唐 妮 田正志 李 婭 汪 斌 徐少奇 王 美 陳 虎 齊錦雯 王書(shū)瑤 趙柳蘭 陳德芳 李志瓊

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 成都 611130)

脂聯(lián)素(Adiponectin, AdipoQ)作為脂肪細(xì)胞因子之一, 能通過(guò)結(jié)合其受體發(fā)揮多種生物學(xué)功能,如調(diào)節(jié)攝食[1]、繁殖[2]、免疫[3,4]和糖脂代謝[5]等。2003年Yamauchi等[6]從人類(lèi)(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)上克隆得到AdipoR1和AdipoR2, 其包含7次跨膜結(jié)構(gòu)域, 與G蛋白偶聯(lián)受體相反, N端在細(xì)胞內(nèi)而C端在胞外。此后, 學(xué)者從哺乳動(dòng)物(豬[7]、山羊[8])和鳥(niǎo)類(lèi)(雞[9]、鵝[10])等克隆獲得AdipoR基因。然而, 關(guān)于魚(yú)類(lèi)脂聯(lián)素受體的報(bào)道相對(duì)較少。目前, 僅從部分硬骨魚(yú)中克隆獲得該基因,如斑馬魚(yú)(Brachydanio rerio var)[11]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[12]、斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)[13]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[14]、草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)[15]、青魚(yú)(Mylopharyngodon piceus)[16]和尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)[17]。此外, 在斑馬魚(yú)、虹鱒和斜帶石斑魚(yú)上, 脂聯(lián)素受體的表達(dá)受禁食的影響[11—13], 提示AdipoR可能參與調(diào)節(jié)機(jī)體維持能量穩(wěn)態(tài)的過(guò)程。

西伯利亞鱘(Acipenser baeri), 屬于輻鰭魚(yú)綱,鱘形目, 鱘科, 鱘屬, 作為一種亞冷水性魚(yú)類(lèi), 在全世界被廣泛養(yǎng)殖。西伯利亞鱘是一種古老的魚(yú)類(lèi),極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值。迄今為止, 尚未見(jiàn)西伯利亞鱘脂聯(lián)素受體基因的相關(guān)報(bào)道。本文通過(guò)克隆和RACE擴(kuò)增技術(shù)獲得西伯利亞鱘2種脂聯(lián)素受體基因的序列, 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time quantitative PCR, RT-qPCR)檢測(cè)AdipoR1和AdipoR2基因在組織中的表達(dá)情況, 及禁食復(fù)投喂對(duì)2種基因在肌肉中表達(dá)量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚(yú)本研究所用西伯利亞鱘幼魚(yú)購(gòu)于四川潤(rùn)兆鱘魚(yú)有限公司, 飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)系。飼養(yǎng)條件為12h∶12h光暗周期, 室溫控制在(20±1)℃。在暫養(yǎng)期間, 每天14:00按體重3%的比例飼喂1次, 每天換水2次(8:00和20:00)。飼料為鱘商業(yè)沉性顆粒飼料。

主要試劑和儀器總RNA提取試劑盒購(gòu)于成都福際有限公司, 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量MIX和pMD19-T載體購(gòu)于大連寶生物有限公司TaKaRa, DH5α感受態(tài)細(xì)胞和DNA片段膠回收試劑盒購(gòu)于TIANGEN, RACE試劑盒購(gòu)于Clontech公司。熒光定量?jī)x為Bio-rad CFX96, 核酸蛋白儀購(gòu)于Thermo公司。

1.2 RNA提取及cDNA第一鏈合成

按照TaKaRa RNAiso Plus Reagent說(shuō)明書(shū), 提取西伯利亞鱘組織的總RNA。用核酸測(cè)定儀和1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA的濃度和完整性檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR模版在cDNA合成前通過(guò)PrimeScript? RT reagent Kit(Perfect Real Time)去除基因組DNA污染, 根據(jù)TaKaRa試劑盒進(jìn)行熒光定量cDNA合成。采用Clontech公司的SMART RACE cDNA構(gòu)建試劑盒制備5′-RACE和3′-RACE -Ready cDNA。

1.3 基因克隆

參考GenBank公布的AdipoR1和AdipoR2的核苷酸序列, 利用DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)獲得同源片段。通過(guò)Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì), 包括克隆目的基因核心片段、3′RACE和5′RACE引物(表 1),由生工生物工程有限公司合成引物。

以西伯利亞鱘腦cDNA為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為10 μL, 包括: 5 μL PCR Master Mix、1 μL cDNA模板、上下游引物各0.5和3 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min, 35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%濃度的瓊脂糖凝膠電泳分析, 利用TIANGEN Midi DNA Purification Kit切膠回收目的條帶, 與pMD19-T載體于4℃過(guò)夜連接, 轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 菌液PCR篩選含目的片段菌液, 送生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)得到的核心片段和接頭應(yīng)物設(shè)計(jì)的特異性引物, 用SMART RACE cDNA試劑盒進(jìn)行5′端和3′端的RACE全長(zhǎng)的克隆。兩輪PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 退火45s, 72℃延伸1min, 34個(gè)循環(huán); 72℃延伸5min; 克隆后結(jié)果送于生工公司進(jìn)行測(cè)序。AdipoR1基因特異性退火溫度58.4℃,AdipoR2基因特異性退火溫度63.6℃。最后,將克隆所得目的基因核心序列與3′端和5′端序列進(jìn)行拼接, 獲得目的基因cDNA序列全長(zhǎng)。

表 1 引物序列及用途Tab. 1 Primers used for the study

1.4 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序所得的AdipoR1和AdipoR2 cDNA序列在NCBI上選擇BLAST工具(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源比對(duì), 用DNAStar查找ORF, 推導(dǎo)出氨基酸序列, 利用ClustalW(http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/clustalw-e.html)進(jìn)行多重序列比對(duì), 采用SignalIP 4.1 server(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè), 通過(guò)在線(xiàn)軟件TM-HMMServer v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行氨基酸序列的跨膜區(qū)預(yù)測(cè), 采用MEGA 5軟件, 用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 組織分布實(shí)驗(yàn)

選取6尾西伯利亞鱘(215.20±29.00) g禁食24h后, 通過(guò)MS-222麻醉后處死, 快速分離獲得22個(gè)組織, 包括5個(gè)不同腦區(qū)(前腦、中腦、下丘腦、小腦和延腦), 及17個(gè)外周組織(心、眼、食道、肌肉、胰、鰓、性腺、皮膚、瓣腸、直腸、鰾、腎、脾、十二指腸、幽門(mén)盲囊、肝和胃)。提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板, 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定AdipoR1及AdipoR2基因在各組織中的表達(dá)情況。

1.6 禁食復(fù)投喂實(shí)驗(yàn)

將27尾(29.45±2.84) g健康的西伯利亞鱘, 均勻放入9個(gè)魚(yú)缸, 每缸3尾魚(yú)。正式試驗(yàn)前進(jìn)行馴化,每天14:00投喂按體重3%進(jìn)行投喂, 馴化2周后開(kāi)始正式試驗(yàn)。將其分為3組, 即投喂組、禁食組和復(fù)投喂組。其中, 復(fù)投喂組在禁食第10天進(jìn)行復(fù)投喂。在第10天采集樣品, 采樣時(shí)間為14:30(即投喂后30min)。每組從對(duì)應(yīng)的3個(gè)缸中分別撈取2尾魚(yú),即每組6尾, 麻醉后處死, 采集背部白肌, 用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

通過(guò)Bio-Rad系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量分析。通過(guò)退火溫度摸索和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制, 分析融解曲線(xiàn)篩選獲得適宜的熒光定量引物(表 1)。AdipoR1和AdipoR2熒光定量引物擴(kuò)增效率分別為95.7%和98.2%。反應(yīng)體系為25 μL, 操作按照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒(SYBR?Premix ExTaqTMⅡ)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性1min; 95℃變性15s, 58.4℃退火15s, 72℃延伸45s, 44個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品重復(fù)3次。以β-actin作為內(nèi)參基因, 采用2-△△Ct法計(jì)算AdipoR1和AdipoR2相對(duì)表達(dá)量, ΔΔCt=(Ct目的基因–Ct內(nèi)參基因)–(Ct目標(biāo)基因參照–Ct內(nèi)參基因參照)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM),通過(guò)SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析, 運(yùn)用Duncan進(jìn)行多重比較,P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 AdipoR1和AdipoR2結(jié)構(gòu)分析

本研究通過(guò)RT-PCR和RACE方法克隆獲得了西伯利亞鱘AdipoR1(GenBank登錄號(hào): MT580287)和AdipoR2(GenBank登錄號(hào): MT580342)基因cDNA的完整序列。西鱘AdipoR1基因cDNA全長(zhǎng)為2013 bp, 包括5′-UTR(234 bp)、3′-UTR(633 bp)和開(kāi)放式閱讀框ORF(1146 bp), 編碼381個(gè)氨基酸。西伯利亞鱘AdipoR2 cDNA全長(zhǎng)為1590 bp, 包括329 bp的5′-UTR, 175 bp的3′-UTR和1086 bp的完整ORF,其編碼361個(gè)氨基酸。西伯利亞鱘AdipoR1和AdipoR2蛋白主要由N端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、HlyIII結(jié)構(gòu)域和C端胞外區(qū)域(359—381aa)組成。跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示, 西伯利亞鱘AdipoR1和AdipoR2均包含7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, N端在細(xì)胞膜內(nèi), C端在細(xì)胞膜外, 與G蛋白耦聯(lián)受體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相反。

2.2 序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示, 西伯利亞鱘AdipoR1與其他脊椎動(dòng)物氨基酸序列一致性較高,如人類(lèi)(81%)、蘇門(mén)答臘猩猩(Pongo abelii, 81%)、小鼠(82%)、原雞(Gallus gallus, 81%)、吐綬雞(Numida meleagris, 81%)、非洲爪蟾(Xenopus tropicalis, 80%)、高山倭蛙(Nanorana parkeri, 81%)、斑馬魚(yú)AdipoR1-A(82%)和AdipoR1-B(76%)、虹鱒(80%)和大菱鲆(87%)。此外, 西伯利亞鱘AdipoR2氨基酸一致性與斑點(diǎn)雀鱔最高為85%, 與哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和兩棲類(lèi)的一致性介于76%—78%, 與魚(yú)類(lèi)相比氨基酸一致性介于79%—81%。

聚類(lèi)分析結(jié)果顯示, 西伯利亞鱘AdipoR1、AdipoR2均與其他硬骨魚(yú)類(lèi)聚為一支, 而哺乳動(dòng)物(人類(lèi)、猩猩和小鼠)、鳥(niǎo)類(lèi)(原雞和吐綬雞)、兩棲類(lèi)(非洲爪蟾和高山倭蛙)聚為另一支(圖 1)。此外,遺傳距離分析結(jié)果顯示, 西伯利亞鱘AdipoR1與斑點(diǎn)雀鱔(Lepisosteus oculatus, 0.1226)距離最近, 與斑馬魚(yú)AdipoR1-B(0.2307)距離最遠(yuǎn)。西鱘AdipoR2與斑點(diǎn)雀鱔(0.1518)距離最近, 與高山倭蛙(0.2649)距離最遠(yuǎn)。

2.3 組織分布

AdipoR1和AdipoR2廣泛分布于西伯利亞鱘中樞和外周組織(圖 2)。其中,AdipoR1表達(dá)量最高的是中腦, 延腦、前腦、小腦和下丘腦次之, 肌肉中的表達(dá)量較低。西伯利亞鱘AdipoR2 mRNA在中腦表達(dá)最高, 鰓、瓣腸、性腺和延腦次之, 肌肉表達(dá)最低。

2.4 禁食和復(fù)投喂對(duì)肌肉中脂聯(lián)素受體表達(dá)的影響

在禁食10d后, 西伯利亞鱘肌肉AdipoR1表達(dá)量顯著上調(diào), 復(fù)投喂后AdipoR1表達(dá)顯著降低。在禁食10d時(shí), 肌肉AdipoR2表達(dá)量顯著升高, 而復(fù)投喂后AdipoR2 mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化(圖 3)。

3 討論

目前, 學(xué)者已從人和小鼠等哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和硬骨魚(yú)上克隆獲得脂聯(lián)素受體基因。其中, 在魚(yú)類(lèi)上的報(bào)道僅見(jiàn)斑馬魚(yú)[11]、虹鱒[12]、斜帶石斑魚(yú)[13]、大菱鲆[14]、草魚(yú)[15]、青魚(yú)[16]和尼羅羅非魚(yú)[17]。本研究通過(guò)克隆獲得2種西伯利亞鱘脂聯(lián)素受體, 即AdipoR1和AdipoR2。與本研究類(lèi)似, 虹鱒、斜帶石斑魚(yú)、大菱鲆和尼羅羅非魚(yú)AdipoR1僅鑒定出一種類(lèi)型。然而, 同屬于鯉形目的斑馬魚(yú)、草魚(yú)和青魚(yú)存在AdipoR1-A和AdipoR1-B。由上可知, 魚(yú)類(lèi)AdipoR1可能具有更多的亞型。與其他脊椎物種類(lèi)似, 西伯利亞鱘AdipoR1和AdipoR2主要由N端結(jié)構(gòu)域、HlyIII結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域組成, 并且N端在胞內(nèi), C端在胞外。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示魚(yú)類(lèi)AdipoR的N段結(jié)構(gòu)域氨基酸一致性較低, 提示該區(qū)域保守性較低。

在西伯利亞鱘上,AdipoR1和AdipoR2廣泛分布于中樞和外周組織中。在大鼠、豬、雞和其他硬骨魚(yú)上也觀察到類(lèi)似的結(jié)果。脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2 mRNA分布的廣泛性, 提示其可能在不同組織中參與調(diào)節(jié)不同的生理活動(dòng)。此外, 本研究發(fā)現(xiàn)AdipoR1和AdipoR2在西伯利亞鱘組織中的表達(dá)模式存在差異。例如, 西伯利亞鱘AdipoR1主要在大腦各區(qū)域中表達(dá)且高于外周組織,AdipoR2 mRNA主要在中腦表達(dá), 鰓和瓣腸次之。與之類(lèi)似,免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示, 在大鼠上,AdipoR1在大腦各區(qū)域廣泛分布,AdipoR2則在特定的腦區(qū)中表達(dá),如下丘腦、大腦皮層和海馬體[18]。然而, 在斑馬魚(yú)上,AdipoR1-A、AdipoR1-B和AdipoR2廣泛分布于腦、腸、肝、脂肪組織、腎和卵巢中, 并且3個(gè)受體基因組織表達(dá)模式類(lèi)似。本研究結(jié)果顯示,AdipoR1和AdipoR2 mRNA均在西伯利亞鱘中腦表達(dá)最高。盡管目前關(guān)于鱘魚(yú)中腦的功能研究較少,斑馬魚(yú)上的研究顯示中腦能整合多種感覺(jué), 與感光、游泳和捕食等反應(yīng)密切相關(guān)[19]。因此, 我們推測(cè)AdipoR可能與這些功能密相關(guān), 但有待進(jìn)一步探究。此外, 其他物種上的研究顯示AdipoR1和AdipoR2高表達(dá)的組織存在差異。例如, 在豬和雞上,AdipoR1 mRNA骨骼肌表達(dá)豐富,AdipoR2 mRNA在脂肪組織中高表達(dá)[9]。然而, 在硬骨魚(yú)上,AdipoR1和AdipoR2高表達(dá)的組織差異較大。例如,AdipoR1 mRNA在虹鱒脾臟[12]、斜帶石斑魚(yú)端腦[13]、草魚(yú)和青魚(yú)肝臟[15,16]和大菱鲆的鰓組織中[20]豐富表達(dá)。AdipoR2 mRNA表達(dá)量在虹鱒近側(cè)小腸、斜帶石斑魚(yú)性腺和大菱鲆腸道中較高。此外, 西伯利亞鱘AdipoR1和AdipoR2在肌肉中表達(dá)較低。與本研究類(lèi)似,AdipoR1在虹鱒、斜帶石斑魚(yú)、大菱鲆和尼羅羅非魚(yú)白肌中表達(dá)較低,AdipoR2在大菱鲆和雌性尼羅羅非魚(yú)肌肉中表達(dá)也是最低[17]。以上研究結(jié)果顯示, 哺乳動(dòng)物AdipoR1可能主要參與肌肉能量代謝過(guò)程, 而魚(yú)類(lèi)AdipoR1可能具有獨(dú)特的生物學(xué)作用?？偟膩?lái)說(shuō),AdipoR1和AdipoR2基因廣泛分布于多組織中, 提示其可能具有多種生物學(xué)功能, 并且其生物學(xué)功能存在物種差異。

圖 1 AdipoR1和AdipoR2氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 1 Phylogenetic tree of amino acid sequences of AdipoR1 and AdipoR2

圖 2 西伯利亞鱘AdipoR1(A)和AdipoR2(B)組織分布Fig. 2 Tissue distribution of AdipoR1 (A) and AdipoR2 (B) in Siberian sturgeon

圖 3 禁食對(duì)西伯利亞鱘肌肉AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of fasting and refeeding on the expression of AdipoR1 and AdipoR2 mRNA in muscle of Siberian sturgeon

肌肉是魚(yú)類(lèi)受饑餓影響較大的組織之一。在禁食期間, 肌肉不僅能短期通過(guò)肌糖原供能, 還能通過(guò)脂質(zhì)和蛋白分解提供主要的能量[21]。在西伯利亞鱘幼魚(yú)中, 禁食10d后肌肉中AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá)量均顯著升高, 在復(fù)投喂后AdipoR1表達(dá)量顯著降低, 而AdipoR2 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著變化。在魚(yú)類(lèi)中, 有研究顯示饑餓能影響脂聯(lián)素受體基因的表達(dá)。與本研究結(jié)果類(lèi)似, 當(dāng)禁食25d或35d,虹鱒白肌AdipoR1和AdipoR2表達(dá)顯著升高[12]。在斜帶石斑魚(yú)中, 禁食7d顯著上調(diào)了肌肉中AdipoR1和AdipoR2表達(dá)量, 復(fù)投喂后降低[13]。在饑餓期間,適應(yīng)生理調(diào)節(jié)會(huì)影響?hù)~(yú)類(lèi)肌肉等組織并且快速引發(fā)糖、脂和蛋白代謝來(lái)維持能量穩(wěn)態(tài)。之前的研究顯示, 禁食10d后納氏鱘和虹鱒白肌中的糖原、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)含量均顯著降低[22]。由上可知, 魚(yú)類(lèi)AdipoR1和AdipoR2可能在白肌能量代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。此外, 在小鼠中, 禁食2d能顯著上調(diào)肌肉AdipoR1和AdipoR2表達(dá), 復(fù)投喂后其表達(dá)量顯著降低[23]。然而, 在幼豬中, 禁食1d不影響肌肉中AdipoR1和AdipoR2表達(dá)的變化[24]。這種差異可能與研究的物種及禁食的時(shí)間長(zhǎng)短等因素有關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō), 在西伯利亞鱘肌肉中, 脂聯(lián)素受體的表達(dá)受禁食的調(diào)節(jié), 并且這種作用在魚(yú)類(lèi)上相對(duì)保守, 提示脂聯(lián)素受體基因可能參與機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)維持過(guò)程。

總的來(lái)說(shuō), 本研究克隆獲得了西伯利亞鱘AdipoR1和AdipoR2的cDNA全長(zhǎng)序列, 并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。本研究通過(guò)分析西伯利亞鱘AdipoR1和AdipoR2 mRNA組織分布情況, 并且發(fā)現(xiàn)AdipoR1和AdipoR2廣泛分布于西伯利亞鱘組織中。此外, 本研究發(fā)現(xiàn)禁食能顯著上調(diào)肌肉AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達(dá), 提示AdipoR1及AdipoR2可能參與脂聯(lián)素能量代謝的調(diào)節(jié)。本研究為后續(xù)深入開(kāi)展脂聯(lián)素及其受體在西伯利亞鱘能量代謝和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的作用提供了理論基礎(chǔ)。