劉鳳飛，唐岳

（1.安?？h農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西吉安343200；2.永新縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

仔豬腹瀉一直是造成養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益下降的多發(fā)性疾病，仔豬死亡率高且耐過豬生長發(fā)育受阻，并影響其肉質。仔豬腹瀉的病因多種多樣，可由各種細菌、寄生蟲、病毒引起，大多數(shù)規(guī)?；i場雖然有合理的免疫及驅蟲程序，同樣也有優(yōu)質的飼料供應，但仔豬腹瀉的情況仍然時有發(fā)生，這是多種致病因素綜合作用的結果[1]。因此對不同的豬場的仔豬腹瀉病例進行綜合分析，提出相應的防治措施并落到實處才能有效預防此類疾病的發(fā)生。

在生產(chǎn)實踐中，大腸桿菌感染引起的仔豬腹瀉十分常見且多發(fā)。大部分大腸桿菌是動物腸道的正常菌群之一，動物剛出生時機體并沒有大腸桿菌，需經(jīng)過一段時間，經(jīng)口進入動物消化道定居并可通過糞便長期排出體外，但也有部分特殊血清型的大腸桿菌具有致病性，對人及多種動物有較強的致病力[2]，如腸產(chǎn)毒素型大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌等。大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽胞的直桿菌，兩端鈍圓，大多菌株以周生鞭毛運動?？稍谄胀ㄅ囵B(yǎng)基上生長良好，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色菌落，在伊紅美藍培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）上形成黑色帶金屬光澤的菌落，這是大腸桿菌區(qū)別于其他桿菌的標志性現(xiàn)象[3]。

本實驗在排除免疫失敗、寄生蟲、仔豬流行性腹瀉病毒等致仔豬腹瀉的病因后，用接種環(huán)刮取了病豬腸黏膜，接種于EMB培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了24 h，結果在EMB培養(yǎng)基上觀察到了多量較單一的光滑型，黑色帶金屬光澤的菌落。繼而將菌落制備細菌涂片，干燥，染色，鏡檢為革蘭氏陰性球菌。因此高度懷疑某豬場仔菌腹瀉是由大腸桿菌感染引起。

近年來，國內(nèi)養(yǎng)殖場濫用抗生素現(xiàn)象十分嚴重，導致大腸桿菌的耐藥譜不斷擴大，為有效選取該豬場大腸桿菌敏感的抗生素，最后進行了藥敏試驗。結果顯示該分離細菌對丁胺卡那（阿米卡星）敏感，對環(huán)丙沙星中度敏感，而對頭孢曲松、卡那霉素、新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素、氟苯尼考、阿奇霉素、林可霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑、氨芐西林鈉耐藥。臨床上應根據(jù)實際情況選取大腸桿菌敏感的藥物以達到良好的治療效果。并對豬場的管理進行評估，以尋找改善豬場環(huán)境衛(wèi)生和飼養(yǎng)管理的方案以預防此類疾病再度發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病料。病死仔豬采集小腸腸道；存活腹瀉仔豬，采集新鮮糞便；30份血樣：1～24號采自母豬，25～30號采自保育仔豬，每份2～3mL，保鮮保存。

1.1.2 試劑。培養(yǎng)皿、接種環(huán)、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、載玻片、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）、藥敏紙片（丁胺卡那、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢曲松、卡那霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑耐藥等抗菌藥敏紙片）、革蘭氏染液、生理鹽水。

1.1.3 相關設備。PCR儀、生化培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器、顯微鏡、酶標儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗體水平檢測。將送檢30份血樣，離心提取血清，采用ELISA法分別檢測其豬瘟抗體、豬偽狂犬gB抗體和gE抗體（野毒抗體）、藍耳病毒抗體、圓環(huán)2型病毒抗體，并記錄結果。其判斷標準如下：

（1）豬瘟抗體（阻斷ELISA法，美國IDEXX：99-43220-M301）判斷標準：阻斷率≥40%為合格（＋），阻斷率≤30%為不合格（－），阻斷率在30%～40%間為可疑（±）。

（2）豬偽狂犬（gB）總抗體（競爭ELISA法，美國IDEXX：09732-EP237）判斷標準：S/N值≤0.6為陽性（＋），S/N值≥0.7為陰性（－），S/N值在0.6～0.7之間為可疑（±）。

（3）豬偽狂犬（gE）野毒抗體（競爭ELISA法，美國IDEXX：09836-HP871）判斷標準：S/N值≤0.6為陽性（＋），S/N值＞0.7為陰性（－），S/N值在0.6～0.7之間為可疑（±）。

（4）藍耳抗體（間接ELISA法，美國IDEXX：40959-L481）判斷標準：S/P值≥0.4為陽性（＋），S/P值＜0.4為陰性（－）。

（5）豬圓環(huán)抗體（ELISA，深圳芬德：19007）判斷標準：OD值≥0.38為陽性，OD值在0.2～0.38之間為可疑（±），OD值＜0.2為陰性。

1.2.2 仔豬糞便球蟲檢測。采集病豬腸道內(nèi)容物及糞便，采用飽和鹽水漂浮法，具體步驟如下：取5g豬腸道內(nèi)容物及糞便放入盛有100mL生理鹽水的燒杯中，用玻璃棒順著同一個方向攪拌均勻后，用紗布過濾糞液到另一個燒杯中，棄去糞渣，水平靜置過濾液30min左右，然后用0.5cm的金屬圈水平接觸液面，提起后將采集到的濾液涂抹于載玻片上，壓上載玻片后鏡檢，并將鏡檢結果拍下記錄。

1.2.3 細菌分離。采集病豬腸道，無菌操作剪開腸管，于無菌生理鹽水中充分洗滌，用接種環(huán)刮取腸黏膜，劃線接種于EMB培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基置37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.2.4 分離菌染色鏡檢。取少量生理鹽水滴于載玻片中央，接種環(huán)嚴格滅菌后冷卻一段時間，挑取培養(yǎng)24 h后的EMB培養(yǎng)基上光滑、邊緣整齊、黑色帶金屬光澤的單個菌落后，與載玻片上的生理鹽水均勻混合涂布成適當大小的薄層。運用革蘭氏染色法進行染色，其步驟如下：

(1)草酸銨結晶紫初染1min。

(2)將載玻片拿到水龍頭下，用較緩水流洗去浮色。

(3)用碘-碘化鉀溶液媒染1min，傾去多余溶液。

(4)乙醇(95%)脫色至無染液浮出為止。

(5)用沙黃復染30 s，傾去多余溶液。若是革蘭氏陽性菌則呈現(xiàn)藍色，若是革蘭氏陰性菌則呈現(xiàn)紅色。

1.2.5 藥物敏感試驗。采用藥敏紙片擴散法，用接種環(huán)挑取EMB培養(yǎng)基上的單個菌落懸于3mL生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁，調(diào)整濁度與比濁管相同。用無菌棉拭子蘸取菌液，擠掉多余菌液均勻涂布于整個瓊脂培養(yǎng)基表面，可反復操作至確認菌液全面均勻覆蓋瓊脂培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基上的水分被瓊脂充分吸收后，用無菌鑷子夾起藥敏試紙，貼在培養(yǎng)皿表面，試紙一旦接觸到瓊脂表面就不可再次夾起，每個培養(yǎng)基貼7張藥敏紙片，各個紙片之間保持適當且一致的距離。將平板反轉放置于恒溫箱中，在適宜的溫度下培養(yǎng)24 h后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑并記錄結果。（判斷標準見表1[5]

表1 藥敏試驗判斷標準

1.2.6 仔豬流行性腹瀉病毒基因檢測。采集病仔豬腸、脾臟等病料，運用RT-PCR的檢測方法，通過設計豬流行性腹瀉病毒的特異性檢測引物，提取病料中的總RNA，在50℃30min;95℃5 min;95℃40～60 s，55℃40～90 s，72℃1～5.5 min的條件下，循環(huán)35次;再在72℃的溫度下延伸10 min，對提取到的基因組進行RT-PCR擴增，然后取出5μL擴增產(chǎn)物，加1μL 6×上樣緩沖液，10 g/L瓊脂糖凝膠、120 V電壓45 min，電泳檢測，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增片段[4]。

2 結果與分析

2.1 抗體水平檢測結果。送檢30份血樣抗體水平檢測結果見下表2。

檢測結果顯示：豬瘟抗體合格率93.33%、平均阻斷率73.27%、離散度25.57%；偽狂總抗體合格率100%，偽狂野毒抗體陽性率為0，可疑6.67%；藍耳抗體陽性率93.33%、離散度46.81%、其中有16頭S/P值≥2.5；豬圓環(huán)抗體陽性率76.67%、離散度51.27%。

表2 血樣抗體水平檢測結果

說明：豬群豬瘟抗體水平較好；偽狂犬總抗體水平高、未檢出偽狂野毒抗體，但有2頭可疑；藍耳病毒抗體水平高、整齊度一般；圓環(huán)2型病毒抗體一般。

2.2 仔豬糞便球蟲檢測結果

樣品1（如圖1）和樣品2（圖2）均未發(fā)現(xiàn)球蟲等腸道寄生蟲蟲卵及卵囊，球蟲檢測陰性（-）。

圖1、圖2 糞便樣品寄生蟲檢測結果

2.3 細菌分離鑒定結果

培養(yǎng)結果如圖3和圖4，可見EMB培養(yǎng)基上，有多量較單一的光滑型，黑色帶金屬光澤菌落。

菌落制備細菌涂片，干燥，染色，鏡檢為革蘭氏陰性球桿菌（圖5、圖6），可疑大腸桿菌。

圖3、圖4 細菌分離結果

2.4 藥物敏感試驗結果

培養(yǎng)結果如圖7。該分離細菌對丁胺卡那（阿米卡星）敏感，對環(huán)丙沙星中度敏感，對頭孢曲松、卡那霉素、氨芐西林、新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素、林可霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑耐藥。藥敏試驗結果見表3。

圖5、圖6 細菌染色鏡檢結果

圖7 細菌藥敏試驗結果

表3 藥敏試驗結果判斷 mm

2.5 病毒基因檢測結果

送檢2個樣品，經(jīng)RT-PCR擴增，均未擴增出特異性病毒基因片段（見圖8），豬流行性腹瀉病毒檢測陰性（-）。

3 分析與討論

腸產(chǎn)毒型大腸桿菌是引起豬場仔豬腹瀉主要的病原微生物之一，常使仔豬發(fā)育遲緩，生產(chǎn)性能降低，嚴重的可導致死亡，給養(yǎng)殖場造成很大的經(jīng)濟損失。初生仔豬與早期斷奶仔豬免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全或斷奶導致的免疫抑制等造成仔豬對大腸桿菌的敏感性增高，抵抗力下降，從而引發(fā)大腸桿菌性腹瀉[6]。

3.1 關于病因的討論

根據(jù)采集到的30份血樣進行了抗原抗體檢測，結果顯示：豬群豬瘟抗體水平較好；偽狂犬總抗體水平高、未檢出偽狂野毒抗體，但有2頭可疑；藍耳抗體水平高、整齊度一般；圓環(huán)病毒抗體一般。說明該豬場比較注重病毒性傳染病的免疫，但是卻忽視了豬群中細菌性傳染病的預防。該豬場仔豬發(fā)病時間在三月，正值低溫高濕的季節(jié)，若不采取豬場的保溫措施，仔豬的自身抵抗力將下降，腸道內(nèi)的致病性大腸桿菌往往會大量繁殖，引發(fā)大腸桿菌病[7]。

圖8 病毒基因擴增結果

3.2 關于大腸桿菌的致病機理的討論

腸產(chǎn)毒型大腸桿菌可通過口腔進入易感宿主小腸，其菌毛黏附素與小腸上皮細胞的微絨毛和細胞表面的受體相結合，從而在腸內(nèi)定居繁殖，同時產(chǎn)生并釋放腸毒素，對仔豬腸道內(nèi)靶細胞產(chǎn)生毒性作用。其中不耐熱腸毒素（LT)可活化胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶，導致cAMP濃度升高，耐熱腸毒素（ST)可激活腸黏膜上皮細胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，使胞內(nèi)cGMP濃度升高，引起一系列級聯(lián)激活反應，最終使Cl-和HCO3-大量分泌，而Na+的吸收受到抑制，腸內(nèi)水和電解質大量蓄積而使?jié)B透壓升高，進而引起水樣腹瀉[8]。

3.3 關于治療方面的討論

根據(jù)實驗室檢測結果可以初步確定是大腸桿菌性腹瀉，再結合藥敏試驗結果，應采取以下治療措施。

3.3.1 打掃豬舍并消毒。清理豬舍中殘留的糞便，并使用環(huán)境消毒劑對豬舍進行全面的消毒。保持豬體干燥潔凈，必要時可用干燥消毒粉帶豬消毒，給豬群營造衛(wèi)生的生長環(huán)境。

3.3.2 抗生素治療。輕度腹瀉的仔豬可早晚按體重口服環(huán)丙沙星口服液，連用3d，觀察治療效果。重度腹瀉仔豬肌肉早晚按體重注射阿米卡星，連用3d，觀察治療效果。

3.3.3 對癥治療。對脫水的仔豬采取補液治療：輕度脫水可早晚按體重口服氨基酸維生素，在仔豬的飲水中添加補液鹽，連用2～3d。中度脫水可早晚按體重在病豬腹腔豬舍10%葡萄糖生理鹽水[9]。

3.4 關于預防方面的討論。

致病性大腸桿菌除了可以通過糞便、被污染的飼料和飲水侵襲仔豬外，還可通過帶菌母豬的胎盤和乳汁傳染給仔豬，所以做好懷孕母豬的保健和環(huán)境消毒十分重要。應改善母豬的飼料質量，使母豬膘情良好。臨產(chǎn)前一個月接種大腸桿菌k88、k99進行免疫[10]。在轉入分娩舍前5天，母豬應做好清潔和全面消毒的工作。轉入分娩舍后應清洗消毒欄舍，避免產(chǎn)房污染。母豬在生產(chǎn)時先用0.1%高錳酸鉀溶液擦拭乳房、會陰等部位，同時擠去可能受到污染的乳汁3～4滴[8]，切斷母豬將致病性大腸桿菌傳給仔豬的途徑。

在飼養(yǎng)管理方面，在仔豬出生后應保持欄舍中的衛(wèi)生，定期消毒，并注意仔豬的保暖，防止仔豬因寒冷而導致自身免疫力下降。對斷奶仔豬，要盡量減少諸如寒冷、環(huán)境、混群、運輸?shù)仍斐傻膽?。此外還需定期對豬群進行全面的檢疫，淘汰、隔離患病豬，以控制不同血清型的大腸桿菌進入豬群。關注哺乳母豬的泌乳情況，定期抽檢乳汁，對泌乳少的母豬，應增加其飼喂次數(shù)或改善飼料水平。淘汰因種用時間長而產(chǎn)弱仔、泌乳少的母豬。

在豬群免疫方面，應注意注射疫苗時杜絕多頭豬共用一個針頭注射的情況。初生仔豬需在出生后4 h之內(nèi)飼喂初乳，增加其體內(nèi)的抗體水平，增強其免疫力[11]。

4 小結

仔豬腹瀉的病例在養(yǎng)殖場中發(fā)病率較高，是危害養(yǎng)殖業(yè)的一類可由多種因素綜合作用造成的疾病。本文主要針對吉安某豬場發(fā)生的仔豬腹瀉病例，進行了一系列的實驗室診斷措施，尋找其發(fā)病原因并結合藥敏試驗結果提出相應的治療和預防措施，以期能降低該養(yǎng)殖場的仔豬腹瀉的發(fā)病率并為其他養(yǎng)殖場提供相應的參考。