8%的硝氮、96.3%的亞硝氮、95.5%的氨氮和98.8%的磷。在本研究培養(yǎng)結(jié)束后, 不同接種濃度下的綠球藻對 COD的去除率為87.69%—96.92%,氨氮的去除率為65.6%—98.08%, 亞硝氮的去除率為59.28%—98.67%, 硝氮的去除率為57.14%—91.42%, 總磷的去除率為78.14%—98.36%。很明顯, 綠球藻處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的效率持平甚至優(yōu)于前人報(bào)道中相關(guān)藻種處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的效率, 表明本研究所選用的藻種可以作為一個(gè)具有潛力的藻種可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理。此外, 本研究發(fā)現(xiàn)起始接種濃度為100 mg/L時(shí), 綠球藻對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中污染物的去除效果要優(yōu)于其他接種濃度下綠球藻的處理效果?？紤]到該接種濃度下綠球藻生長良好, 大量污染物被該藻種同化后用于生物質(zhì)的積累。一般而言, 由于微藻生長速度緩慢, 需要保持較長的水力停留時(shí)間(大于10d)以降解養(yǎng)殖廢水中的大部分污染物[18,28]。在本研究中, 通過控制接種初始濃度, 在提高污染物去除率的同時(shí)縮短培養(yǎng)周期并提高了容積負(fù)荷, 這對于今后微藻用于大規(guī)模水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理是有益的。在本研究中,當(dāng)綠球藻接種濃度為25—50 mg/L時(shí), 該藻株的生長速率與100 mg/L接種濃度下該藻株的生長速率基本一致。盡管如此, 過低的接種濃度使得參與污水處理過程的藻細(xì)胞基數(shù)低, 從而使其去除污染物的效率低于100 mg/L接種濃度下該藻株去除污染物的效率?；谏鲜鲇懻? 為了使綠球藻高效去除污染物, 在本研究的培養(yǎng)條件下, 建議以低起始接種濃度(100 mg/L)接種綠球藻用于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理。

在微藻處理廢水過程中, 葉綠素含量和熒光參數(shù)特征能在一定程度上反映微藻細(xì)胞的生理活性狀況[29]。在本研究中, 在不同起始接種濃度下, 培養(yǎng)周期結(jié)束后, 綠球藻的葉綠素含量均顯著增長,而且葉綠素?zé)晒鈪?shù)值也保持在較高的水平。Fv/Fo與Fv/Fm分別反映了光系統(tǒng) Ⅱ的潛在活性和原初光能轉(zhuǎn)化效率[30]。因此, 在綠球藻處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的過程中, 藻細(xì)胞具有良好的生理活性, 這也從一個(gè)側(cè)面證明了該藻種可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理。

4 結(jié)論

微藻起始接種生物質(zhì)濃度是影響綠球藻生長及水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理效率的一個(gè)重要因子。在本研究的培養(yǎng)條件下, 隨著綠球藻初始接種濃度的上升, 其生長能力及污染物去除效率均有所降低。以低起始接種濃度(100 mg/L)接種綠球藻至水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中, 在5d的培養(yǎng)周期內(nèi), 其能夠高效去除廢水中的COD、氨氮、亞硝氮、硝氮及總磷等污染物。控制微藻接種濃度在提高污染物去除率的同時(shí)縮短培養(yǎng)周期并提高了容積負(fù)荷, 這對于今后微藻用于大規(guī)模水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的處理非常有益。