郝 凱 劉洪巖 陳校輝 袁軍法 李莉娟 邊文冀 趙 哲

(1. 河海大學(xué)海洋學(xué)院, 南京 210098; 2. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所, 南京 210017; 3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070)

斑點叉尾鮰(Letalurus punetaus), 原產(chǎn)于北美,是一種溫水性的淡水養(yǎng)殖魚類, 1984年引入中國后,養(yǎng)殖面積和總產(chǎn)量不斷增加, 目前已在我國20多個省份養(yǎng)殖, 2016年總產(chǎn)量達28.5×107kg, 我國已經(jīng)成為世界最主要的斑點叉尾鮰養(yǎng)殖國家之一[1]。斑點叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒, 又稱鮰皰疹病毒Ⅰ型(Ictalurid herpesvirus Ⅰ), 該病毒是魚類異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)中重要的一員, 能夠?qū)Π唿c叉尾鮰魚苗和魚種造成致死性感染[2—4]。隨著斑點叉尾鮰養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大, 集約化程度日益提高,養(yǎng)殖環(huán)境惡化, 斑點叉尾鮰病害日趨嚴重, 特別是由斑點叉尾鮰病毒(CCV)引起的斑點叉尾鮰皰疹病毒病(Channel catfish virus disease, CCVD)危害最大[5,6], 給斑點叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。但是, 目前對其所引起疾病尚無有效的治療方法, 因此加強對該病早起快速的診斷和篩查, 防止該病在我國的發(fā)生、傳播和大規(guī)模流行十分必要。

目前, 參照世界動物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動物疫病診斷手冊》及我國的出入境檢驗檢疫行業(yè)標準, CCVD的確診是基于細胞培養(yǎng)的病毒分離，然后用中和試驗、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)或PCR鑒定[7—9]。以上方法雖然準確可靠,在實驗室檢測中廣泛應(yīng)用, 但這些方法存在操作相對復(fù)雜、檢測成本高及對檢測人員較高的技術(shù)要求等問題, 限制了它們在斑點叉尾鮰養(yǎng)殖現(xiàn)場推廣使用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP)是一種新型核酸擴增技術(shù), 該技術(shù)在保持傳統(tǒng)PCR技術(shù)優(yōu)點的基礎(chǔ)上, 進一步增強了反應(yīng)的特異性和縮短了檢測時間[10];由于LAMP反應(yīng)具有簡單、快速、高效和經(jīng)濟等特點, 已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的現(xiàn)場化檢測[11,12]。對于應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測CCV, 2015年Liu等[13]的實驗室報道了利用凝膠電泳建立了CCV的LAMP檢測方法。本研究以CCV磷酸激酶蛋白編碼基因ORF77為檢測靶標設(shè)計特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物, 通過實時熒光PCR對CCV進行檢測, 建立一種用于CCV快速檢測的實時熒光LAMP方法。

1 材料與方法

1.1 材料

CCV感染陽性斑點叉尾鮰樣品由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所提供, 于–80℃保存。白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、錦鯉皰疹病毒(Kio herpesvirus, KHV)、真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)和新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)的基因組DNA由河海大學(xué)大學(xué)海洋科學(xué)實驗中心保存。

1.2 方法

LAMP引物設(shè)計: 參照CCV基因組及相關(guān)文獻資料, 以病毒磷酸激酶蛋白編碼基因ORF77保守區(qū)域為檢測靶位點, 利用在線軟件Primer Explorer version4(http://primerexplorer.jp/e)設(shè)計6條LAMP引物(表 1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

基因組DNA提取: 取CCV感染陽性斑點叉尾鮰的腎臟組織材料置于滅菌后的研缽中, 加入液氮研磨后, 將樣品轉(zhuǎn)入含有500 μL PBS無菌離心管中,然后12000 r/min離心5min收集上清用于DNA提取。DNA提取利用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒進行(TIANGEN, 北京), 具體操作步驟參照試劑盒提供的說明書進行。使用微量紫外分光光度計對提取的DNA進行濃度測定。

表 1 CCV ORF77實時熒光LAMP擴增引物序列Tab. 1 Primers used for real-time LAMP targeted on ORF77 gene of CCV

重組質(zhì)粒的構(gòu)建: 以上述提取的CCV感染陽性DNA為模板, 使用CCV-F3和CCV-B3進行PCR反應(yīng), 回收擴增片段與pMD18-T載體連接, 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞, 構(gòu)建含有ORF77目的片段的pMD18-T-ORF77重組質(zhì)粒。用微量紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度, 計算質(zhì)?？截悢?shù)。

實時熒光LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件: 25 μL的反應(yīng)體系包括: CCV-F3 0.2 μmol/L、CCV-B3 0.2 μmol/L、CCV-FIP 1.6 μmol/L、CCV-BIP 1.6 μmol/L、CCV-LF 0.8 μmol/L和CCV-LB 0.8 μmol/L,LAMP反應(yīng)液(10 mmol/L dNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液和150 mmol/L MgSO4, 三者的體積比為8∶5∶2)12.5 μL, Bst DNA聚合酶10U, 10×SYTO-9 0.5 μL, DNA模板 1—100 ng, ddH2O補齊到25 μL。

實時熒光LAMP反應(yīng)條件: 63℃ 1min, 共45個循環(huán)。利用LightCycler96熒光定量PCR儀(Roche公司)收集熒光信號。

實時熒光LAMP檢測的靈敏度試驗: 將構(gòu)建和制備的pMD18-T-ORF77質(zhì)粒進行8個梯度稀釋(108、107、106、105、104、103、102和101copies/μL),每個稀釋度樣品取1 μL作為模板, 進行實時熒光LAMP檢測的靈敏度試驗。

實時熒光LAMP檢測的特異性試驗: 以白斑綜合癥病毒(WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)和新加坡石斑魚虹彩病毒(SGIV)的基因組DNA為檢測模板進行實時熒光LAMP擴增, 對本研究建立的CCV實時熒光LAMP檢測方法的特異性進行測試。

實時熒光LAMP檢測的重復(fù)性試驗: 將構(gòu)建和制備的pMD18-T-ORF77質(zhì)粒進行2個梯度稀釋, 其濃度分別為105和102copies/μL, 每個稀釋度樣品取1 μL作為模板, 不同稀釋度樣品進行20次重復(fù), 對實時熒光LAMP檢測的重復(fù)性進行測試。

實際樣品檢測: 用所建立的實時熒光LAMP檢測方法對病毒感染的斑點叉尾鮰腎臟組織樣品進行檢測, 評價建立的實時熒光LAMP檢測方法的實際應(yīng)用性。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光LAMP檢測CCV的靈敏度

將實時熒光LAMP擴增靶位點克隆到pMD18-T載體中, 構(gòu)建pMD18-T-ORF77質(zhì)粒, 使用微量紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度, 計算質(zhì)?？截悢?shù), 并將質(zhì)粒稀釋到108、107、106、105、104、103、102和101copies/μL, 分別以此為模板進行實時熒光LAMP擴增, 在反應(yīng)大約12min后出現(xiàn)明顯的峰值,隨著擴增模板的稀釋濃度的降低, 出峰時間逐漸延后, 最低能檢測到的質(zhì)粒濃度為102copies/μL, 最晚出峰時間大約在35min(圖 1)。

圖 1 實時熒光LAMP檢測靈敏性Fig. 1 Sensitivity of real-time fluorescent LAMP

2.2 實時熒光LAMP檢測CCV的特異性

分別以斑點叉尾鮰皰疹病毒(CCV)、白斑綜合癥病毒(WSSV)、傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、真鯛虹彩病毒(RSIV)、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)和新加坡石斑魚虹彩病毒(SGIV)的基因組DNA為LAMP檢測模板, 進行實時熒光LAMP擴增, 檢測本研究建立的CCV實時熒光LAMP檢測方法的特異性。結(jié)果顯示本研究建立的實時熒光LAMP檢測方法只對CCV陽性基因組出現(xiàn)明顯的“S”形擴增曲線, 但對其他6種水生動物病毒DNA均為陰性反應(yīng)(圖 2)。

圖 2 實時熒光LAMP檢測特異性Fig. 2 Specificity of real-time fluorescent LAMP

2.3 實時熒光LAMP檢測CCV的重復(fù)性

將構(gòu)建的pMD18-T-ORF77質(zhì)粒稀釋到105和102copies/μL, 分別以此為模板進行實時熒光LAMP擴增, 結(jié)果如圖 3所示, 在同一次實驗內(nèi), 同一質(zhì)粒濃度下, 20個平行樣品的擴增曲線基本重合, 分別在反應(yīng)大約20min和35min出現(xiàn)明顯的峰值。

圖 3 實時熒光LAMP檢測重復(fù)性Fig. 3 Repeatability of real-time fluorescent LAMP

2.4 實際樣品檢測結(jié)果

通過對待檢實際樣品腎臟組織檢測結(jié)果顯示(圖 4), 本研究建立的實時熒光LAMP方法對CCV感染的實際樣品基因組出現(xiàn)明顯的“S”形擴增曲線,對產(chǎn)物進行擴增測序, 顯示本研究建立的實時熒光LAMP方法外引物擴增出的產(chǎn)物為靶基因目的片段。

圖 4 實際樣品實時熒光LAMP檢測Fig. 4 Actual samples detection of real-time fluorescent LAMP

3 討論

由斑點叉尾鮰病毒引起的斑點叉尾鮰皰疹病毒病傳染快, 魚苗、魚種死亡率可達90%以上。目前對本病尚無有效的藥物治療, 因此加強斑點叉尾鮰苗種和成魚類檢疫對防止該病大規(guī)模爆發(fā)具有重要意義。PCR方法能對病原微生物的靶基因進行特異性擴增, 因而是對病原物感染進行早期診斷的重要手段之一。目前已有以實時熒光定量PCR技術(shù)為依托的CCV檢測方法的報道, 因其靈敏度高、特異性好等優(yōu)點, 在病原體定性及定量檢測等方面有著廣泛的應(yīng)用前景[14]。但熒光定量PCR存在檢測耗時、操作相對復(fù)雜及依賴PCR儀等問題,造成其難以在基層及現(xiàn)場快速診斷中大規(guī)模推廣應(yīng)用[15,16]。LAMP是由日本榮研化學(xué)株式會社Notomi等[17]在2000年研發(fā)出的一種新型的能夠在體外進行恒溫擴增核酸片段的技術(shù), 該技術(shù)根據(jù)靶基因序列的6個或8個位置區(qū)域, 設(shè)計出4種或6種具有特異性的引物, 然后在DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)催化作用下恒溫持續(xù)數(shù)10 min, 完成核酸的擴增檢測, 不需要復(fù)雜的溫度循環(huán)過程, 與PCR法相比節(jié)省了大量的時間、降低了檢測成本, 適合于病原微生物的現(xiàn)場快速檢測和基層普及應(yīng)用[18,19]。

CCV基因組中磷酸激酶蛋白編碼基因(ORF77)序列與其他魚類皰疹病毒基因序列相似性較低,本研究建立的實時熒光LAMP檢測CCV的方法針對ORF77靶基因保守區(qū)域設(shè)計了6條引物, 能特異性識別靶基因上的8個獨立區(qū)域, 在恒溫反應(yīng)35min后即可完成靶基因檢測, 最低檢測線可達100個DNA拷貝(圖 1)。Liu等[13]利用凝膠電泳進行LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測, 結(jié)果顯示其能夠檢測到10?9稀釋的病毒DNA; 本研究建立的實時熒光LAMP檢測方法與6種常見水生動物病原DNA均無交叉反應(yīng)(圖 2和圖 4); 同一樣品于組內(nèi)或組間重復(fù)性試驗發(fā)現(xiàn), 在同一DNA濃度下, 20個平行樣品的擴增曲線基本重合, 分別在反應(yīng)大約20min和35min出現(xiàn)明顯的峰值(圖 3)。因此, 本研究建立的方法具有反應(yīng)時間短、特異性強、靈敏度高和重復(fù)性好的特點。

目前國內(nèi)外常用的鑒定LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的方法為染料法、濁度法和凝膠電泳法[13,20,21]。本研究建立的實時熒光LAMP方法, 通過實時采集熒光信號對擴增過程進行及時判斷, 在保證高敏感性的同時, 使結(jié)果形象化和數(shù)據(jù)化, 不需要繁瑣的電泳和紫外觀察等過程, 又能避免開蓋而導(dǎo)致的污染,比傳統(tǒng)的利用染料法、濁度法和凝膠電泳法判斷反應(yīng)終點更加客觀可靠[22,23]。同時, 本研究使用SYTO-9作為LAMP反應(yīng)熒光顯色劑, 可以有效避免使用SYBR Green Ⅰ 作為LAMP反應(yīng)熒光顯色劑過于靈敏, 從而造成陰性反應(yīng)孔出現(xiàn)非特異性擴增曲線, 影響結(jié)果判斷[13,24]。此外, 本研究建立的方法擺脫了傳統(tǒng)檢測方法對昂貴儀器設(shè)備的依賴, 可使用便攜式儀器, 如ESE-Quant tube scanner等進行操作。由于其價格相對便宜, 體積較小, 便于攜帶, 節(jié)約了大量成本, 非常適合水產(chǎn)養(yǎng)殖現(xiàn)場檢測使用。

綜上所述, 本研究建立的CCV實時熒光LAMP檢測方法操作簡單、檢測快速、特異性好、靈敏度高、結(jié)果可靠, 能為斑點叉尾鮰養(yǎng)殖現(xiàn)場和實驗室的斑點叉尾鮰皰疹病毒病病原的快速診斷和實時監(jiān)測方面提供技術(shù)支撐。