肖童，魏黃思梧，劉昌錦，林敏，劉小蘭，胡換儀，鄧舜洲

（江西農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，江西南昌330045）

豬增生性腸炎(porcine proliferative enteropathy,PPE)是由胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)感染引起的一種以回腸和結腸隱窩內(nèi)未成熟的腸細胞發(fā)生腺瘤樣增生為特征的豬腸道傳染病。該病能夠引起保育豬和育肥豬不用程度的出血性或間歇性腹瀉、消瘦、生長緩慢等癥狀。胞內(nèi)勞森菌屬于脫硫弧菌科勞森菌屬的革蘭氏陰性菌，早在1931年就有報道，曾被稱為彎曲菌樣微生物（CLO）[1]，患病豬日增重減少，飼料轉(zhuǎn)化率低，嚴重可導致死亡，對世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。胞內(nèi)勞森菌在臨床上主要表現(xiàn)為豬腸腺瘤病(PIA)和豬增生性腸病(PPE)，其嚴重程度、臨床癥狀與受感染動物的年齡相關[3]。2020年7月份江西省某豬場出現(xiàn)疑似胞內(nèi)勞森菌的病例，對其進行臨床解剖和實驗室診斷，確診為胞內(nèi)勞森菌感染。并對該區(qū)域的其他7個豬場進行熒光定量PCR檢測，查看該區(qū)域豬群的感染情況。

1 臨床癥狀

2020年7月份江西省某豬場肥豬采食正常，但生長緩慢、體型瘦小，部分豬出現(xiàn)排黑色柏油狀稀糞便癥狀（圖1），體表蒼白，未出現(xiàn)死亡病豬。

圖1 血便

圖2 回腸黏膜增厚

2 病理解剖

對病豬解剖發(fā)現(xiàn)回腸黏膜增厚，出現(xiàn)隆起（圖2），并呈現(xiàn)特征性分支狀皺褶，表面濕潤而無粘液。

3 實驗室診斷

3.1 PCR檢測

按照Ezup動物基因組DNA提取試劑盒方法提取DNA,用普通PCR方法進行檢測。1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示，擴增出了581 bp左右的單一條帶。將測序結果在NCBI上通過BLAST在線工具進行比對，通過DNA STAR軟件對比對結果序列進行分析，結果顯示測序菌株（CEXU）與胞內(nèi)勞森菌參考序列（AM180252.1和CP004029.1）同源性為100%，且處于進化樹同一分支（圖4）。

圖3 PCR檢測結果

圖4 序列系統(tǒng)進化樹分析結果

3.2 熒光定量PCR檢測

使用賽默飛VetMAXTML.intracellularis Kit對提取的核酸進行熒光定量PCR檢測。結果顯示，樣品胞內(nèi)勞森菌陽性。

4 診斷

通過臨床診斷及病理解剖，初步診斷為胞內(nèi)勞森菌感染。經(jīng)過普通PCR檢測，結果顯示樣品DNA和胞內(nèi)勞森菌疫苗均出現(xiàn)581 bp左右大小的目的條帶，而陰性對照沒有條帶；序列分析其與胞內(nèi)勞森菌參考序列（AM180252.1和CP004029.1）同源性為100%；又經(jīng)熒光定量PCR檢測為陽性。因此，上述病例可確診為胞內(nèi)勞森菌感染。

5 豬胞內(nèi)勞森菌在豬群中的感染調(diào)查結果

通過對7個豬場的326份糞便樣品進行熒光定量PCR檢測，結果如表1所示：不同豬場的陽性檢出率區(qū)間為16.67%～40.00%，其中225頭母豬陽性檢出率為29.33%，82頭保育豬陽性檢出率為35.37%，17頭育肥豬陽性檢出率為17.65%，2頭種公豬陽性檢出率為0%，平均陽性檢出率為30.06%。

表1 豬胞內(nèi)勞森菌在豬群中的感染調(diào)查結果份、%

6 討論

由于該病的病原胞內(nèi)勞森菌屬專性胞內(nèi)細菌，其分離和培養(yǎng)方法都不完善，并且該病經(jīng)常呈亞臨床癥狀，養(yǎng)殖者對其的重視程度不高，這在很大程度上影響了對豬增生性腸炎的診斷與防治。本研究通過對患病豬進行臨床診斷和實驗室檢測，確診為胞內(nèi)勞森菌感染。后續(xù)對該地區(qū)7個豬場進行隨機采樣，通過熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率達30.06%,表明胞內(nèi)勞森菌在該地區(qū)存在流行性。

普通PCR在應用于明顯患病動物的組織樣品或糞便時具有良好的靈敏度，但檢測亞臨床癥狀的豬糞便往往會出現(xiàn)陰性結果[4]，本實驗使用賽默飛熒光定量檢測試劑進行熒光定量PCR檢測，準確性和陽性檢出率更高。彭忠等建立一種套氏PCR方法檢測糞便中的胞內(nèi)勞森菌[5]，對1 000多份糞便樣品進行檢測，其結果表明該方法相較于普通PCR方法有較高的靈敏度和良好的特異性。劉立兵等建立胞內(nèi)勞森菌實時熒光RPA方法[6]，能夠有效快速的應用于豬增生性腸炎的檢測，因此一種靈敏度高的檢測方法對于未來養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展是必要的。

隨著一些歐洲國家對抗菌藥物的限制使用，增生性腸炎已經(jīng)成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一[7]。中國作為養(yǎng)豬大國，雖然抗菌藥物對豬增生性腸炎的治療有作用，但抗菌藥物的頻繁使用會導致勞森菌產(chǎn)生耐藥性，因此提前完善養(yǎng)豬行業(yè)的管理措施和消毒措施、對養(yǎng)殖人員進行知識培訓、推動疫苗和營養(yǎng)添加劑的使用能夠有效地減少勞森菌對養(yǎng)豬行業(yè)的影響[8]。市場上使用的豬增生性腸炎菌苗有Intervet(荷蘭英特威)公司肌肉注射滅活苗和Oehringer Ingelheim(德國勃林格殷格翰)公司口服無毒活苗，能有效阻止其在宿主體內(nèi)引起病變，對于胞內(nèi)勞森菌的增殖有一定的抑制作用[9]。WHITNEY等研究表明飼料中添加含有可溶物和大豆皮的酒糟干[10]，能夠輕微的減輕胞內(nèi)勞森菌的感染。LEITE等研究表明飼料中鋅氨基酸復合物的添加也可以顯著減少由勞森菌引起的感染和損傷程度[11]。

胞內(nèi)勞森菌作為一種嚴重影響?zhàn)B殖效益的胞內(nèi)寄生菌，建立一套高效可行的檢測方法是非常必要的，本實驗通過對胞內(nèi)勞森菌進行熒光定量PCR檢測，準確性高、檢測效率高，比常規(guī)檢測方法更具有優(yōu)勢，為今后該病的檢測診斷提供理論基礎。